一种动态细胞打印微混合器的制造方法
【专利摘要】本发明公开了一种动态细胞打印微混合器，包括底部带有出料口的混合器腔体，混合器腔体的侧壁上设有至少两个入料口，在混合器腔体内设有搅拌子，在混合器腔体外部安装有与所述搅拌子联动的可调速电机，所述搅拌子的外周设有多条导料槽且与混合器腔体的内侧壁贴近。本发明的动态细胞打印微混合器具有良好的生物兼容性，设计尺寸小，拆装以及杀菌清洁简易，方便集成，混合响应梯度快，搅拌速度可调，对细胞损伤小等特点，在药物筛选，梯度制造，生物打印等领域具有优越的前景。
【专利说明】
一种动态细胞打印微混合器
技术领域
[0001]本发明涉及生物制造工程领域以及细胞打印技术领域，尤其是涉及一种动态细胞打印微混合器。
【背景技术】
[0002]随着人们生活水平的提高以及健康意识的增强，生命科学领域正迎来其迅速发展期。其中，随着三维打印技术的出现，传统生物研究方向正逐步转向生物制造领域，有望在体外再造，器官修复等领域实现制造用以修复或替代人体病损组织和器官，大大延长人类的生命。
[0003]在产业布局上，超过⑶P约40%的工业是未来生物制造发展的空间。根据OE⑶对6个发达国家进行的研究分析结果，生物制造技术的应用可以降低工业能耗15-80%，原料消耗35-75%，空气污染50%-90%，水污染33-80%，生产成本降低9-90%。这些数据都表明，生物制造在未来将会给制造业，医疗行业带来十分巨大的产值以及不可估量的环境效益。生物制造产业将会是继信息产业之后又一个蓬勃发展的产业。
[0004]目前，采用生物可降解，生物兼容性好的生物材料的组织工程支架的研究和制造正在广泛开展，并取得了一定的成果。将混有来源不同或者性质不同的细胞的生物组织支架通过快速成型的方式打印为具有特定形状与功能的三维实体是目前较为常用的生物制造手段。通过这种制造工艺可以制造仿生器官，微流控芯片，人工组织等，并且在药物筛选，细胞生理研究，骨骼修复，组织再生，干细胞研究等领域获得了初步的应用。
[0005]细胞打印技术是生物制造技术的一种实现形式，将混有细胞及各种生长所必需的营养物质的打印材料通过单个或多个打印喷头按照计算机预先制定的路径打印完成特定形状。为了实现复杂器官或结构的打印，多喷头以及混合梯度打印工艺具有十分重要的作用。其中混合梯度打印是将两种及其以上不同组分的原料按照所需比例实时混合，最终打印出所需梯度的结构。这个过程中，打印机能够快速精确地完成混合以及尽量减少混合过程对细胞带来的损伤。
[0006]根据现有研究成果，能够实现多种原料混合的混合器大致分为静态混合器和动态混合器两种。静态混合器拥有较长的混合长度，没有额外的搅拌器，制造简易，集成度高。动态混合器需要额外的驱动力比如气压或机械振动来确保混合效率，因此其制造过程、封装和控制更加复杂，集成度低。关于静态混合器的研究起步较早，比如Belyae va等人早期就研究了静态混合器对卡拉胶液滴的混合效果(Belyaeva E1Della Valle D1Neufeld R J,etal.New approach to the formulat1n of hydrogel beads by emulsificat1n/thermal gelat1n using a static mixer[J].Chemical engineering science，2004，59
(14): 2913-2920) DWong S H等人研究了静态T型微混合器的制造过程以及混合效果(WongS HjWard M C LjWharton C ff.Micro T-mixer as a rapid mixing micromixer[J]? Sensors&Actuators B Chemical，2004，100(3): 359-379)。其中动态混合器因为其混合体积小，混合效率高等特点，已受到一些学者的关注。Ober和Foresti等人设计并采用了动态混合式喷头并测试了光敏树脂，导电材料等(Ober T J,Foresti D1Lewis J A.Activemixing of complex fluids at the microscale[J].Proceedings of the Nat1nalAcademy of Sciences, 2015,112(40): 12293-12298)。Arratia和Kukura等研究了剪切稀化流体在搅拌槽中的紊流分布和混合情况(Arratia P E , Kukura J , Lacombe J , etal.Mixing of shear-thinning fluids with yield stress in stirred tanks[J].AIChE journal ,2006,52(7): 2310-2322)。由于动态态混合器在对于不同粘度，不同流体的良好混合效果，其用于细胞打印技术为打印各向异性组织以及梯度实验结构提供了技术上的可能性。
[0007]目前已有的一些动态微混合器的发明及装置中，有包括超声混合，动电学混合，离心混合以及交替脉冲流混合等方式的众多微混合器，虽然混合器腔体积小，能够实时混合，但是由于控制方式复杂，集成度低以及对混合液物理伤害严重等特点，无法作为细胞打印的微混合器。其次为了保证细胞在液体混合期间能够保证良好的生理活性，需要混合器提供适宜的温度环境，生物兼容材质以及灵活的组装和清洗条件。
【发明内容】
[0008]本发明提供一种动态细胞打印微混合器，可将来自两个通道的含有细胞或者以及其他试剂的凝胶在很小的混合腔内恒温混合均匀，并实时将搅拌均匀的凝胶挤出至打印喷头，根据两个主入通道的挤出速率，通过电机提供相应的搅拌速度，以更好地减少对细胞的损伤以及提供精确的转速控制以达到良好的搅拌混合效果。本发明能够作为细胞三维打印机的核心挂载喷头，实现各向异性打印以及梯度制造等。
[0009]—种动态细胞打印微混合器，包括底部带有出料口的混合器腔体，混合器腔体的侧壁上设有至少两个入料口，在混合器腔体内设有搅拌子，在混合器腔体外部安装有与所述搅拌子联动的可调速电机，所述搅拌子的外周设有多条导料槽且与混合器腔体的内侧壁贴近。
[0010]本发明针对的混合对象是用于细胞培养的具有生物兼容性的水凝胶，且含有用于实验的活体细胞、少量营养液及生长因子。
[0011]所述水凝胶还可以混入一定量的用于细胞筛选或梯度实验的特定药物或者其它用于实验的试剂，所述水凝胶在进入混合器之前为液相，通过混合器挤出后通过化学交联或者其它物理条件使其发生相变，固定成型。为了保证含有细胞的水凝胶在打印过程中不受到污染，整个装置需要预先经过酒精消毒以及紫外光照射消毒，配置的材料同样需要经过杀菌消毒处理。
[0012]本发明搅拌子带有导料槽，导料槽槽口朝向且贴近混合器腔体的内侧壁贴近，旋转搅拌子时可利用层流效应将多种组分液体交替混合，还可以通过改变可调速电机的转速调控对细胞的损伤。
[0013]作为优选，所述搅拌子的材质为聚乳酸(PLA)、钛合金或不锈钢;所述混合器腔体的材质为聚乳酸(PLA)、不锈钢或钛合金。
[0014]以上均为临床生物兼容性表现优异的材料，为了保证打印件的密封性需求、强度需求以及生物兼容性需求:所有不同零部件之间的配合均采用密封圈密封，且采用螺栓连接确保连接强度。制造完成的混合器腔体需要杀菌消毒以及无菌保存。在混合器工作开始前需要对混合器进行清洗以及预挤出。
[0015]所述搅拌子通过旋转轴与所述可调速电机联动，所述搅拌子设有轴向通孔，且过盈配合的套设在旋转轴上。
[0016]本发明混合器腔体应理解为实体部件，其内部具有混料空间，所述搅拌子亦处在该混料空间中，为了进行密封以及保持旋转轴的稳定转动，作为优选，所述旋转轴与混合器腔体之间在靠近搅拌子一侧安装有四氟弹簧泛塞封，在远离搅拌子一侧安装有滚动轴承。
[0017]四氟弹簧泛塞封用于密封旋转轴与混合器腔体之间的配合，采用的材质为聚四氟乙烯(PTEE)，内部弹簧为不锈钢材质，最大承受转速为
[0018]1273r/s，工作转速为 3-llr/s。
[0019]所述搅拌子整体上为筒形，最大外轮廓与混合器腔体的内侧壁的间隙0.3?0.6mm(优选0.5mm)。搅拌子外周采用齿形设计，齿槽部位即为所述的导料槽，旋转搅拌时利用层流效应将多种组分液体交替混合。
[0020]作为优选，所述导料槽沿搅拌子轴向布置，各导料槽在周向上均匀排布，
[0021]作为进一步的优选，所述混合器腔体的底部内壁为倒锥结构，所述搅拌子的底部与所述倒锥结构的形状相适应。采用倒锥设计，作为与混合器出口通道的过渡结构，可以降低在出口处的扬程损失，提高出口压力。
[0022]本发明的可调速电机可采用步进电机、伺服电机或减速变频电机等，用于带动搅拌子旋转。其工作电压和电流由控制器提供。
[0023]在工作时，为了降低电机转动对混合器带来的振动影响，作为优选，所述混合器腔体的顶部设有电机固定块，所述可调速电机通过弹性垫片安装在电机固定块上。
[0024]为了控制转速，所述可调速电机通过电路连接有控制器，所述控制器可采用开源或商用控制器，具体功能包括电源、控制信号输出、电机驱动、外部通讯接口等，负责接收上位机控制信号同时控制可调速电机。
[0025]为了便于控制温度，作为优选，所述混合器腔体的侧壁中设有换热夹套，在混合器腔体的外壁设有与所述换热夹套连通的换热介质进出口。
[0026]为了便于装配，作为优选，所述混合器腔体由上腔体和下腔体对接而成，上腔体中部为用于放置搅拌子的混料空间，所述换热夹套以及入料口均位于上腔体处，所述出料口位于下腔体处。
[0027]所述入料口为两个，通过对应的通道接入混料空间，两个入料口以及对应的通道对称的设置在混料空间两侧。
[0028]所述通道连通至混料空间顶部。流入的物料可沿导料槽向下流动，直至出料口。
[0029]所述倒锥结构位于下腔体处，下腔体处还设有与倒锥结构中部相匹配用以安装点胶针头的鲁尔接头。
[0030]所述入料口对接有鲁尔接头。
[0031]作为优选，安装点胶针头的鲁尔接头，以及入料口对接的鲁尔接头由机加工制造，材料为不锈钢或钛合金等，通过螺纹连接与所述混合器腔体相连。螺纹配合处辅助密封胶带密封，鲁尔接头与混合器腔体之间安装弹性垫片，管道内径1_。
[0032]与现有技术相比，本发明具有如下优点:
[0033](I)混合器腔体以及搅拌子采用生物兼容性材料，适合细胞打印；
[0034](2)混合器腔体采用水循环温控，在满足细胞打印环境的同时降低了机构设计复杂度；
[0035](3)混合器各部分的制作采用模块化工艺，方便拆装以及杀菌清洗；
[0036](4)混合器腔体积小，混合迟滞小，可快速响应梯度变化；
[0037](5)搅拌子外径与混合腔体内壁间距小，混合效果明显，可选择较低的搅拌速度，减少对细胞的损伤。
【附图说明】
[0038]图1是本发明的动态细胞打印微混合器的结构示意图。
[0039]图2是本发明的动态细胞打印微混合器的剖视图。
[0040]图3是本发明的上腔体的局部剖视图。
[0041 ]图4a是本发明的搅拌子的侧视图。
[0042]图4b是本发明的搅拌子的俯视图。
[0043]图5是本发明的动态细胞打印微混合器工作原理示意图。
[0044]图中:I为可调速电机，2为弹性垫片，3为电机固定块，4为沉头固定螺栓，5为快速接头，6为入料口鲁尔接头，7为搅拌子，8为密封垫圈，9为弹性垫圈，10为出料口鲁尔接头，11为点胶针头，12为固定螺栓，13为下腔体，14为旋转轴，15为四氟弹簧泛塞封，16为弹性垫圈，17为上腔体，18为滚动轴承，19为密封垫圈，20为刚性联轴器，21为进料软管，22为注射器，23为注射器，24为柱塞栗，25为换热夹套，26为换热介质进出口，27为导料槽。
【具体实施方式】
[0045]参见各附图，本发明动态细胞打印微混合器，包括混合器腔体，混合器腔体，可调速电机I通过电机固定块3安装在混合器腔体的顶部。
[0046]可调速电机I与电机固定块3之间设有弹性垫片2，电机固定块3与混合器腔体之间通过沉头固定螺栓4固定连接。
[0047]混合器腔体由上腔体17、下腔体13通过固定螺栓12对接而成，上腔体17、下腔体13之间设有密封垫圈8，电机固定块3与上腔体17之间设有密封垫圈19。上腔体17、下腔体13的材质为聚乳酸、不锈钢或钛合金。
[0048]上腔体17的中部为用于放置搅拌子7的混料空间，可调速电机I的主轴通过刚性联轴器20连接有旋转轴14，旋转轴14由上至下延伸进入混料空间，旋转轴14的外围与混料空间的顶口部位之间安装有滚动轴承18和四氟弹簧泛塞封15。
[0049]搅拌子7的材质为聚乳酸、钛合金或不锈钢，搅拌子7设有轴向通孔，且过盈配合的套设在旋转轴14上。过盈配合后由于工作载荷不大，因此无需再做其他固定或装夹。
[0050]搅拌子I整体上为筒形，周设有多条轴向布置的导料槽27，各导料槽在周向上均匀排布，搅拌子I的最大外轮廓与混合器腔体的内侧壁间隙为0.5mm，导料槽的截面形状为三角形，径向深度为6_。旋转搅拌时可以利用层流效应将多种组分液体交替混合。
[0051 ]下腔体13的中心区域为出料口，该部位内壁为倒锥结构，搅拌子7的底部与倒锥结构的形状相适应。
[0052]上腔体17的侧壁带有相对布置的两个入料口，各入料口部位设有入料口鲁尔接头6，入料口鲁尔接头6与上腔体17的侧壁之间设有弹性垫圈16以防泄露。
[0053 ]下腔体13的中心区域设有出料口且对接有出料口鲁尔接头1;各鲁尔接头均通过螺纹连接，材质为不锈钢或钛合金，鲁尔接头另一端则为一空心圆管用以配合进料管或点月父嗔头。
[0054]例如出料口鲁尔接头1上连接有点胶针头11，出料口鲁尔接头1与下腔体13的底面之间还设有弹性垫圈9以防泄露。
[0055]各鲁尔接头采用拉丝刻花制造防滑纹，为了减少混合腔的迟滞体积，鲁尔接头的内径为Imm通孔，全长15mm，比同规格标准鲁尔接头通道容积降低了77.9%，整个微混合器的迟滞容积约为107uL。
[0056]上腔体17侧壁中设有换热夹套25，上腔体17的外壁设有与换热夹套25连通的换热介质进出口 26，换热介质进出口处安装有快速接头5，换热夹套顶部开放，且恰好被密封垫圈19封闭。
[0057]本发明的动态细胞打印微混合器使用时需配合柱塞栗24，两种混合组分A和B分别置于注射器22和注射器23中，通过柱塞栗24定量注射(分别沿箭头A和箭头B的方向)。动态细胞打印微混合器与各注射器之间通过进料软管21连接，进料软管外面包裹刚性很好的尼龙扎带，防止在注射过程中由于进料软管的膨胀而影响控制精度。两种组分进入混料空间之后，由可调速电机带动的搅拌子配合注射栗的挤出运动定量输出转速。为获得不同效果的混合效果，可调速电机输出的旋转运动支持快速正反转切换，高低速搭配变速搅拌等。最后从动态细胞打印微混合器挤出的含有AB两种组分的水凝胶(A+B)，通过可更换的点胶喷头实现挤出。
[0058]如果将动态细胞打印微混合器安装在三维运动平台，就能够实现三维细胞混合打印。动态细胞打印微混合器在工作前需预先挤出一定量的A和B组分，同时在两个快速接头之间通适宜温度的恒温水，确保水凝胶材料不会由于低温而凝固，从而堵塞喷头，同时确保AB组分的生物活性。
[0059]本发明的动态细胞打印微混合器控制过程为:
[0060]可调速电机的控制器通过通讯接口和细胞打印机主控制器通讯，接收来自细胞打印机主控制器的转速控制命令，并输出至搅拌子；用于注射两种组分的柱塞栗同样需要依靠细胞打印机主控制器，根据用户具体的运动代码，柱塞栗分别输出定量的两种组分至动态细胞打印微混合器。
[0061 ] 具体实例:
[0062]用本发明的动态细胞打印微混合器研究各种生长因子的浓度以及其梯度分布对小鼠表皮成纤维细胞生长的影响。
[0063]步骤一、准备好所有部件，将电机固定块、上下腔体、搅拌子、旋转轴和可调速电机安装面以及其主轴用75%酒精消毒，将鲁尔接头、快速接头、注射器、进料管等设备高温消毒，最后对所有接触到细胞的设备进行紫外光杀菌。
[0064]步骤二、在洁净台装配各部件，并连接上两个输入通道的进料软管以及快速接头。从快速接头通入37度恒温洁净水，预热5至10分钟。启动搅拌子并保持7r/s的转速，用37摄氏度PBS从连接两个输入通道的进料管通入，反复清洁2到3次。清洁结束后关闭可调速电机。
[0065]步骤三、将用于实验的细胞株离心并和适宜浓度的海藻酸钠水凝胶在37摄氏度下搅拌混合均匀作为A组分置于注射器;将实验用的生长因子和同等浓度的水凝胶在37摄氏度下搅拌混合均匀作为B组分置于注射器。
[0066]步骤四、将装有两种组分注射器连接进料软管，两通道同时预挤出，直到从混合器有水凝胶挤出，停止预挤出。
[0067]步骤五、按照先前安排好的运动路径，通过三维运动平台主控制器控制柱塞栗的挤出以及可调速电机的搅拌速度;挤出的海藻酸钠水凝胶打印后在2%CaCl2溶液里交联成形，成形后的结构各部分根据两个通道挤出率的不同而具有组分差异，因而理论上会形成A:B为O?⑴的任意配比凝胶，此方法可以一次性试验小鼠成纤维细胞在所有生长因子比例下的生长情况，以识别并挑选出适宜的比例区段。
[0068]上述步骤均在洁净环境下操作，挤出成型的海藻酸钠水凝胶可更换为其他类型的细胞组织支架，根据柱塞栗挤出速率的差异，可调速电机的旋转速度范围为3-llr/s。根据成形材料成分的变化相应改变水循环温度至合理区间，确保材料挤出成形质量以及细胞和生长因子的生物活性。
[0069]本发明的细胞打印微混合器具有较小的混合体积，能够实时实现混合;其采用的材质均为生物兼容材质，不会对细胞带来毒性损伤;通过层流搅拌设计的搅拌速率较小，对细胞损伤轻。且所有零部件制造工艺相对简单，成本不高，能够为细胞生物力学研究、医学研究、以及细胞打印提供很好的借鉴。
【主权项】
1.一种动态细胞打印微混合器，包括底部带有出料口的混合器腔体，混合器腔体的侧壁上设有至少两个入料口，其特征在于，在混合器腔体内设有搅拌子，在混合器腔体外部安装有与所述搅拌子联动的可调速电机，所述搅拌子的外周设有多条导料槽且与混合器腔体的内侧壁贴近。2.如权利要求1所述的动态细胞打印微混合器，其特征在于，所述搅拌子的材质为聚乳酸、钛合金或不锈钢;所述混合器腔体的材质为聚乳酸、不锈钢或钛合金。3.如权利要求1所述的动态细胞打印微混合器，其特征在于，所述搅拌子通过旋转轴与所述可调速电机联动，所述搅拌子设有轴向通孔，且过盈配合的套设在旋转轴上。4.如权利要求3所述的动态细胞打印微混合器，其特征在于，所述旋转轴与混合器腔体之间在靠近搅拌子一侧安装有四氟弹簧泛塞封，在远离搅拌子一侧安装有滚动轴承。5.如权利要求4所述的动态细胞打印微混合器，其特征在于，所述搅拌子整体上为筒形，最大外轮廓与混合器腔体内侧壁的间隙0.3?0.6mm。6.如权利要求5所述的动态细胞打印微混合器，其特征在于，所述搅拌子的底部与所述倒锥结构的形状相适应。7.如权利要求6所述的动态细胞打印微混合器，其特征在于，所述混合器腔体的顶部设有电机固定块，所述可调速电机通过弹性垫片安装在电机固定块上。8.如权利要求7所述的动态细胞打印微混合器，其特征在于，所述混合器腔体的侧壁中设有换热夹套，在混合器腔体的外壁设有与所述换热夹套连通的换热介质进出口。9.如权利要求8所述的动态细胞打印微混合器，其特征在于，所述混合器腔体由上腔体和下腔体对接而成，上腔体中部为用于放置搅拌子的混料空间，所述换热夹套以及入料口均位于上腔体处，所述出料口位于下腔体处。10.如权利要求9所述的动态细胞打印微混合器，其特征在于，所述入料口为两个，通过对应的通道接入混料空间，两个入料口以及对应的通道对称的设置在混料空间两侧。
【文档编号】C12N5/071GK105854685SQ201610422295
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月15日
【发明人】贺永, 赵海明, 傅建中
【申请人】浙江大学