在植物或树木中增强细胞壁特性的制作方法

在植物或树木中增强细胞壁特性的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于在植物中增强细胞壁特性的方法。该方法包括：将至少一种包含核酸分子的核苷酸构建体引入到所述植物中，所述核酸分子与在植物中有活性的调节区可操作性连接，其中所述核酸分子编码具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)样活性的多肽；以及在允许所述核酸表达的条件下培养所述植物，从而增强所述植物的细胞壁特性。
【专利说明】在植物或树木中增强细胞壁特性
发明领域
[0001]本发明涉及在植物(plant)、多年生植物(perennial plant)或树木(tree)中增强细胞壁特性。更特别地，本发明涉及在植物、多年生植物或树木中表达具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)或GolS样活性的酶，以在植物或树木中增强细胞壁特性。
[0002]发明背景
[0003]对利用可再生生物质进行生物燃料生产以作为环境友好且对社会经济负责的燃料替代品有增加的兴趣。在整个北美，与源自甘蔗的一起，谷物(如玉米)来源的淀粉产生了显著量的乙醇。虽然已经被建立，但是这种生产不太可能是最好的长期策略，因为目前的农业衍生能力不足以持续生产大量的计划需求。同样重要的是，对于用于食品生产的土地使用存在固有的竞争。相比之下，有前途的乙醇来源是丰富的木质纤维素原料，包括从林地和农业用地边缘生产的木材和纤维衍生生物质。可以以多种方式获得的木质纤维素生物质代表了丰富、廉价并且通常在本地可得的原料。
[0004]木质纤维素原料在化学上和结构上比目前使用的物质(例如源自甘蔗的可溶性糖或玉米来源的乙醇中的淀粉)更复杂。木质纤维素原料由植物细胞壁组成，所述细胞壁包含由纤维素、木质素和半纤维素构成的化学连接的聚合物大分子。木质原料的结构和化学性质固有地使这些物质抵御分解成可发酵糖，这由结晶纤维素微原纤维的紧凑结构，缺乏物质孔隙度和存在较高的木质素浓度引起(Chang&Holtzapple, 2000AppliedBiochemistry and Biotechnology84-86:5-37)。
[0005]据估计大约70%的植物生物质存在于植物细胞壁，并且目前仅使用了约2%的基于植物细胞壁的生物质。因此，存在利用该资源作为原材料用于生物燃料生产和作为商业化学品的机遇。植物细胞壁给植物提供机械支持并且有助于植物生长和发育。碳水化合物、蛋白质和酚类化合物(例如木质素)是植物细胞壁中的主要成分，其中纤维素、半纤维素和果胶构成了主要的多糖。
[0006]碳水化合物是植物中多种基础生理事件(例如发育、信号转导、碳转运和贮存、细胞壁合成和胁迫保护)的关键参与者。可转移的可溶性碳水化合物的来源包括蔗糖，以及水溶性棉子糖家族寡糖(raffinose family oligosaccharide, RF0),棉子糖家族寡糖为鹿糖(Suc)的α-1，6半乳糖基延伸，其中最常见的种类为棉子糖(Suc-Gall)、水苏糖(Suc-Gal2)和毛蕊花糖(Suc-Gal3)。RFO是植物界中最丰富的寡糖，并且许多产生RFO的植物在经济上是重要的。作为非还原性碳水化合物，他们是很好的贮存化合物，其可以大量积累而不影响主要代谢过程。RFO在胁迫耐受中的潜在作用已在种子中广泛研究，主要与缺水(desiccation)耐受和在脱水状态的寿命相关。此外，在一些植物物种中，已将RFO积累普遍地与非生物胁迫条件(如冷、热或干旱)相关。
[0007]US2004 / 0019932 和 US7294756 描述了使用大豆(Glycine max)肌醇半乳糖苷合酶(GolS)改变豆科种子中棉子糖糖类合成，以增强豆科植物的可食用种子的营养品质。US5648210公开了来自西葫芦(zucchini)和大豆的GolS序列以及这些序列改变油菜(Brasica napus)种子中可溶性碳水化合物组成的用途。相比于野生型种子，在转基因种子中观察到高三倍的肌醇半乳糖苷合酶活性。尽管肌醇半乳糖苷合酶活性的量增加，但是转化的品系中总α-半乳糖苷的含量显著低于野生型。更特别地，转化的植物表现出棉子糖糖类含量的降低和蔗糖含量的增加。
[0008]发明概述[0009]本发明涉及在植物、多年生植物或树木中增强细胞壁特性。本发明还涉及在植物、多年生植物或树木中改变的水平。更特别地，本发明涉及在植物、多年生植物或树木中表达具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)或GolS样活性的酶，以在所述植物、多年生植物或树木中增强细胞壁特性和/或在所述植物、多年生植物或树木中改变碳水化合物的水平。
[0010]本发明提供了用于在植物或树木中增强细胞壁特性的方法。所述方法包括:将至少一种包含核酸分子的核苷酸构建体引入到植物、树木或者植物或树木的一部分中，所述核酸分子与在植物中有活性的调节区可操作性连接，其中所述核酸分子编码具有肌醇半乳糖苷合酶(Gois)样活性的多肽；以及培养或在允许所述核酸表达的条件下培养所述植物，从而增强所述植物的细胞壁特性。
[0011]增强细胞壁特性可以包括增加细胞壁密度，增加木材密度，减少微原纤维角(microfibril angle),增加应拉木(tension wood)形成,增加纤维素含量,改变细胞壁结晶度，减少木质素含量，改造(modified)半纤维素基质，改造果胶基质或其组合。
[0012]可以使用本领域技术人员已知的方法培养表现出一种或更多种增强的细胞壁特性和/或改变的细胞壁性质水平和/或改变的碳水化合物水平的植物、多年生植物或树木用作用于源自木质纤维素原料之生物燃料生产的原料。此外，表现出一种或更多种增强的细胞壁特性和/或改变的碳水化合物水平的植物、多年生植物或树木可以被培养并用于制浆木材、化学纤维素和木料生产。此外，具有一种或更多种增强的细胞壁特性和/或改变的碳水化合物水平的植物、多年生植物或树木可以被培养并用作用于家畜的食材(foodstuff)。
[0013]此外，本发明提供了用于改变植物、多年生植物或树木或者其部分中的碳水化合物水平的方法。所述方法包括:将至少一种包含核酸分子的核苷酸构建体引入到植物、树木或者植物或树木的一部分中，所述核酸分子与在植物中有活性的调节区可操作性连接，其中所述核酸分子编码具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)样活性的多肽；以及，在允许所述核酸表达的条件下孵育或培养所述植物，从而改变植物中碳水化合物的水平。改变的碳水化合物水平可以包括总己糖的增加，戊糖的减少或其组合。此外，在过表达具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)样活性的多肽的植物中，半乳糖和/或葡萄糖的水平可以增加和/或木糖的水平可以降低。
[0014]在本发明的方法中，当与在相同条件下培养的相同物种的植物中确定的相同参数相比时，细胞壁密度可以增加约2%至约100%，其中所述在相同条件下培养的相同物种的植物未使用编码具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)样活性之多肽的核酸分子转化。此外，在本发明的方法中，当与在相同条件下培养的相同物种的植物中确定的相同参数相比时，微原纤维角可以减小约2%至约40%，其中所述在相同条件下培养的相同物种的植物未使用编码具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)样活性之多肽的核酸分子转化。在本发明的方法中，当与在相同条件下培养的相同物种的植物中确定的相同参数相比时，木材密度可以增加约2 %至约100%，其中所述在相同条件下培养的相同物种的植物未使用编码具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)样活性之多肽的核酸分子转化。此外，在本发明的方法中，当与在相同条件下培养的相同物种的植物中确定的相同参数相比时，木材密度可以增加约2%至约50%，其中所述木本植物或树木未使用编码具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)样活性之多肽的核酸分子转化。此外，在本发明的方法中，当与在相同条件下培养的相同物种的植物中确定的相同参数相比时，纤维素含量可以增加约2%至约50%，其中所述在相同条件下培养的相同物种的植物未使用编码具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)样活性之多肽的核酸分子转化。在本发明的方法中，当与在相同条件下培养的相同物种的植物中确定的相同参数相比时，结晶度(crystallinity)可以改变约2%至约50其中所述在相同条件下培养的相同物种的植物未使用编码具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)样活性之多肽的核酸分子转化。在本发明中，当与在相同条件下培养的相同物种的植物中确定的相同参数相比时，木质素含量可以进一步降低约2%至约50%，其中所述在相同条件下培养的相同物种的植物未使用编码具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)样活性之多肽的核酸分子转化。
[0015]在本方法中，木质素单体组成可以改变，从而例如可以改变丁香基(syringyl)与愈创木基(guaiacyl)之间的比率或对羟基苯甲酸酯/盐(p-hydroxybenzoate)组成。
[0016]在浆和纸、化学纤维素或生物燃料生产中使用的原料的生产方法包括:提供包含至少一种核苷酸构建体的多年生植物，所述核苷酸构建体包含与在所述多年生植物中有活性之调节区可操作性连接的核酸分子，其中所述核酸分子编码具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)样活性的多肽；以及在允许所述核酸表达的条件下培养所述多年生植物，从而生产所述原料。
`[0017]本发明的该概述不一定描述本发明的所有特征。
[0018]附图简述
[0019]本发明的这些和其他特征将从以下说明(其中参照了附图)中变得更明显，所述附图中:
[0020]图1 示出 Atlg09350 的 cDNA 序列(SEQ ID N0.1)。
[0021]图2 示出 Atlg09350 的蛋白质序列(SEQ ID N0.2)。
[0022]图3 示出 Atlg09350 的基因组序列(SEQ ID N0.3)。
[0023]图4A 示出拟南芥(A.thaliana)GolS2 的蛋白质序列(SEQ ID N0.4)。
[0024]图4B 示出拟南芥 GolS2 的 mRNA 序列(SEQ ID N0.5)。
[0025]图5A示出拟南芥GolSl的蛋白质序列(SEQ ID N0.6)。
[0026]图5B 示出拟南芥 GolSlmRNA 序列(SEQ ID N0.7)。
[0027]图6A示出AY126715.1 (大豆肌醇半乳糖苷合酶mRNA) (SEQ ID N0.12)。6B示出AY379783.1 (西葫芦(Cucurbita pepo)肌醇半乳糖苷合酶(GASl)基因(SEQ ID N0.13)。6C示出 AtGolS3(SEQ ID N0.1)、大豆 AY126715 (SEQ ID N0.12)和西葫芦 AY379783 (SEQ IDN0.13)的 CLUSTAL ff(l.81)多序列比对。6D 示出 3AtGolS3 (SEQ ID N0.2)。6E 示出大豆GolS (SEQ ID N08)。6F 示出西葫芦序列(SEQ ID N0.9)。6G 示出 AtGo I S3 (SEQ ID N0.2)、大豆 AY126715(SEQ ID N0.8)和西葫芦 AY379783 (SEQ ID N0.9)的 CLUSTAL ff(l.81)多序列比对。
[0028]图7A示出GolS3肌醇半乳糖苷合酶3。7B示出Atlg09350(SEQ ID N0.1)的BLAST检索。[0029]图8示出在植物中生物合成肌醇半乳糖苷、棉子糖和水苏糖的示意图。
[0030]图9示出AtGolS3在杂交杨树韧皮部中的相对表达2~ (-ACt)的图。
[0031]图1OA和IOB示出AtGol53在杂交杨树四个中组织内的相对表达2~ (-ACt)的图。在五月龄温室培养的杂交杨树的组织中拟南芥肌醇半乳糖苷合酶3基因(AtGolS3)的转录本量使用式2~(-ACt)表示为相对转录起始因子5A(TIF5A=参照基因)的表达。
[0032]图1IA和Ilb示出在五月龄温室培养的野生型野生型和AtGolS3转基因杂交杨树的所选组织中，相比于野生型野生型杨树，肌醇半乳糖苷合酶过表达的转基因杨树中可溶性肌醇半乳糖苷的图。示出在五月龄温室培养的野生型野生型和AtGolS3转基因杂交杨树的所选组织中肌醇半乳糖苷的浓度。
[0033]图12A和12B示出在五月龄温室培养的野生型野生型和AtGolS3转基因杂交杨树的所选组织中，相比于野生型野生型杨树，肌醇半乳糖苷合酶过表达的转基因杨树中可溶性myo-肌醇(myo-1nosi tol)的图。示出在五月龄温室培养的野生型野生型和AtGolS3转基因杂交杨树的所选组织中myo-肌醇的浓度。
[0034]图13A和13B示出在五月龄温室培养的野生型野生型和AtGolS3转基因杂交杨树的所选组织中，相比于野生型野生型杨树，肌醇半乳糖苷合酶过表达的转基因杨树中可溶性棉子糖的图。示出在五月龄温室培养的野生型野生型和AtGolS3转基因杂交杨树的所选组织中棉子糖的浓度。
[0035]图14A和14B示出在五月龄温室培养的野生型野生型和AtGolS3转基因杂交杨树的所选组织中，相比于野生型野生型杨树，肌醇半乳糖苷合酶过表达的转基因杨树中可溶性蔗糖的图。示出在五月龄温室培养的野生型野生型和AtGolS3转基因杂交杨树的所选组织中蔗糖的浓度。
[0036]图15示出使用已证实的和推定的肌醇半乳糖苷合酶的预测氨基酸序列构建的邻接树。15A)和15C)来自杨属(Populus)的GolS被分为四个进化枝a、b、c和d,以及15B)和15D)来自不同植物物种的GolS。对毛果杨(P.trichocarpa)GolS基因提供Phytozome登录号，对剩下的植物提供GenBank登录号。系统发生分析揭示了杂交杨树酶在生物或非生物胁迫期间的推定作用。
[0037]图16A-16U 示出 SEQ ID N0.16-37 的序列。
[0038]图17示出五月龄温室培养的表达拟南芥肌醇半乳糖苷合酶3基因(AtGolS3)的转基因杨树和野生型野生型。
[0039]图18示出三月龄温室培养的杂交杨树的从茎基部到顶点的高度，以及在距茎基部20cm处的直径的图。
[0040]图19示出野生型(A、D)，AtGolS3转基因品系6(B、E)和转基因品系11 (C、F)杂交杨树的自发突光(auto-florescence) (A-C)和卡尔科弗卢尔(calcofluor) (D-F)染色。转基因品系显示用卡尔科弗卢尔染色的纤维素的增加(比例尺:70μπι)。
[0041]图20示出来自野生型野生型(么、0和6)，AtGolS3转基因品系6(Β、Ε和H)和AtGolS3转基因品系11(C、F和I)杂交杨树的木质部组织的免疫荧光标记。组织用抗木聚糖LMlO抗体(A-C)，抗RGI CCRCM7抗体(D-F)和抗甘露聚糖抗体(G-1)标记。
[0042]图21示出温室培养的野生型野生型和AtGolS3转基因杂交杨树的细胞壁木质素的 HSQC2D-NMR。[0043]图22示出温室培养的野生型野生型和AtGolS3转基因杂交杨树的细胞壁多糖异头区(Polysaccharide anomeric region)的 HSQC2D-NMR。
[0044]图23示出五月龄温室培养的野生型野生型和AtGolS3转基因杂交杨树的纤维长度和宽度。
[0045]图24示出来自拟南芥的已知GolS蛋白质(AtGolSl和_5)、匍匐筋骨草(Ajugareptans) (ArGolSl 和-2)、水稻(Oryza sativa) (OsGoISI)、甜瓜(Cucumis melo)(CmGolSl)和从银白杨X大齿杨(P.albaX grandidentata)杂交杨树分离的两个GolS蛋白质(PaXgGolSI和PaXgGolSII)的推导的氨基酸序列比对。所预测的两个同工型(PaXgGolSI和PaXgGolSII)的蛋白质序列示出来自其他物种的肌醇半乳糖苷合酶的特征，包括在274位的丝氨酸磷酸化位点和五肽疏水结构域ASAAP。
[0046]发明详述
[0047]本发明涉及在植物或树木中增强细胞壁特性。更特别地，本发明涉及在植物或树木中表达具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)或GolS样活性的酶以在植物或树木中增强细胞壁特性。
[0048]本发明提供了组合物和方法，其通过操控棉子糖寡糖家族(RFO)的产生在植物组织或细胞(例如木本被子植物和裸子植物)中增强细胞壁特性。如下更详细的描述，在植物或树木或者其部分中过表达编码具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)或GolS样活性之酶的多核苷酸序列增强植物或树木的一种或更多种细胞壁特性。可通过异位表达GolS增强的一种或更多种细胞壁特性的实例包括但不限于，与其中不过表达GolS之植物或树木的相同或类似细胞、组织、器官相比时，植物或树木的细胞、组织、器官的细胞壁密度增加，比重(specific gravity)增加，微原纤维角减小，应拉木形成增加，纤维素含量增加，纤维素结晶度改变，木质素含量降低，木质素单体组成改变例如丁香基与愈创木基比值改变，半纤维素和果胶基质改造或其组合。
[0049]肌醇半乳糖苷合酶(Galactinol synthase, G0LS)也被称为肌醇(inositol) 3- a t_半乳糖基转移酶，UDP-D-半乳糖:肌醇半乳糖基转移酶；UDP_半乳糖:myo-肌醇1- a -D-半乳糖基转移酶；UDP半乳糖:myo-肌醇1- a -D-半乳糖基转移酶；肌醇半乳糖苷合酶；肌醇-α-半乳糖基转移；和尿苷二磷酸半乳糖-肌醇半乳糖基转移酶(酶数据库编号EC2.4.1.123)。Go IS通过从UDP-D-半乳糖和myo-肌醇可逆地合成肌醇半乳糖苷来催化RFO生物合成的第一步(例如，参见图8)。肌醇半乳糖苷是更大可溶性寡糖(例如棉子糖，水苏糖(stachyose)和毛蕊花糖(verbascose))形成的底物。
[0050]当多肽具有一个或更多个天然蛋白质的性质(例如，从UDP-D-半乳糖和myo-肌醇合成肌醇半乳糖苷)时称其有GolS样活性。测定从多种来源获得的蛋白质的活性以确定蛋白质的性质是否相同在本领域技术范围内。在这样做时，本领域技术人员可以使用任意多种已知测定，包括例如生物化学测定。例如，本领域技术人员能够容易地产生用GolS多肽变体转化的植物并且测定在该植物材料中天然GolS蛋白质的性质以确定具体的GolS性质是否被所述变体保留。
[0051]因此，本发明涉及方法和组合物，其用于通过改造GolS或GolS样酶的活性在植物组织或细胞或者树木组织或细胞(例如木本被子植物和裸子植物细胞)中增强细胞壁特性。所述方法涉及将编码GolS或显示GolS样活性之酶的核酸序列引入植物或树木细胞或者完整植物或树木，并且在植物或树木细胞中表达所述核酸序列，从而增强植物或树木的细胞壁特性。
[0052]本发明还提供了在浆和纸、化学纤维素、实木料(solid lumber)或生物燃料生产中使用的原料的生产方法，其包括，提供包含至少一种核苷酸构建体的多年生植物，所述核苷酸构建体包含与在所述多年生植物中有活性之调节区可操作性连接的核酸分子，其中所述核酸分子编码具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)样活性的多肽；以及在允许所述核酸表达的条件下培养所述多年生植物，从而生产所述原料。
[0053]本发明还涉及包含核酸分子和由其编码之多肽的组合物，所述核酸分子包含编码植物GolS或GolS样的序列。这些序列可以单独使用或与其他序列组合，所述其他序列例如但不限于鹿糖合酶(Coleman等,2009, PNAS)和木质素生物合成基因或调节木质化的转录因子例如阿魏酸 _5_ 轻化酶(ferulate-5-hydroxylase) (Humphreys, Hemm 和 Chappie,2006PNAS ;Franke等，2000Plant Journal ；Huntley et al.,2003Journal of Agricultureand Food Chemistry),其可用于增强细胞壁特性。本发明还包括核酸,表达盒以及包含GolS或GolS样核苷酸序列的转化载体。所述转化载体可以用于转化植物并表达增强所转化细胞的细胞壁特性的多肽。还提供了经转化的细胞以及再生的转基因植物、树木或其部分以及包含并表达GolS或GolS样DNA序列和蛋白质产物的种子。
[0054]获得了从拟南芥分离的编码GolS的核酸序列(SEQ ID N0:l、5和7)。相应的氨基酸序列提供为SEQ ID N0:2、4和6。此外，从杨树分离了 GolS核酸序列(SEQ ID NO:26-37)。相应的氨基酸序列提供为SEQ ID NO:16-25。
[0055]因此，所述核酸可以包含与在植物中有活性的调节区可操作连接的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)样活性的多肽，其中所述多肽由例如SEQ ID NO:2、4、6、16-25、38-45 的序列编码。
[0056]基于序列比对，可认为本发明涉及的一些特定序列与特定序列相似。当序列的至少约 70%或 70-100%或其间任意量(例如 70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100%或其间任意量)的核苷酸在限定核苷酸序列长度上匹配并且编码显示GolS活性(从UDP-D-半乳糖和myo-肌醇合成肌醇半乳糖苷)的产物时，序列是相似的。这样的序列相似性可以使用核苷酸序列比较程序例如DNASIS中提供的程序(使用例如但不限于下列参数:空位罚分5、顶对角线数5、固定空位罚分10，k元组(k-tuple)2、浮动空位10和窗口大小5)确定。然而，用于比较的其他序列比对方法在本领域是熟知的，例如Smith&ffaterman (1981, Adv.App1.Math.2:482)、Needleman&ffunsch (J.Mol.Biol.48:443,1970)、Pearson&Lipman (1988, Proc.Nat' 1.Acad.Sc1.USA85:2444)的算法，以及通过这些算法的计算机实现形式(GAP、BESTFIT、FASTA和BLAST，可通过NIH获得)，或者通过手动比对和目视检查(参见例如 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 等编，1995增刊),或者在严格条件下使用Southern或Northern杂交(参见Maniatis等，Molecular Cloning中(A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory,1982)。优选地，基本同源的序列在分子限定长度上显示至少约80%和最优选至少约90%的序列相似性。
[0057]在严格杂交条件下与编码GolS的核苷酸序列的互补物杂交的核苷酸序列也可被认为是相似的，前提是所述序列编码显示GolS活性(从UDP-D-半乳糖和myo-肌醇合成肌醇半乳糖苷)的产物。严格杂交条件下杂交在本领域是已知的(参见例如CurrentProtocols in Molecular Biology,Ausubel 等编，1995 以及增刊；Maniatis 等，MolecularCloning(A Laboratory Manual)中，Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 ;Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 中，第三版2001 ;各自通过引用并入本文)。这样的严格杂交条件的一个实例可以为，于4X SSC中在65°C杂交约16-20小时，随后于0.1X SSC中在65°C洗涤一小时，或于0.1X SSC中在65°C洗涤两次，每次20或30分钟。可替代地，一个示例性严格杂交条件可以为，于50%甲酰胺、4X SSC中在42°C过夜(16-20小时)，随后于0.1X SSC中在65°C洗涤一小时，或于0.1X SSC中在65°C洗涤两次，每次20或30分钟，或者过夜(16-20小时)，或者在Church水性磷酸盐缓冲液(7% SDS, 0.5M NaPO4缓冲液pH7.2 ；10mM EDTA)中于65°C杂交，并且在0.1X SSC,0.1 % SDS中于50°C洗涤两次，每次20或30分钟，或者于2X SSC,0.1% SDS中在65V洗涤两次，每次20或30分钟。
[0058]使用本领域技术人员熟知的BLAST算法通过将随机植物cDNA序列与含有核酸和蛋白质序列的公共数据库比较，可以分离和鉴定编码几种GolS的至少一部分的核酸片段。本发明的所述核酸片段可以用于从相同或其它植物物种中分离编码同源蛋白质的cDNA和序列。使用序列依赖性方法分离同源序列在本领域中是公知的。序列依赖性方法的实例包括但不限于核酸杂交法，以及DNA和RNA扩增法，如核酸扩增技术的多种用途(例如，聚合酶链反应、连接酶链反应)。
[0059]编码其他GolS的核酸序列(无论为cDNA或基因组DNA序列)可以通过使用本文描述的全部或部分核酸片段直接分离。本文所述的核酸序列可以用作杂交探针以使用本领域技术人员熟知的方法筛选来自任意期望植物或树木的文库。可通过本领域已知的方法设计并合成基于核酸序列的特异性寡核苷酸探针(Maniatis等，Molecular Cloning (ALaboratory Manual)中)。此外,完整的序列可以通过技术人员已知的方法(例如随机引物DNA标记、切口平移( nick translation)、末端标记技术)直接用于合成DNA探针,或使用体外转录体系可得的RNA探针。此外，特异性引物可以被设计并用于扩增本序列的部分或全部。所产生的扩增产物可以在扩增反应期间直接标记或在扩增反应后标记，并用作探针在适当严格性的条件下分离全长cDNA或基因组片段。
[0060]可以适用于本发明的核酸或氨基酸序列的非限制性实例列于表1中和序列表中。例如在美国专利7294756和7476778(其整体通过参考并入本文)中也描述了 GolS的同源物。
[0061]
【权利要求】
1.用于在多年生植物或多年生植物部分中增强细胞壁特性的方法，其包括(a)将至少一种核苷酸构建体引入所述多年生植物或所述多年生植物部分中，所述核苷酸构建体包含与在所述多年生植物中有活性之调节区可操作性连接的核酸分子，其中所述核酸分子编码具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)样活性的多肽；(b)在允许所述核酸表达的条件下培养所述多年生植物或所述多年生植物部分，从而增强所述多年生植物或所述多年生植物部分的细胞壁特性。
2.权利要求1所述的方法，其中所述细胞壁特性增强包括细胞壁密度增加，微原纤维角减小，木材密度增加，纤维素结晶度改变，应拉木形成增加，纤维素含量增加，木质素含量减少，木质素单体组成改变，半纤维素基质改造，果胶基质改造或其组合。
3.权利要求1所述的方法，其中在所述培养步骤后，培养包含所述增强的细胞壁特性的多年生植物。
4.用于在多年生植物或多年生植物部分中增强细胞壁特性的方法，其包括:(a)提供包含至少一种核苷酸构建体的多年生植物或多年生植物部分，所述核苷酸构建体包含与在所述植物中有活性之调节区可操作性连接的核酸分子，其中所述核酸分子编码具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)样活性的多肽；(b)在允许所述核酸表达的条件下培养所述多年生植物或所述多年生植物部分，从而增强所述多年生植物或所述多年生植物部分的细胞壁特性。
5.用于在多年生植物或多年生植物部分中改变碳水化合物水平的方法，其包括(a)将至少一种核苷酸构建体引入所述植物或所述植物部分中，所述核苷酸构建体包含与在所述植物中有活性 之调节区可操作性连接的核酸分子，其中所述核酸分子编码具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)样活性的多肽；(b)在允许所述核酸表达的条件下培养所述植物或所述植物部分，从而改变所述植物或所述植物部分中的碳水化合物水平。
6.权利要求5所述的方法，其中当与相同条件下培养的相同物种的植物或植物部分中确定的相同参数相比时，总己糖水平增加和戊糖水平降低或其组合，其中所述相同条件下培养的相同物种的植物或植物部分未使用编码具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)样活性之多肽的核酸分子转化。
7.权利要求5所述的方法，其中当与相同条件下培养的相同物种的植物或植物部分中确定的相同参数相比时，半乳糖和/或葡萄糖水平增加和/或木糖水平降低，其中所述相同条件下培养的相同物种的植物或植物部分未使用编码具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)样活性之多肽的核酸分子转化。
8.通过权利要求1、4和5中任一项所述的方法产生的多年生植物。
9.权利要求8所述的植物，其中所述多年生植物是树木。
10.多年生植物、多年生植物部分或植物细胞，其包含核酸，所述核酸包含与在植物中有活性之调节区可操作性连接的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)样活性的多肽。
11.权利要求10所述的多年生植物、植物部分或植物细胞，其中所述多肽由选自SEQID NO:2、4、6、16-25 和 38-45 的任一序列编码。
12.权利要求1所述的方法，其中所述多肽由选自SEQID NO:2、4、6、16-25和38-45的任一序列编码。
13.原料或食材，其包含权利要求8或10所述多年生植物、植物部分或植物细胞。
14.权利要求13所述的原料，其用于实木、浆和纸、溶解浆工业、生物燃料工业或其组口 O
15.核酸，其包含与在植物中有活性之调节区可操作性连接的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)样活性的多肽，其中所述多肽由选自SEQ ID NO:16-25、38和45的任一序列编码。
16.用于浆和纸或生物燃料生产的原料的生产方法，其包括，(a提供包含至少一种核苷酸构建体的多年生植物，所述核苷酸构建体包含与在所述多年生植物中有活性之调节区可操作性连接的核酸分子，其中所述核酸分子编码具有肌醇半乳糖苷合酶(GolS)样活性的多肽；以及 (b)在允许所述核酸表达的条件下培养所述多年生植物，从而生产所述原料。
【文档编号】C10G3/00GK103748225SQ201280040984
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2012年6月29日 优先权日:2011年6月29日
【发明者】肖恩·D·曼斯菲尔德, 法里德·G·温达 申请人:不列颠哥伦比亚大学