一种Fe3O4@C-NFs复合材料及使用该复合材料利用UPLC-MS/MS法痕量测定水产品中四种四环素类抗生素的方法与流程

本发明涉及四环素类抗生素检测，尤其是涉及一种fe3o4@c-nfs复合材料及使用该复合材料利用uplc-ms/ms法痕量测定水产品中四种四环素类抗生素的方法。

背景技术：

1、四环素类抗生素作为亲水性抗生素的典型代表，以抗菌谱广、水溶性好、成本低等优点被广泛应用于畜牧业和水产养殖中，在防治细菌感染、促进生长等方面发挥着重要作用[3]。四环素类抗生素的毒理学研究表明，这些抗生素有相当严重的副作用，如腹部不适、上腹痛、恶心、呕吐和厌食、牙齿变色和抑制儿童骨骼生长。此外，四环素类抗生素进入环境后可能导致耐药菌的诱导和传播，对人类健康和生态环境构成长期的潜在威胁。

2、食品中四环素类抗生素的测定常用液相色谱联用uv、荧光和质谱(ms)。其中，超高效液相色谱串联质谱法(uplc-ms)在定量分析中以其分析时间短、灵敏度高、分离效率好等优点更具优势。同时，考虑到目标分析物的痕量水平和高水平的基质干扰，样品预处理也是准确测定的关键步骤。

3、固相萃取(spe)虽然具有比传统方法更好的萃取富集效果，但也存在成本高、易柱堵塞等缺点，尤其是对四环素而言。四环素类抗生素分子中含有亲水的羟基，易溶于水溶液等极性溶剂，较难溶于非极性的有机溶剂，且四环素类抗生素与蛋白质结合能力强，所以需用酸性脱蛋白剂从生物样品中提取。因此对于生物基质包括水产品中四环素类抗生素的提取多数研究均采用弱酸性的na2edta-mcllvaine缓冲溶液。na2edta的加入可以有效降低四环素类抗生素与金属离子的螯合作用，提高分析物提取效率。然而，na2edta-mcllvaine缓冲溶液不易沉淀蛋白质，提取液浑浊，脂肪等杂质含量多，不利于净化。混浊的萃取液在上spe柱前需要进行低温、高速离心和过滤等步骤，大大延长了预处理时间。

4、近年来，磁性固相萃取(mspe)作为一种很有前途的萃取方法受到了广泛的关注。mspe能够借助外部磁场在磁性吸附剂上吸附和解吸分析物，并且可以避免传统spe中出现的柱填料问题。然而，目前使用mspe测定四环素类抗生素的研究存在一定的局限性：首先，大多数合成工艺复杂，合成条件苛刻，并且使用昂贵、有毒的材料和溶剂，造成一定的环境污染；其次，mspe主要用于从水或牛奶中提取或富集四环素类抗生素，很少涉及水产品，水产品的复杂底物使mspe在水产品中的成功应用更具挑战性，目前尚未见到mspe应用在测定水产品中四环素类抗生素残留的报道。

技术实现思路

1、本发明的发明目的在于提供一种fe3o4@c-nfs复合材料，其制备成本低，具有较大的比表面积和均匀的孔半径分布，对四环素类抗生素选择性、吸附性能与洗脱性能好。

2、本发明的另一发明目的在于提供一种使用fe3o4@c-nfs复合材料利用uplc-ms/ms法痕量测定水产品中四种四环素类抗生素的方法，该方法简便、经济、灵敏，可满足水产品中痕量四环素类抗生素的检测要求。

3、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：本发明的一种fe3o4@c-nfs复合材料，所述fe3o4@c-nfs复合材料通过以下方法制得：将六水三氯化铁和乙酸钠分散在乙二醇和水的混合液中，将碳纳米纤维分散在乙二醇和水的混合液中，得分散液；将分散液放入不锈钢高压釜中进行加热反应，反应后冷却至室温，利用磁铁回收沉淀，将沉淀用去离子水和乙醇洗涤数次，真空干燥，即得fe3o4@c-nfs复合材料。

4、作为优选，所述六水三氯化铁加入量2.5g，所述乙酸钠加入量4.0g，乙二醇和水的混合液中，去离子水体积为25ml，乙二醇体积为50ml，碳纳米纤维加入量为0.5g；加热至180℃反应10h；70℃真空干燥。

5、作为优选，所述碳纳米纤维的直径为50～200nm，长度为1～15μm。

6、一种利用uplc-ms/ms法痕量测定水产品中四种四环素类抗生素的方法，包括以下步骤：

7、(1)制样

8、取水产品肌肉或可食用部分，切块后充分匀浆，取匀浆后2.00±0.01g的样品称重于50ml聚丙烯离心管中，然后加入10ml冰醋酸-乙腈-水混合物和0.1g乙二胺四乙酸二钠，涡旋后超声匀浆，离心，收集上清液，残渣用5ml冰醋酸-乙腈-水混合物重新提取，合并上清液，浓缩至2.5ml，用水稀释至15ml，过滤，收集滤液，得到样液。选择合适的萃取液是mspe法应用于水产品中提取四种四环素类抗生素的关键，合适的萃取液既要对目标分析物具有较高的萃取效率，又要保证磁性材料对目标分析物具有较高的吸附能力。由于结构中含有羟基，四环素类抗生素在酸性水溶液中具有较高的稳定性和良好的溶解度，通常采用弱酸性na2edta-mcllvaine缓冲溶液从水产品中提取四环素类抗生素，发明人测试了fe3o4@c-nfs复合材料在纯水、na2edta-mcllvaine缓冲溶液和冰醋酸-乙腈-水混合溶液(1：84：15，v/v/v)中对四种四环素类抗生素的吸附，结果表明，在纯水和冰醋酸-乙腈-水混合溶液中，磁性材料对四种四环素类药物的吸附率均可达到90％以上，而在na2edta-mcllvaine缓冲溶液中，吸附率仅为50％左右，因此，本发明中采用冰醋酸-乙腈-水混合溶液(1：84：15，v/v/v)作为萃取液以提取样品中的四环素类抗生素。

9、(2)磁固相萃取

10、将10g用甲醇和水活化后的fe3o4@c-nfs复合材料，加入样液中，振荡吸附，利用聚丙烯离心管外的磁铁将fe3o4@c-nfs复合材料磁吸固定在聚丙烯离心管内，倒去聚丙烯离心管中的液体，加入4ml洗脱液，振荡洗脱，利用聚丙烯离心管外的磁铁将fe3o4@c-nfs复合材料磁吸固定在聚丙烯离心管内，倒出液体，液体过滤后，作为上机溶液。吸附剂fe3o4@c-nfs复合材料的用量是影响目标分析物吸附的重要参数，鉴于利用质谱的高灵敏度可以在痕量水平上检测到四环素类抗生素，并且合成的fe3o4@c-nfs复合材料具有良好的比表面积和吸附性能，因此fe3o4@c-nfs复合材料的用量不需要太大，发明人考察了fe3o4@c-nfs复合材料用量对四环素类抗生素提取率的影响，通过改变其用量从5到20mg(5、10、15和20mg)来优化fe3o4@c-nfs复合材料的使用量，可发现当fe3o4@c-nfs复合材料质量从5.0mg增加到10.0mg时，四环素类抗生素的提取率有所提高，但当四环素类抗生素的添加量超过10mg时，四环素类抗生的提取率反而开始下降，因此，本发明中fe3o4@c-nfs复合材料的添加量为10.0mg，即可保证较好的吸附效果；发明人考察了洗脱液的体积(1.0～5.0ml)对回收率的影响，当洗脱液体积为4.0ml时，能获得令人满意的回收率；与传统的固相萃取方法不同，采用fe3o4@c-nfs复合材料为吸附剂进行吸附萃取，不需要活化、上样、淋洗等步骤，样品前处理步骤更为方便，有助于大大提高检测效率，在超高效液相色谱(uplc)的辅助下，能在不到5min的时间内就实现对四种四环素类抗生素的分离。

11、(3)将上机溶液上机，利用uplc-ms/ms法对四种四环素类抗生素进行扫描检测，根据四种四环素类抗生素的定量离子的峰面积与标准曲线进行比较，通过换算即可得到样品中四环素类抗生素的实际浓度，所述四种四环素类抗生素为土霉素、四环素、金霉素和强力霉素。绘制四种四环素类抗生素标准曲线为本领域的常规技术手段，故不在此赘述。

12、作为优选，步骤(1)中，冰醋酸-乙腈-水混合物中，冰醋酸、乙腈、水的体积比为1：84：15；在4℃下8000rpm离心5min；0.45μm膜过滤器过滤。

13、作为优选，步骤(2)中，振荡20min；所述洗脱液为乙腈和草酸溶液的混合溶液，乙腈与草酸溶液的体积比为1：8，草酸溶液中，草酸浓度为0.02mol/l；液体经0.22μm有机微孔滤膜过滤。吸附时间是影响萃取率的决定性因素之一，与含目标分析物的样品溶液的有效接触是获得高萃取率的重要条件；发明人在不同的振荡时间5～40min范围内对萃取率的影响进行了考察，结果表明，随着时间的延长，萃取率逐渐提高，超过20min萃取率变化不明显，说明在20min内，四环素类抗生素与fe3o4@c-nfs复合材料之间的快速分布平衡已经建立，因此将振荡吸附时间选择为20min；mspe最关键的步骤之一是彻底洗脱吸附在fe3o4@c-nfs复合材料上的分析物；一种合适的洗脱液首先应该能够从fe3o4@c-nfs复合材料中彻底洗脱分析物，以获得可靠和可重复的分析结果，其次要溶解高百分比的分析物，并适用于随后的样品质谱分析，发明人对乙腈(acn)、甲醇(meoh)、含甲醇的甲酸溶液(2％、5％、10％，v/v)这几种常用洗脱液进行了测试，发现乙腈、甲醇均无法将四环素类抗生素从fe3o4@c-nfs复合材料上洗脱，而含甲醇的甲酸溶液(2％、5％、10％，v/v)的洗脱率为2.7％～7.4％；发明人最终发现了乙腈和草酸溶液的混合溶液(乙腈与草酸溶液的体积比为1：8，草酸溶液中，草酸浓度为0.02mol/l)，对四环素类抗生素具有很好的洗脱效果，因此本发明中选择乙腈和草酸溶液的混合溶液(乙腈与草酸溶液的体积比为1：8，草酸溶液中，草酸浓度为0.02mol/l)作为洗脱液。

14、作为优选，步骤(3)中，使用waters acquity uplctm系统，色谱条件为：色谱分离采用watersbehc18色谱柱，色谱柱规格2.1×100mm，粒径1.7μm，0.1％甲酸溶液作为流动相a，乙腈作为流动相b，将流动相a和流动相b组成的二元梯度流动相，流速0.3ml/min，梯度设计为：0～1.0mi，90％a；1.0～2.0min，90％～70％a；2.0～3.5min，70％～40％a；3.5～5.0min，40％a；5.0～5.5min，40％～90％a；5.5～7.0min，90％a；色谱柱温度35℃，自动进样器温度10℃；进样量为10μl；采用masslynx软件4.1进行仪器控制和数据采集。

15、作为优选，步骤(3)中，采用quattro premier xe micromass三重四极杆质谱仪，质谱条件为：采用电喷雾电离在正离子模式下运行，质谱分析采用多反应监测模式，ms/ms参数为：锥体和脱溶气体：氮气，纯度99.9％，碰撞气体：氩气，纯度99.9999％，源温度150℃，脱溶剂气温度：380℃；锥孔气为高纯氮气，流量：50l/h；脱溶剂气为高纯氮气，流量：600l/h。

16、因此，本发明具有如下有益效果：

17、(1)提供了一种fe3o4@c-nfs复合材料，其采用简单的一步水热法合成，合成方法简单环保，所用试剂少，安全毒性小，fe3o4@c-nfs复合材料具有比表面积大、高度交织和支化的介孔结构以及优异的磁性等特点，对四种典型四环素具有优异的选择吸附及洗脱性能，可作为吸附剂用于水产品中四种典型四环素(土霉素、四环素、金霉素、强力霉素)的磁性固相萃取(mspe)前处理，以解决四环素类抗生素常规预处理中固相萃取柱过柱慢、柱堵塞等问题；

18、(2)提供了一种使用fe3o4@c-nfs复合材料利用uplc-ms/ms法痕量测定水产品中四种四环素类抗生素的方法，该方法简便、经济、灵敏，可满足水产品中痕量四环素类抗生素的检测要求，与传统的固相萃取方法不同，本方法不需要活化、上样、淋洗和洗脱等复杂步骤，且吸附剂具有可回收的优点。