一种微孔芯片与单细胞分析方法与流程

本技术涉及基因测序，特别是涉及一种微孔芯片与单细胞分析方法。

背景技术：

1、单细胞测序主要是依靠微流控或微孔系统，将单个细胞锁定到单独的反应空间，随后进行二代测序文库的构建，实现一次实验能得到几千到上万的细胞。以10×的微流控平台为例，当细胞投入量超过推荐上样量时，会出现一个液滴内同时存在两个甚至两个以上细胞的情况，导致同一液滴内的多个细胞无法在后续分析中被区分开来。基于此，为了控制每个液滴内只有一个细胞，必须严格控制细胞的上样浓度，但是这样又会造成大部分液滴内没有细胞，形成“空载”，大大降低了实验通量以及细胞利用率。同时以微流控为基础的测序平台细胞并不是平行进行实验的，批次效应问题比较显著，且存在设备昂贵、不易携带、测序成本高等缺点。

2、现有技术中，微孔单细胞测序方法的原理一般都是利用重力沉降捕获单个细胞与单个微珠到微孔内，微孔重力沉降的泊松分布特性使细胞的检测效率受到限制。部分数字pcr系统所采用的双通微孔阵列芯片基于毛细作用的液体吸收特性，能够规避重力沉降和泊松分布带来的低效性问题，但数字pcr系统使用的双通微孔阵列芯片的厚度与材料均不宜于直接应用到单细胞组学方法中，并且均匀的液体毛细作用会让微孔中含有多个微珠或多个细胞，无法直接进行单细胞分辨率组学数据的解析。

技术实现思路

1、基于此，有必要提供一种微孔芯片与单细胞分析方法。本发明的单细胞分析方法能够应用于高通量单细胞多组学测序，能够一次性批量获得数十多万至上百万个单细胞的全长转录组、表观基因组、蛋白组等特异性组学信息。本发明的单细胞分析方法能适用于新鲜、冷冻或包埋组织，不受细胞活性与状态的限制。

2、本技术一实施例提供了一种微孔芯片。

3、一种微孔芯片，所述微孔芯片上具有若干个双通穿透型微孔，所述微孔内用于加载待测样本的单细胞悬液或单细胞核悬液与带有已知碱基序列核酸分子的微珠。

4、在其中一些实施例中，所述微孔芯片还满足下述条件中的至少一种：

5、(1)所述微孔的形状包括圆形、椭圆形、多边形中的一种或几种；

6、(2)所述微孔的孔径为10μm～1mm，优选地，所述微孔的孔径为20μm～100μm；

7、(3)所述微孔芯片整体上呈圆形、梯形或者矩形；

8、(4)所述微孔芯片的材质包括玻璃纤维、高分子聚合物、硅片中的任意一种；

9、(5)所述微孔芯片配套加载的微珠包括：聚合物微珠、磁性微珠、水凝胶微珠以及可降解聚合物微珠的任意一种；

10、(6)所述微孔芯片的外表面进行疏水处理，所述微孔的内壁进行亲水处理。

11、本技术一实施例还提供了一种单细胞分析方法。

12、一种单细胞分析方法，使用所述微孔芯片，包括如下步骤：

13、s1、将待测组织样本的单细胞悬液或单细胞核悬液与带有已知碱基序列核酸分子的微珠混合后加载到微孔芯片的微孔内；

14、s2、对s1中的所述微孔芯片进行核酸分子聚合与扩增，构建单细胞测序文库。

15、在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤s1中，还包括如下步骤：使用固定液对单细胞悬液或单细胞核悬液中的单细胞或细胞核进行固定处理。

16、在其中一些实施例中，所述固定液包括醛类固定液、醇类固定液、酸类固定液中的一种或几种。

17、在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤s1中，所述微孔芯片上的不同的所述微孔内加载有不同的待测样本。

18、在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤s1中，所述微珠上的已知碱基序列核酸分子与单细胞或单细胞核杂交结合时，单细胞或单细胞核内的原位标记对象为rna或者dna，对应地，所述微珠上的已知碱基序列核酸分子包括核酸；

19、或者，单细胞或单细胞核内的原位标记对象为蛋白，对应地，所述微珠上的已知碱基序列核酸分子包括修饰在抗体上的核酸。

20、在其中一些实施例中，单细胞或单细胞核内的原位标记对象为rna或蛋白时，所述微珠上的已知碱基序列核酸分子为已知碱基序列的单链寡核苷酸；单细胞或单细胞核内的原位标记对象为dna时，所述微珠上的已知碱基序列核酸分子为已知碱基序列的转座酶接头序列。

21、在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤s1中，所述微珠上的已知碱基序列核酸分子上包括条件性可断裂位点，其中，所述条件性可断裂位点包括：du碱基修饰、二硫键修饰、光敏断裂photocleavable linker以及限制性内切酶识别序列中的任意一种；

22、和/或，所述微珠与已知碱基序列核酸分子直接偶联的方式包括：基于羧基氨基的缩合酰化反应、基于biotin生物素及链霉亲和素的交联反应、酯键连接、二硫键连接、偶极相互作用中的任意一种。

23、在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤s1中，将待测组织样本的单细胞悬液或单细胞核悬液与带有已知碱基序列核酸分子的微珠加载到微孔芯片的微孔内时，包括如下步骤：将待测组织样本的单细胞悬液或单细胞核悬液与带有已知碱基序列核酸分子的微珠通过毛细作用随着微孔芯片表面液体吸附到所述微孔中，其中，每个所述微孔内能够容纳多个微珠。

24、在其中一些实施例中，步骤s1中，待测组织样本的单细胞悬液或单细胞核悬液通过如下步骤获得：将待测样本的细胞系经过裂解液进行裂解反应，裂解预定时间后终止裂解，获得待测样本的单细胞核。

25、在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤s2中，对s1中的所述微孔芯片进行核酸分子聚合与扩增时，扩增方法包括多步pcr扩增法与多步连接酶连接法中的任意一种。

26、在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤s2中，扩增方法包括split-pool分段式pcr杂交延伸扩增和split-pool分段式连接酶连接延伸。

27、在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤s2中，待测组织样本的单细胞悬液或单细胞核悬液与带有已知碱基序列核酸分子的微珠加载到芯片之后，通过自然蒸发或者抽真空蒸发方式促进微孔芯片表面液体的蒸发。

28、在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤s2中，对s1中的所述微孔芯片进行核酸分子聚合与扩增时，包括如下步骤：对微孔芯片采用密封油进行封闭，通过恒温加热使单细胞或单细胞核内的原位标记对象释放出来，以与所述微珠上的已知碱基序列核酸分子杂交反应。

29、在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的步骤s2中，扩增方法包括指数pcr扩增与线性pcr扩增的任意一种。

30、在其中一些实施例中，所述单细胞分析方法的所述单细胞测序文库包括单细胞转录组数据和/或染色质可及性基因组数据。

31、在其中一些实施例中，所述的单细胞分析方法还包括如下步骤：s3、对所述单细胞测序文库进行测序。

32、上述的微孔芯片能够应用于高通量单细胞多组学测序中，可提供高通量平行的单细胞测序，对设备要求简单、操作流程简便、易于携带。

33、上述单细胞分析方法中，通过在单细胞或单细胞核的原位标记对象上引入第一段细胞身份标签，将至少一个微珠和至少一个单细胞或单细胞核加载到微孔芯片，并使其通过毛细作用被均匀快速吸入到微孔芯片的微孔内，将微珠上的第二段细胞身份标签结合到单细胞或单细胞核的核酸中，进行核酸聚合与扩增反应。在微珠与单细胞或单细胞核加载到微孔芯片之后，可以通过自然蒸发、抽真空蒸发等方式促进微孔芯片表面液体的蒸发，从而添加新的反应试剂实现便捷的微孔内的多轮反应，同时使微孔间的反应隔间更加独立，减少分子污染。