一种调控植物木质素含量的方法

专利名称：一种调控植物木质素含量的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域中一种调控植物木质素含量的方法。
背景技术：
木质素是由三种醇单体或单木质酚(对香豆醇、松柏醇、芥子醇)合成的一种复杂的酚类聚合物。在细胞壁的木质化过程中，木质素渗入到细胞壁中，填充于纤维素构架内，如导管和管胞细胞的形成。由于木质素的渗入，加大了细胞壁的硬度，增强了细胞的机械支持力或抗压强度，促进机械组织的形成，以有利于巩固和支持植物体及水分输道等作用，同时由于木质素的化学特性，如不可溶性和复杂的酚类聚合物，使得木质部具有细胞壁疏水性，也增强了抗病能力。
树木的次生木质部有纤维素(β-1-4-糖苷)木质素(苯基多聚物)和半纤维素(异型多糖)，比例约为2∶1∶1。在树木生长时，纤维素微纤丝为细胞壁提供张力，木质素增加纤维素微纤丝的硬度。木质素含量高的木材由于硬度高而广泛用于建筑和家具领域。但在造纸过程中却需要清除木质素。目前去除木浆中的木质素一般需借助毒性较高的化学物质，这道工序是造纸工业中最耗费能源、对环境危害最大的一个环节。无论是提高树木的木质素含量还是降低木质素含量都将有益于生产。
从策略上说，可以从多个方面进行木质素含量控制(1)控制木质素合成途径中的各种酶系的合成是一个重要途径，如对从PAL酶到过氧化物酶/漆酶等进行反义基因转化有可能达到目的；(2)改变木质素的结构组成和化学性质。由于研究木质素含量遗传变异的重要目的之一就是为工业造纸服务，在难以直接降低木质素含量情况下，改变木质素的结构组成有可能间接地达到同样的效果；(3)必须认识到木质素的前体是在细胞质内合成的，然后转移到细胞壁并进行脱氢聚合形成木质素，因此木质素的合成调控也需注意涉及到一些非酶化学分子的作用，即传递运输过程的控制，但这方面的研究至今却很少见报道研究。单个酶的作用及多个酶间的相互作用对于探索木质素的合成机理有重要意义，因此木质素合成酶的分子生物学特性及作用机理研究日益受重视。
目前直接应用基因工程的方法来改变木质素含量的研究已有报道。Piquemal等从冈尼桉(Eucalyptus)分离出来的CCR(羟基肉桂酰辅酶A还原酶)(EC1.2.1.44)酶的cDNA的反义构建载体，通过农杆菌(Agrobacerium)转化到烟草(Nicotianatabacum L.)上，结果显示出在稳态时CCR mRNA含量和CCR活性下降，且含量下降的植株木质部细胞壁呈橙棕色，紫丁香基与愈创木基的比率提高，且出现不正常细胞壁酚类物质。然而CCR活性严重下降的植物除了表现出木质素下降外，还表现出形体小、叶形异常和绉缩导管等特征。通常认为CAD(羟基肉桂醇脱氢酶)是催化木质素前体合成的最后一步的酶，因此降低CAD活性有可能减少木质素前体的合成。Baucher等研究将从毛果杨×美洲黑杨(P.trichocarpa Torr.Et Groy×P.deltoides Marsh.)分离出来的CAD酶的cDNA通过农杆菌进行正义和反义转化到欧洲山杨×银白杨(P.tremula L.×P.alba L.)中，结果表明3个反义转化和2个共抑制的品系的木质部组织CAD活性下降70％，在CAD活性少于60％的品系中，可检测到红色的木质部，但木质素含量和组成与对照品系相似，并未下降。但是细胞壁的化学特性不同，应用间苯三酚染色后，正常品系的木质部呈典型的淡红色，而CAD活性下降的品系染色后呈棕红色。用NaOH处理后，通过将细胞壁中具有碱溶性的部分进行酸化处理后，具有红色木质部的品系的木质素可沉淀，而白色木质部的品系的木质素不沉淀。光谱分析显示出红色木质部的杨树香兰素和紫丁香基醛含量提高。纸浆试验证明CAD活性下降的品系只有少量的木质素存于纸浆中。类似的报道还有Higuchi等，CAD反义转化的植株木质素含量并不下降，但木质素的组成和化学性质发生了改变。CAD反义转化后木质素含量不下降，这与自然界中火炬松CAD突变体的结果不一致。OMT是重要的控制木质素合成酶，Dwivedi等将美洲山杨中编码OMT(EC2.1.1.6)酶的反义序列与CaMV35S基因的增强子、启动子和终止子组装后转化到烟草基因组内后，转基因植株表现出正常的表现型。在4个转基因植株的茎部中，OMT(咖啡酸O-甲基转移酶)酶的活性平均下降29％。茎部木材化学分析结果显示出紫丁香基单位含量下降，木质素含量下降水平与OMT酶活性程度相关。Doorsselaere等应用反义COMT(咖啡酸甲基转移酶)转化欧洲山杨×银白杨后，COMT活性下降为正常的5％，但木质素含量并不下降。根据应用转化单酶基因方法改造烟草木质素含量的研究报道，降低单个酶OMT、CAD、POD(过氧化物酶)、COMT和F5H(阿魏酸5-羟基化酶)等酶活性，并不影响木质素含量变化，而降低酶系PAL(苯丙氨酸解氨酶)、C4H(肉桂酸4-羟基化酶)、和CCR(羟基肉桂酰辅酶A还原酶)等酶活性，则可以降低木质素含量。
通过鉴定树木与草本植物中木质素合成途径的酶和基因，以往努力减少树木中木质素的含量，通过下调编码咖啡酸O-甲基转移酶或肉桂醇脱氢酶含量没有获得成功，只是修饰了木质素的结构。在转基因烟草中降低这些酶的含量显示没有减少木质素的含量。然而通过在转基因烟草中降低苯丙氨酸脱氨酶含量，显著减少了木质素的含量，该酶催化木质素合成途径中进入苯丙基衍生物的途径导致了一系列表型不正常。同样在转基因拟南芥和烟草中通过降低肉桂酸辅酶A还原酶的含量也降低了(25％-40％)木质素的含量，但导致了细胞壁的委缩和矮化。这些草木系统清晰地表明了修饰次生代谢和木质素质量的可能性。因此，树木生物技术的问题是能否降低木质素含量而不影响结构的硬度和树木的生长。
杨树的4CL(4-香豆酸辅酶A连接酶)蛋白Pt4CL1、Pt4CL2催化羟基肉桂酸与CoA的连接反应，为木质素和类黄酮的生物合成提供酚类前体。Pt4CL2在茎和叶的表皮细胞中表达，与类黄酮合成相关。Pt4CL1是在发育的木质部维管组织中表达，和木质素的合成相关。
发明创造内容本发明的目的是提供一种调控植物木质素含量的方法。
本发明所提供的调控植物木质素含量的方法，是将含有4CL1基因的表达载体转化植物，得到木质素含量升高的植物；将含有反义4CL1基因的表达载体转化植物，得到木质素含量降低的植物。
所述4CL1基因是具有序列表中序列1的多核苷酸序列，所述反义4CL1基因是具有序列表中序列2的多核苷酸序列。
序列表中的序列1由1741个碱基组成，序列2由1637个碱基组成。
用于构建所述含有4CL1基因的表达载体或含有反义4CL1基因的表达载体的出发载体可为Ti类质粒载体和病毒载体，优选为Ti类质粒载体。
所述Ti类质粒载体优选为双元载体，如pBI121。所述含有4CL1基因的表达载体优选为pB4CL；所述含有反义4CL1基因的表达载体优选为pBan4CL。
所述转化方法可为农杆菌介导转化法、基因枪介导转化法或花粉管通道法，优选为农杆菌介导转化法。
本发明方法中，所述植物可为草本植物或木本植物，其中，所述草本植物优选为烟草，所述木本植物优选为杨树。
本发明通过在植物细胞中用载体引入4CL1基因或反义4CL1基因，来生产木质素含量升高或降低的转基因植物特别是转基因树木，为培育木质素含量降低或升高的植物以及改良树木材性提供了一条重要的途径。


图1为35S-4CL1融合基因载体pB4CL构建过程示意2为pB4CL的PCR鉴定图谱图3为转35S-4CL1融合基因的转基因烟草植株照片图4为转35S-4CL1融合基因烟草的PCR检测图谱图5为转35S-4CL1融合基因烟草的southern杂交图谱图6为转35S-4CL1融合基因烟草的northern杂交图谱图7a为转35S-4CL1融合基因烟草叶中的4CL1活性分析柱状7b为转35S-4CL1融合基因烟草茎中的4CL1活性分析柱状8a为转35S-4CL1融合基因烟草植株照片图8b为空白烟草植株照片图9为转35S-4CL1融合基因烟草与空白烟草的含水量、木质素及纤维素含量比较柱状10为转35S-4CL1融合基因烟草与空白烟草的木质素含量分布曲线图11为转35S-4CL1融合基因烟草与空白烟草的纤维素含量分布曲线图12a为35S-反义4CL1融合基因载体pBan4CL构建过程示意12b为转35S-反义4CL1融合基因烟草植株的PCR检测结果图谱图13为转35S-反义4CL1融合基因烟草植株的Southern杂交结果图谱图14为蛋白标准曲线图15a为空白烟草植株中4CL1酶活性动力曲线图15b为转35S-反义4CL1融合基因烟草植株中4CL1酶活性动力曲线图16为转35S-反义4CL1融合基因烟草植株与空白烟草植株中4CL1酶活性柱状17a为葡萄糖标准曲线图17b为转35S-反义4CL1融合基因烟草植株与空白烟草植株的木质素含量比较柱状17c为转35S-反义4CL1融合基因烟草植株与空白烟草植株的纤维素含量比较柱状18a为转35S-4CL1融合基因烟草植株与空白烟草植株的木质素含量比较柱状18b为转35S-4CL1融合基因烟草植株与空白烟草植株的纤维素含量比较柱状图具体实施方式
实施例1、培育木质素含量提高的转基因烟草本实施例所用的地高新试剂盒的货号为92445820，31 Oct 2003，Boehringer公司。
1、35S-4CL1融合基因载体pB4CL构建以按照常规方法提取的杨树总DNA为模板，在引物F6CGGATCCGCAATGGACGCCACAATG AATCC，F7CCGGGTACTGTCTTACGTTGGGTACG的引导下，按照如下循环程序94度5min；94度30sec，55度45sec，72度90sec，30个循环；72度10min进行PCR扩增，回收、纯化PCR扩增产物，得到4CL1基因片段，分别利用XbaI和SmaI酶切纯化的PCR扩增产物和PUC18，然后进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，经筛选得到阳性克隆，提取阳性克隆中的质粒，得到亚克隆载体pU4CL。
35S-4CL1融合基因载体pB4CL构建过程如图1所示，具体步骤如下按照常规方法用XbaI/SmaI将4CL1基因片段从亚克隆载体pU4CL上切下，并与经XbaI/SmaI酶切的pBI 121载体进行连接，获得含有融合基因35S-4CL1基因的重组载体pB4CL。用质粒pB4CL按照常规方法转化大肠杆菌JM109感受态细胞。在含卡那霉素的LB平板培养筛选后，提取质粒同时进行XbaI/SmaI酶切和以引物1CGCAATGGACGCCACAATGAATCC和引物2TACTGTCTTACGTTGGGTACG为引物进行PCR鉴定，结果如图2所示，表明4CL1基因已插入表达载体。按常规方法对质粒pB4CL进行测序，结果表明插入的4CL1基因具有序列表中序列1的核苷酸序列，位于pB4CL的5827bp-7567bp之间；序列表中的序列1由1741个碱基组成，4CL1基因的开放阅读框架为自5′端第5位-1627位核苷酸序列。
2、烟草的转化与鉴定分析按改进的An方法，直接转化农杆菌LBA4404，在链霉素(Sm)125mg/L和卡纳霉素(Km)50mg/L的YEB培养基上进行筛选，并挑取单克隆提取质粒进行酶切鉴定，得到阳性克隆。
含表达载体的农杆菌LBA4404在YEB培养基(Sm 100mg/l，Km50mg/L)中28℃震荡培养到OD600＝0.6-0.8，按1％-2％的比例用新鲜的YEB培养基(Sm 100mg/L)稀释，继续培养到OD600＝0.2-0.3。将烟草无菌苗的叶片剪下，除去叶脉，切成0.5-1.0cm的小块，在菌液中浸泡2-3min，其间不断摇动，使薄片与菌液充分接触，取出，用无菌滤纸吸干表面菌液，放在表面铺一张滤纸的MS培养基上，28℃暗培养4天，将外植体转移到含100mg/L Km，500mg/L Car的MS培养基(0.5mg/L IAA，2.0mg/L BA)上28℃继续培养，同时将未转化的组织同样处理作为负对照。每隔14天换一次培养基。当抗性芽长到1-3cm时切下，转到培养基中长茎。当茎长到3-5cm时，按照文献(王关林，方宏筠，1998，科学出版社)的方法转到含有卡那霉素和羧苄霉素的生根培养基中生根，结果如图3所示，得到再生苗37株。以在抗性培养基上生根的转化苗的叶片总DNA与未转化的烟草叶片的总DNA为模板，在引物1CGCAATGGACGCCACAATGAATCC和引物2TACTGTCTTACGTTGGGTACG的引导下按常规方法进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图4所示，表明转化苗样品中产生一个约1700bp的片段，而未转化烟草样品则没有该片段。初步证明4C11基因已经整合到烟草基因组中。
3、转基因烟草的southern杂交按照常规方法提取转基因烟草和非转基因烟草的总DNA，以非转基因烟草为对照，使用BamHI/SmaI限制性内切酶在37度酶解3小时后，1％琼脂糖凝胶电泳，将电泳胶放在10倍体积的变性液(1.5M NaCl，0.5M NaOH)中震荡40min，再在10倍体积的中和液(1.5M NaCl，0.5M Tris-Cl，pH 7.0)中震荡40min，使用20×SSC进行DNA转膜过夜，用2×SSC洗膜，于80℃干燥2小时。取1ug PCR得到的4CL1基因片段，加蒸馏水至16ul。沸水浴10min，迅速置于冰水中5min。加入2ulDIG-HIGH PRIME，混匀。37℃保温1h，加入0.2M EDTA(PH＝8.0)，混匀。预热杂交液(地高新试剂盒中自带的杂交液)至42℃。预杂交30min。取DNA探针(探针用量为25ng/ml杂交液)煮沸5min，迅速放置于冰水中。将变性探针DNA加入杂交液中混匀与杂交膜一起放入杂交袋中。除去气泡，封口，42℃过夜。取出杂交膜用50ml 2×SSC，0.1％SDS清洗2次，每次5min。100ml 0.5×SSC，0.1％SDS 50℃清洗2次，每次5min。用100ml洗涤液-100ml马来酸缓冲液(Maieic acid buffer)(0.1M马来酸，0.15M NaCl，pH 7.5)中加入0.3ml tween20清洗1-5min，加入80ml封闭液(地高新试剂盒中自带)保温30min，用20ml抗体液(地高新试剂盒中自带)保温30min，用100ml洗涤液清洗2次，每次15min。用20ml检测液平衡2-5分钟，将杂交膜放在新杂交袋中，加入CSPD-ready-to use 1ml除气泡，保温4分钟。除去CSPD-ready-to use，封口，夹X光片，室温放置1小时。结果如图5所示，表明转基因烟草中出现一条1700bp的带，而未转基因烟草则没有这条带，证明该4CL1基因已经插入转基因烟草中。图5中，CK为非转基因烟草对照，1-4为转基因烟草。
4、转基因烟草的Northern杂交按照常规方法提取转基因烟草的总RNA，以非转基因烟草为对照，进行变性琼脂糖凝胶电泳。使用20×SSC进行RNA转膜过夜，用2×SSC洗膜，于80℃干燥2小时。用1ug由PCR得到的4CL1基因的DNA，加蒸馏水至16ul，沸水浴10min，迅速置于冰水中5min，加入2ul DIG-HIGH PRIME，混匀，37℃保温1h，加入0.2M EDTA(PH＝8.0)，混匀。预热杂交液(地高新试剂盒中自带)至42℃。预杂交30min。取RNA探针煮沸5min，迅速放置与冰水中。将变性探针RNA加入杂交液中混匀与杂交膜一起放入杂交袋中。除去气泡并封口、42℃过夜。取出杂交膜用50ml 2×SSC，0.1％ SDS清洗2次，每次5min。100ml 0.5×SSC，0.1％SDS 50℃清洗2次，每次5min。用100ml洗涤液-100ml马来酸缓冲液(Maleic acid buffer)(0.1M马来酸0.15M NaCl，pH7.5)中加入0.3ml tween20清洗1-5min，加入80ml封闭液(地高新试剂盒中自带)保温30min，用20ml抗体液(地高新试剂盒中自带)保温30min，用100ml洗涤液清洗2次，每次15min。用20ml检测液平衡2-5分钟，将杂交膜放在新杂交袋中，加入CSPD-ready-to use 1ml除气泡，保温4分钟。除去CSPD-ready-to use，封口，夹X光片，室温放置1小时。结果如图6所示，表明在转基因烟草中有明显的杂交带，而非转基因烟草没有，证明4CL1基因已经在转基因烟草中表达。图6中，CK为非转基因烟草，sample为转基因烟草植株。
5.转基因烟草4CL1酶活性的测定转基因烟草叶片和茎分别在液氮下粉碎，用提取缓冲液(0.2M Tris-HCl pH7.5，8mM MgCl2，5mM DTT，30％甘油，1ug/ml亮抑酶肽(Leupeptin))提取，提取液在18000g、4℃离心15min，上清液用于酶活性分析。使用BSA做标准曲线，对蛋白粗提液定量。1ml酶反应液中包括.0.2M Tris-HCl，pH7.5，8mM MgCl2，0.8mM ATP，0.1mM底物(分别为4-香豆酸，阿魏酸和咖啡酸)和25-30ul粗提液于24℃反应12分钟，然后测定A333，A346，A350的增加。每个样品做3个平行实验。结果如表1、表2、图7a和图7b所示，表明在转基因烟草的叶中4CL1酶活性提高2-4倍，而在转基因烟草的茎中4CL1酶活性提高40％-50％。在转基因烟草的叶中4CL1酶活性增加比例比较多。但是转基因烟草叶茎中4CL1酶活性的绝对增加量基本是相同的，说明在该系列的转基因烟草中，4CL1酶在转基因烟草各组织中得到大量而平均的表达。图7a和图7b中，CK为非转基因烟草植株，1-9为转基因烟草植株。
表1.转基因烟草叶中4CL1酶活性分析


表2.转基因烟草茎中4CL1酶活性分析

6、转35S-4CL1融合基因烟草的含水量、木质素及纤维素分布分析(1)转35S-4CL1融合基因烟草的形态观察在相同组织培养条件下成苗的转35S-4CL1融合基因烟草植株和非转基因烟草植株移栽入花盆中，在相同条件下培育45天，转35S-4CL1融合基因烟草植株的苗高58.5cm，根长12.5cm，叶片数52枚，非转基因烟草植株的苗高58.0cm，根长15cm，叶片数48片。通过从移栽到烟草的开花、结籽整个生长发育过程的观察及上面所测数据分析，转基因植株与空白烟草植株(非转基因植株)除形态表现正常外(图8a和图8b)，开花、结果的时间也没有明显的差异。因此，初步认为转4CL1基因能够有效调控木质素的生物合成而不影响植物的正常生长发育。
(2)转35S-4CL1融合基因烟草的根、茎、叶的含水量、木质素及纤维素含量转35S-46L1融合基因烟草的根、茎、叶的含水量、木质素及纤维素含量如表3、图9所示，表明转35S-4CL1融合基因烟草中根、茎、叶的含水量与空白相差不大，而木质素的含量分别高于空白烟草植株中的含量，而纤维素的含量变化则与之相反，这与上面对整株植株的比较结果相一致。图9中，Trans表示转35S-4CL1融合基因烟草，CK表示空白烟草(非转基因)。
表3.转基因烟草与空白烟草的含水量、木质素及纤维素含量比较

(3)转35S-4CL1融合基因烟草的木质素含量分布分析选取烟草根及茎段(每10cm一段)样品，按由低到高的顺序一次编号1，2，3，4，5，6，7。按照常规方法分别测定转35S-4CL1融合基因烟草和空白烟草的木质素及纤维素含量，结果如表4、表5、图10、表6、表7和图11所示，表明转35S-4CL1融合基因烟草的木质素含量随其高度的增加而减少，而纤维素的含量则随其高度的增加而增加，这可能是由于(1)植物中老组织的细胞比新生幼嫩组织的细胞要成熟，所以使得外源基因在组织中表达更充分些；(2)植物茎基部的木质部较发达，而新生嫩组织的木质部形成层还不成熟。由此形成木质素含量的连续降低趋势和纤维素含量的连续增长趋势。另外，在空白植株中也表现出同样的递增和递减趋势，但是在其木质素及纤维素含量上与转基因植株有明显差别表现在空白植株各部分的木质素含量相对于转基因植株各部分的木质素含量要低，而纤维素含量则高些。图10和图11中，Trans表示转35S-4CL1融合基因烟草，CK表示空白烟草(非转基因)。
表4.转35S-4CL1融合基因烟木质素含量

表5.空白烟草木质素含量


表6.转35S-4CL1融合基因烟纤维素含量

表7.空白烟草纤维素含量

实施例2、培育木质素含量降低的转基因烟草1、35S-反义4CL1融合基因载体pBan4CL构建以按照常规方法提取的杨树总DNA为模板，在引物FAN1CTCTAGATTATATGCCTGCCAAC TTTTC，FAN2CCCCGGGATGGACGCCACAATGAATCCAC的引导下，按照如下循环程序94度5min；94度30sec，55度45sec，72度90sec，30个循环；72度10min进行PCR扩增，回收、纯化PCR扩增产物，得到反义的4CL1基因片段，分别利用XbaI和SmaI酶切纯化的PCR扩增产物和PUC18，然后进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，经筛选得到阳性克隆，提取阳性克隆中的质粒，得到亚克隆载体pUan4CL。
35S-反义4CL1融合基因载体pBan4CL构建过程如图12a所示，具体步骤如下按照常规方法用XbaI/SmaI将反义4CL1基因(anti-4CL1)片段从亚克隆载体pUan4CL上切下，并与经XbaI/SmaI酶切的pBI121载体进行连接，获得含有融合基因35S-反义4CL1基因的重组载体pBan4CL。用质粒pBan4CL按照常规方法转化大肠杆菌JM109感受态细胞。在含卡那霉素的LB平板培养筛选后，提取质粒按常规方法对质粒pBan4CL进行测序，结果表明反义4CL1融合基因具有序列表中序列2的核苷酸序列，位于pBan4CL的5827bp-7463bp之间；序列表中的序列2由1637个碱基组成。
2、烟草的转化与鉴定分析按改进的An方法，直接转化农杆菌LBA4404，在Sm 125mg/L和Km 50mg/L的YEB培养基上进行筛选，并挑取单克隆提取质粒进行酶切鉴定，得到阳性克隆。
含表达载体的农杆菌LBA4404在YEB培养基(Sm 100mg/1，Km50mg/L)中28℃震荡培养到0D600＝0.6-0.8，按1％-2％的比例用新鲜的YEB培养基(Sm 100mg/L)稀释，继续培养到OD600＝0.2-0.3。将烟草无菌苗的叶片剪下，除去叶脉，切成0.5-1.0cm的小块，在菌液中浸泡2-3min，其间不断摇动，使薄片与菌液充分接触，取出，用无菌滤纸吸干表面菌液，放在表面铺一张滤纸的MS培养基上，28℃暗培养4天，将外植体转移到含100mg/L Km，500mg/L Car(羧卞霉素)的MS培养基(0.5mg/L IAA，2.0mg/L BA)上28℃继续培养，同时将未转化的组织同样处理作为负对照。每隔14天换一次培养基。当抗性芽长到1-3cm时切下，转到培养基中长茎。当茎长到3-5cm时，按照文献(王关林，方宏筠，1999，科学出版社)的方法转到含有卡那霉素和羧苄霉素到生根培养基中生根，得到再生苗。以在抗性培养基上生根的转化苗的叶片总DNA、pBan4CL质粒以及未转化的烟草叶片的总DNA为模板，在引物Fan1-TTATATGCCTGCCAACTTTTC和Fan2-ATGGACGCCACAATGAATCCAC的引导下按常规方法进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图12b所示，表明转化苗样品中产生一个约1700bp的片段，而以未转化植株为负对照的PCR产物在1.7Kb处无条带。证明反义4CL1融合基因已经整合到烟草基因组中。图12b中，+ck为pBan4CL植物二元表达载体，-ck为未转化烟草样品，M为核酸分子量标准，Trans为转35S-反义4CL1融合基因烟草样品。
3、转基因烟草的southern杂交按照常规方法提取转基因烟草和非转基因烟草的总DNA，以非转基因烟草为阴性对照，以pBan4CL植物二元表达载体为阳性对照，使用BamHI/SmaI限制性内切酶在37度进行酶解3小时，进行1％琼脂糖凝胶电泳，将电泳胶放在10倍体积的变性液(1.5M NaCl，0.5M NaOH)中震荡40min，再在10倍体积的中和液(1.5M NaCl，0.5M Tris-Cl，pH 7.0)中震荡40min，使用20×SSC进行DNA转膜过夜，用2×SSC洗膜，于80℃干燥2小时。用1ug PCR制得得反义4CL1基因作为模板DNA加蒸馏水至16ul。沸水浴10min，迅速置于冰水中5min。加入2ulDIG-HIGH PRIME，混匀。37℃保温1h，加入0.2M EDTA(PH＝8.0)，混匀。预热杂交液(地高新试剂盒自带)至42℃。预杂交30min。取DNA探针(探针用量为25ng/ml杂交液)煮沸5min，迅速放置于冰水中。将变性探针DNA加入杂交液中混匀与杂交膜一起放入杂交袋中。除去气泡，封口，42℃过夜。取出杂交膜用50ml 2×SSC，0.1％SDS清洗2次，每次5min。100ml 0.5×SSC，0.1％SDS 50℃清洗2次，每次5min。用100ml洗涤液(100ml马来酸缓冲液(0.1M马来酸，0.15M NaCl，pH 7.5)中加入0.3ml tween20)清洗1-5min，加入80ml封闭液(地高新试剂盒自带)保温30min，用20ml抗体液(地高新试剂盒自带)保温30min，用100ml洗涤液清洗2次，每次15min。用20ml检测液平衡2-5分钟，将杂交膜放在新杂交袋中，加入CSPD-ready-to use 1ml除气泡，保温4分钟。除去CSPD-ready-to use，封口，夹X光片，室温放置1小时。结果如图13所示，表明转基因烟草中出现一条1700bp的带，而未转基因烟草则没有这条带，证明该反义4CL1基因已经插入转基因烟草中。图13中，CK为非转基因烟草阴性对照，1为阳性对照pBan4CL植物二元表达载体，2-4为转35S-反义4CL1融合基因烟草。
4、转35S-反义4CL1融合基因烟草中4CL1酶活性的测定转基因烟草叶片和茎在液氮下粉碎，用提取缓冲液(0.2M Tris-HCl pH7.5，8mMMgCl2，5mM DTT，30％甘油，1ug/ml亮抑酶肽(Leupeptin))提取，提取液在18000g、4℃离心15min，上清液用于酶活性分析。使用BSA做标准曲线，对蛋白粗提液定量。蛋白标准曲线的测定值如表8所示，得到的标准曲线如图14所示。1ml酶反应液中包括0.2M Tris-HCl，pH7.5，8mM MgCl2，0.8mM ATP，0.1mM底物(分别为4-香豆酸，阿魏酸和咖啡酸)和25-30ul粗提液，于24℃分别反应5、10、15、20、25、30、35分钟，然后测定A333，A346，A350，得到如图15a和15b所示的空白烟草对照和转35S-反义4CL1融合基因烟草中4CL1酶活性曲线，表明4CL1酶在15min时的活性最高，因此，本研究在测定转基因植株与空白植株中4CL1的活性时采用反应时间为15min时的酶活性。而且转35S-反义4CL1融合基因烟草植株的4CL1酶活性明显低于空白植株的酶活性。
1ml酶反应液和25-30ul粗提液，于24℃分别反应15分钟测定A333，A346，A350的减少。每个样品做3个平行实验。结果如表9和图16所示，表明转35S-反义4CL1融合基因烟草中的4CL1酶活性明显低于空白烟草中的4CL1酶活性。图16中，CK1，CK2和CK3为空白烟草植株，Samplel-Sample6为转35S-反义4CL1融合基因烟草植株。
表8.蛋白标准曲线测定值

表9.转基因植株与空白植株中4CL1酶活性测定值

5、转355-4CL1融合基因、转355-反义4CL1融合基因烟草植株中木质素与纤维素含量分析葡萄糖标准曲线纤维素的测定是在浓酸的作用下，将纤维素降解为单糖。用葡萄糖标准曲线对所降解的单糖定量(表10)，所得到的葡萄糖标准曲线如图17a所示。
表10.葡萄糖标准曲线测定值

(1)从获得的80多株转355-反义4CL1融合基因烟草植株中取5、6株，分别检测了它们与空白烟草植株中木质素含量及纤维素含量变化，结果如图17b和图17c所示，表明转基因烟草植株的木质素含量比空白植株平均下降了19.1％，同时，纤维素含量平均升高了11.4％。
对实施例1中得到的6株转35S-4CL1融合基因烟草植株与空白烟草植株木质素与纤维素含量进行分析，结果如图18a和图18b所示，表明转35S-4CL1融合基因植株的木质素含量比空白植株平均升高了36.83％，同时，纤维素含量平均下降了23.70％。
通过对转35S-4CL1融合基因、35S-反义4CL1融合基因烟草植株的分析发现，无论正义还是反义基因转化获得的转基因植株木质素与纤维素之间均表现出相互补偿的关系。即木质素含量在下降的同时，纤维素含量则有所上升；反之亦然。
实施例3、培育木质素含量升高的转基因毛白杨7411、毛白杨741的转化将构建好的35S-4CL1植物二元表达载体pB4CL，按改进的An方法，直接转化农杆菌LBA4404，在Sm 125mg/L和Km 50mg/L的YEB培养基上进行筛选，并挑取单克隆提取质粒进行酶切鉴定，得到阳性克隆。
含表达载体的农杆菌LBA4404在YEB培养基(Sm 100mg/l，Km50mg/L)中28℃震荡培养到OD600＝0.6-0.8，按1％-2％的比例用新鲜的YEB培养基(Sm 100mg/L)稀释，继续培养到OD600＝0.2-0.3。将毛白杨741无菌苗的叶片剪下，切成0.5-1.0cm的小块，在菌液中浸泡10min，其间不断摇动，使薄片与菌液充分接触，取出，用无菌滤纸吸干表面菌液，放在毛白杨741叶片分化培养基上-MS培养基(0.1mg/LNAA，1.0mg/L BA)，28C暗培养4天，将外植体转移到含100mg/L Km，250mg/L Car(羧卞霉素)的叶片分化MS培养基(0.1mg/L IAA，1.0mg/L BA)，28℃继续培养，同时将未转化的组织同样处理作为负对照。每隔14天换一次培养基。当茎长到3-5cm时，转到含有卡那霉素和羧苄霉素的生根培养基1/2MS培养基(0.3mg/L NAA，1.0mg/LBA)中生根，结果得到再生苗14株。
2、转基因毛白杨741的southern杂交按照常规方法提取转基因毛白杨741和非转基因毛白杨741的总DNA，以非转基因烟草为对照，使用SmaI限制性内切酶在30度酶解10小时后，1％琼脂糖凝胶电泳，将电泳胶放在10倍体积的变性液(1.5M NaCl，0.5M NaOH)中震荡40min，再在10倍体积的中和液(1.5M NaCl，0.5M Tris-Cl，pH 7.0)中震荡40min，使用20×SSC进行DNA转膜过夜，用2×SSC洗膜，于80℃干燥2小时。用1ug由PCR得到的4CL1基因片段作探针，加蒸馏水至16ul，沸水浴10min，迅速置于冰水中5min。加入2ulDIG-HIGH PRIME，混匀。37℃保温1h，加入0.2M EDTA(PH＝8.0)，混匀。预热杂交液(地高新试剂盒中自带的杂交液)至42℃。预杂交30min。取DNA探针(探针用量为25ng/ml杂交液)煮沸5min，迅速放置于冰水中。将变性探针DNA加入杂交液中混匀与杂交膜一起放入杂交袋中。除去气泡，封口，42℃过夜。取出杂交膜用50ml 2×SSC，0.1％SDS清洗2次，每次5min。100ml 0.5×SSC，0.1％SDS 50℃清洗2次，每次5min。用100ml洗涤液-100ml马来酸缓冲液(Maleic acid buffer)(0.1M马来酸，0.15M NaCl，pH 7.5)中加入0.3ml tween20清洗1-5min，加入80ml封闭液(地高新试剂盒中自带)保温30min，用20ml抗体液(地高新试剂盒中自带)保温30min，用100ml洗涤液清洗2次，每次15min。用20ml检测液平衡2-5分钟，将杂交膜放在新杂交袋中，加入CSPD-ready-to use 1ml除气泡，保温4分钟。除去CSPD-ready-to use，封口，夹X光片，室温放置1小时。结果表明转基因毛白杨741中出现一条1700bp的带，而未转基因毛白杨741则没有这条带，证明该4CL1基因已经插入转基因毛白杨741中。
3、转基因毛白杨741 4CL1酶活性的测定将一年生的转基因毛白杨741叶片在液氮下粉碎，用提取缓冲液(0.2M Tris-HClpH7.5，8mM MgCl2，5mM DTT，30％甘油，1ug/ml亮抑酶肽(Leupeptin))提取，提取液在18000g、4℃离心15min，上清液用于酶活性分析。使用BSA做标准曲线，对蛋白粗提液定量。1ml酶反应液中包括.0.2M Tris-HCl，pH7.5，8mM MgCl2，0.8mMATP，0.1mM底物(4-香豆酸)和25-30ul粗提液于24℃反应12分钟，然后测定A333的增加。每个样品做3个平行实验。结果如表11所示，表明转基因毛白杨741的叶片的4CL1酶活性有所增加。
表11.转基因毛白杨741叶片中4CL1酶活性分析

4、转35S-4CL1融合基因毛白杨741叶片的木质素、纤维素分析按照文献(willis.A.lignin.Methods in Enzymology，1988，161；13-30)描述的方法测定了一年生转基因毛白杨741与空白毛白杨741植株的硫酸木质素及纤维素含量，结果如表12所示，表明35S启动的毛白杨741 4Cl1基因在稳定表达的转基因毛白杨741中，可以改变转基因毛白杨741叶片的木质素和纤维素含量。
表12.转基因毛白杨741叶片木质素、纤维素分析

实施例4、培育木质素含量降低的转基因毛白杨7411、毛白杨741的转化按改进的An方法，将实施例2中构建好的35S-反义4CL1融合基因载体pBan4CL直接转化农杆菌LBA4404，在Sm 125mg/L和Km 50mg/L的YEB培养基上进行筛选，并挑取单克隆提取质粒进行酶切鉴定，得到阳性克隆。
含表达载体的农杆菌LBA4404在YEB培养基(Sm 100mg/l，Km50mg/L)中28℃震荡培养到OD600＝0.6-0.8，按1％-2％的比例用新鲜的YEB培养基(Sm 100mg/L)稀释，继续培养到OD600＝0.2-0.3。将毛白杨741无菌苗的叶片剪下，切成0.5-1.0cm的小块，在菌液中浸泡10min，其间不断摇动，使薄片与菌液充分接触，取出，用无菌滤纸吸干表面菌液，放在毛白杨741叶片分化培养基上-MS培养基(0.1mg/LNAA，1.0mg/L BA)，28℃暗培养4天，将外植体转移到含100mg/L Km，250mg/L Car(羧卞霉素)的叶片分化MS培养基(0.1mg/L IAA，1.0mg/L BA)上28℃继续培养，同时将未转化的组织同样处理作为负对照。每隔14天换一次培养基。当茎长到3-5cm时，转到含有卡那霉素和羧苄霉素的生根培养基1/2MS培养基(0.3mg/L NAA，1.0mg/LBA)中生根，结果得到再生苗19株。
2、转基因毛白杨741的southern杂交按照常规方法提取转基因毛白杨741和非转基因毛白杨741的总DNA，以非转基因烟草为对照，使用SmaI限制性内切酶在30度酶解10小时后，1％琼脂糖凝胶电泳，将电泳胶放在10倍体积的变性液(1.5M NaCl，0.5M NaOH)中震荡40min，再在10倍体积的中和液(1.5M NaCl，0.5M Tris-Cl，pH 7.0)中震荡40min，使用20×SSC进行DNA转膜过夜，用2×SSC洗膜，于80℃干燥2小时。用1ug PCR得到的反义4CL1基因片段作探针，加蒸馏水至16ul，沸水浴10min，迅速置于冰水中5min。加入2ul DIG-HIGH PRIME，混匀。37℃保温1h，加入0.2M EDTA(PH＝8.0)，混匀。预热杂交液(地高新试剂盒中自带的杂交液)至42℃。预杂交30min。取DNA探针(25ng/ml杂交液)煮沸5min，迅速放置于冰水中。将变性探针DNA加入杂交液中混匀与杂交膜一起放入杂交袋中。除去气泡，封口，42℃过夜。取出杂交膜用50ml 2×SSC，0.1％SDS清洗2次，每次5min。100ml 0.5×SSC，0.1％SDS 50℃清洗2次，每次5min。用100ml洗涤液-100ml Maleic acid buffer(0.1M Maletic acid 0.15MNaCl，pH 7.5)中加入0.3ml tween20清洗1-5min，加入80ml封闭液(地高新试剂盒中自带)保温30min，用20ml抗体液(地高新试剂盒中自带)保温30min，用100ml洗涤液清洗2次，每次15min。用20ml检测液平衡2-5分钟，将杂交膜放在新杂交袋中，加入CSPD-ready-to use 1ml除气泡，保温4分钟。除去CSPD-ready-to use，封口，夹X光片，室温放置1小时。结果表明转基因毛白杨741中出现一条1700bp的带，而未转基因毛白杨741则没有这条带，证明反义4CL1基因已经整合到转基因毛白杨741中。
3、转35S-反义4CL1融合基因毛白杨741中4CL1酶活性的测定将一年生的转基因毛白杨741叶片在液氮下粉碎，用提取缓冲液(0.2M Tris-HClpH7.5，8mM MgCl2，5mM DTT，30％甘油，1ug/ml亮抑酶肽(Leupeptin))提取，提取液在18000g、4℃离心15min，上清液用于酶活性分析。使用BSA做标准曲线，对蛋白粗提液定量。1ml酶反应液中包括.0.2M Tris-HCl，pH7.5，8mM MgCl2，0.8mMATP，0.1mM底物(4-香豆酸)和25-30ul粗提液于24℃反应12分钟，然后测定A333的增加。每个样品做3个平行实验。结果如表13所示，表明转35S-反义4CL1融合基因毛白杨741中的4CL1酶活性明显低于空白毛白杨741中的4CL1酶活性。
表13.转基因毛白杨741与空白毛白杨741植株中4CL1酶活性测定值

4、一年生转基因毛白杨741，树干的树皮和木质部的含水量、木质素及纤维素含量测定按照文献(willis.A.lignin.Methods in Enzymology，1988，161；13-30)描述的方法测定了一年生转基因毛白杨741与野生毛白杨植株的含水量、硫酸木质素及纤维素含量，结果如表14所示，表明转基因毛白杨741木质部和树皮的含水量和木质素含量均低于野生毛白杨相应部位，转基因毛白杨741木质部的纤维素含量低于野生毛白杨的木质部，转基因毛白杨741树皮的纤维素含量高于野生毛白杨的树皮。
表14.一年生转35S-反义4CL1融合基因毛白杨741的含水量、木质素及纤维素分布分析表

序列表<160>2<210>1<211>1741<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1cgcaatggac gccacaatga atccacaaga agaattcatc tttcgctcaa aattaccaga 60catctacatc ccgaaaaacc ttcccctgca ttcatacgtt cttgaaaact tgtctaacca 120ttcatcaaaa ccttgcctga taaatggcgc gaatggagat gtctacacct atgctgacgt 180tgagctcaca gcaagaagag ttgcttctgg tctgaacaag attggtattc aacaaggtga 240cgtgatcatg ctcttcctac caagttcacc tgaattcgtg cttgctttcc taggcgcttc 300acacagaggt gccattatca ctgctgccaa tcctttctcc acccctgcag agctagcaaa 360acatgccaag gcctcgagag caaagcttct gataacacag gcttgttact acgagaaggt 420taaagatttt gcccgagaaa gtgatgttaa ggtcatgtgc gtggactctg ccccggatgg 480atgcttgcac ttttcagagc taacacaggc agacgaaaat gaagcgcctc aggtcgacat 540tagtcccgat gatgtcgtag cattgcctta ttcatcaggg actacagggt tgccaaaagg 600ggtcatgtta acgcacaaag ggctaataac cagtgttgct caacaggtag atggagacaa 660tcctaacctg tattttcaca gtgaagatgt gattctgtgt gtgctgccta tgttccatat 720ctatgctctg aattcaataa tgctctgcgg gctgagagtc ggtgccccga ttttgataat 780gccaaagttt gagattggtt ctttactggg attgattgag aagtacaagg tatctatagc 840accggttgtt ccacctgtga tgatgtcaat tgctaagtca cctgatcttg acaagcatga 900cttgtcttct ttgaggatga taaaatctgg aggggctcca ttgggcaagg aacttgaaga 960tactgtcaga gctaagtttc ctcaggctag acttggtcag ggatatggaa tgaccgaggc1020aggacctgtt ctagcaatgt gcttggcatt tgccaaggaa ccattcgaca taaaaccagg1080tgcatgtggg actgtagtca ggaatgcaga gatgaagatt gttgacccag aaacaggggc1140ctctctaccg aggaaccagc ctggtgagat ctgcatccgg ggtgatcaga tcatgaaagg1200
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<223>
<400>2ctctagatta tatgcctgcc aacttttctt tcagattctt cctcaggatc ttgccagatg 60gtgccttggg aatagcttca atgaagaaaa ctcgttttat tctcttgtag aatatcacct 120gttttgaaat atactgctta atttcatctt cggtggcctg agacttttct gatttcacta 180caaatgcaac aggaacttct cccgcatcct catctttcaa tcctactaca gcagcatcgg 240atatctctgg atgggctatt aacaaagctt cgagttcagc aggagcaacc tgaaaccctt 300tatacttgat caattccttc aatctgtcaa cgatgaaaag ctcatcatca tcatcaatgt 360agccgatatc gcctgtgtgc agccatcctt ctttgtctat tgttcttgag gttgcctcag 420ggtcattaag atatcctttc atgatctgat caccccggat gcagatctca ccaggctggt 480tcctcggtag agaggcccct gtttctgggt caacaatctt catctctgca ttcctgacta 540cagtcccaca tgcacctggt tttatgtcga atggttcctt ggcaaatgcc aagcacattg 600ctagaacagg tcctgcctcg gtcattccat atccctgacc aagtctagcc tgaggaaact 660tagctctgac agtatcttca agttccttgc ccaatggagc ccctccagat tttatcatcc 720tcaaagaaga caagtcatgc ttgtcaagat caggtgactt agcaattgac atcatcacag 780
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1.一种调控植物木质素含量的方法，是将含有4CL1基因的表达载体转化植物，得到木质素含量升高的植物；将含有反义4CL1基因的表达载体转化植物，得到木质素含量降低的植物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述4CL1基因是具有序列表中序列1的多核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述反义4CL1基因是具有序列表中序列2的多核苷酸序列。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于用于构建所述含有4CL1基因的表达载体或含有反义4CL1基因的表达载体的出发载体为Ti类质粒载体和病毒载体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述出发载体为Ti类质粒载体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述Ti类质粒载体为双元载体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述双元载体为pBI121。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述含有4CL1基因的表达载体为pB4CL；所述含有反义4CL1基因的表达载体为pBan4CL。
9.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述植物为草本植物或木本植物；所述草本植物优选为烟草，所述木本植物优选为杨树。
10.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于所述转化方法为农杆菌介导转化法、基因枪介导转化法或花粉管通道法，优选为农杆菌介导转化法。
全文摘要
本发明公开了一种调控植物木质素含量的方法。本发明所提供的调控植物木质素含量的方法，是将含有4CL1基因的表达载体转化植物，得到木质素含量升高的植物；将含有反义4CL1基因的表达载体转化植物，得到木质素含量降低的植物。本发明通过在植物细胞中用载体引入4CL1基因或反义4CL1基因，来生产木质素含量升高或降低的转基因植物特别是转基因树木，为培育木质素含量降低或升高的植物以及改良树木材性提供了一条重要的途径。
文档编号C12N15/83GK1724675SQ20041007060
公开日2006年1月25日 申请日期2004年7月22日 优先权日2004年7月22日
发明者蒋湘宁, 陆海, 赵艳玲, 陈雪梅 申请人:北京林业大学