检测ppn/mg61表达的方法及其应用的制作方法

专利名称：检测ppn/mg61表达的方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明提供了一种用于在人类细胞中对PPN/MG61的表达和活性水平进行测量的方法，通过抑制酶活性而治疗癌症的方法，以及这些方法的应用。更具体地说，本发明提供了一种用于对正常细胞和癌症细胞中的PPN/MG61的表达和活性水平进行对比测量的方法，通过抑制酶活性而治疗癌症的方法以及这些方法的应用。
背景技术：
Wnt(wingless and int homologue)是一个富含半胱氨酸的分泌糖蛋白家族，该家族已在多种脊椎动物和无脊椎动物中被鉴定。它们已被证明对于细胞命运的确定以及发育和癌症中多个阶段的细胞行为起着重要的作用。它们与细胞表面的一个特异的受体家族(Frizzled(Fz)家族)进行结合，并且激活信号通路以施加其效应，例如，作用于基因转录(Cadigan KM和Nusse R，1997；Polakis P，2000)。Wnt家族的特征之一为在该蛋白质分子的保守位点存在23或者24个半胱氨酸残基。据设想这些半胱氨酸残基可通过二硫键的形成对Wnt蛋白的折叠起着关键性作用。
使用经加工处理而表达多种Wnt的培养细胞对Wnt蛋白的加工和分泌进行了研究(Smolich BD，et al，1993；Burrus LW和McMahonAP，1995)。在多数细胞类型中Wnt的加工效率很低，这是因为存在着多种加工中间体。因此Wnt并未很好地分泌到细胞之外。大多数Wnt蛋白同一种HSP70蛋白-BiP-相结合并且留在ER中(KitajewskiJ，et al，1992)。通过果蝇缺陷试剂盒对参与Wg(果蝇同源物)信号传导的基因的筛选还鉴定了一种新的基因，其产物为Wg的加工和分泌所需(Muller H，et al，1999)。这些结果提示，Wnt的加工和分泌是复杂的，并且有多种特异性因子参与这些事件。
果蝇体节极性基因之一porcupine(porc)编码了一种多跨膜ER蛋白，该蛋白为Wg在胚中的的正常分布所需(Kadowaki T，et al，1996)。在porc突变体胚中，Wg被隔离于其合成细胞内并且不分布于周边细胞中。Wg信号组件在多细胞生物体内相当保守，并且porc类似物同样在其它物种中存在。线虫porc类似物mom-1在产Mom-2细胞中是必需的，因为Porc为Wg合成细胞所需(Thorpe CJ，et al，1997)。脊椎动物(小鼠和爪蟾)的porc类似物已在培养的细胞中被证明可修饰Wg以及小鼠Wnt蛋白的N-糖基化(Tanaka K，et al，2000)。
果蝇基因Porcupine(Porc)的人类类似物近来也已被克隆(Caricasole A，et al，2002)。人类Porcupine基因座(PPN/MG61)横跨15个内含子，在Xp11.23的基因组序列中约12kb。与其小鼠和爪蟾类似物相近，PPN/MG61以组织特异性方式表达。证据还显示，在T-细胞因子应答报告者分析中(T-cell factor-responsive reporterassay)人类PPN/MG61可影响人类Wnt7A表达构建体的活性。这些结果证明porc基因家族编码了进化上保守的ER膜蛋白，该蛋白参与了Wnt家族的加工。
根据Porc和其它膜结合的酰基转移酶超家族之间的氨基酸序列保守性，Porc有可能作为Wnt的酰基转移酶发挥功能(Hofmann K，2000)。Porc对Wnt蛋白进行酰化并且将它们锚定于ER膜之上以刺激他们的转录后N-糖基化，该过程对于分泌是必需的。在缺乏porc的情况下，Wnt蛋白并不从合成细胞中分泌，并且因此Wnt信号传导不在周边细胞中激活。
所有经生化鉴定的膜结合的酰基转移酶超家族成员都编码酶类，这些酶将有机酸转移至膜包埋的目标的羟基基团之上，在典型情况下有机酸为脂肪酸。这样的例子包括ACAT(胆固醇酰基转移酶；将脂肪酸转移至胆固醇)、Are1/2(将脂肪酸转移至酵母甾醇上)、DGAT(二酰基甘油O-酰基转移酶；将脂肪酸转移至二酰基甘油上)、蜡合成酶(将脂肪酸转移至长链醇上)、DltB(参与向磷壁酸质中掺入丙氨酸)以及AlgI(参与藻酸盐的O-酰化)(Hofmann K，2000)。该蛋白质家族的据推测的酶作用得到膜内和膜附近极性残基的保守性的支持。最显著的是，位于一个长疏水区域中的组氨酸是不变的，这使得它很可能是一个活性位点残基。
该超家族的其它成员仅在基因上被鉴定。这些成员包括果蝇基因porcupine以及其线虫类似物mom-1。Porcupine对于Wingless信号传导很关键，它影响Wingless加工以及分泌(Kadowaki T，et al，1996)。mom-1是在对内胚层分化突变体进行的基因筛选中与mom-2(一种wingless类似物)和mom-5(一种frizzled类似物)一同被鉴定的(Thorpe CJ，et al，1997)。Porcupine样蛋白在Wingless信号传导的一个功能已被确认。根据同源性它们作为一种酰基转移酶的作用方式看来似乎是可信的。但是，该底物的性质还是个待决的问题。这些观察结果并不是酰基化和Wnt信号传递间的仅有的联系。Wnt抑制剂的Dickkopf(DKK)家族的成员被发现与辅脂酶有关(Aravind L和Koonin EV，1998)。因此，暗示了由Dickkopf(DKK)蛋白介导的脱酰基化可能对Porcupine(Porc；PPN/MG61)介导的酰基化有拮抗作用。
Wnt/Frizzled受体途径涉及到一些重要的调控基因，这些基因造成同原发癌症(primary carcinomas)相关的多态性现象。在下游信号传导期间胞质β-连环蛋白(catenin)进行积累，转移进入细胞核，并且随后通过与其它转录因子形成复合物而增强基因的表达。在缺乏Wnt信号的情况下，游离的胞质β-连环蛋白被并入一种复合体，该复合体由Axin、结直肠腺瘤性息肉(adenomatous polyposis coli，APC)基因产物以及糖原合成酶激酶(GSK)-3β所组成。通过GSK-3β所进行的Axin、APC和β-连环蛋白的连接磷酸化将β-连环蛋白设定于泛素途径以及通过蛋白酶体进行的降解。
已知Wnt/β-连环蛋白信号传导在多种细胞中促进细胞的存活。Wnt信号途径还被认为同肿瘤的发育和/或发展相关联。Wnt信号通路的异常激活与多种人类癌症相关。例如，基因APC的突变对于散发的和遗传的直肠结肠肿瘤发生均是一种起始事件。APC突变体同肿瘤发生有关是因为该异常蛋白是Wnt-信号传导级联的组成部分。该蛋白质产物含有多个功能结构域，这些结构域作为β-连环蛋白结合和降解位点发挥作用。发生在β-连环蛋白的氨基末端片段的突变通常参与了依赖于磷酸化的泛素介导的降解，并且由此而使β-连环蛋白稳定。当稳定化的胞质连环蛋白积累时，该蛋白转移进入细胞核同Tcf/Lef高速泳动族(high-mobility group)转录因子相作用，这些转录因子调控诸如c-Myc这样的癌基因的表达。证据还显示，Wnt蛋白在多种癌症中被过表达和异常激活。但是，Wnt信号传导通路在癌症发生中的角色尚不清楚。
本发明的方法证明，果蝇Porcupine基因的人类类似物PPN/MG61在多种人类癌症细胞系中丰富地表达，这些癌症包括肺癌、乳腺癌、直肠结肠癌、间皮瘤、头颈癌(head and neck cancer)以及恶性黑素瘤。与之相比，在培养的正常细胞中未观察到PPN/MG61的表达。本方法进一步表明，PPN/MG61在初期的肺癌和间皮瘤组织样本中过量表达，而在对应的正常组织样本(来自同一患者)中未表达。
另外，在来自于多种癌症患者的血清中检测到了PPN/MG61的表达，这些癌症包括肺癌和甲状腺癌等等，但在正常血清样本中未检测到。
本发明的方法还表明，人类PPN/MG61的过表达对于癌细胞的存活是必需的。敲低(Knocking-down)PPN/MG61 mRNA和/或抑制PPN/MG61蛋白的酰基转移酶的活性在多种癌症中诱导了细胞凋亡。特别是在肺癌和间皮瘤中。这些数据提示，通过PPN/MG61进行的Wnt信号传导分子的脂化修饰对于该途径在肿瘤发生中的功能十分重要，并且提示PPN/MG61可能是一种激发疗效的医疗目标。因此，PPN/MG61表达的检测以及PPN/MG61酶活性的抑制对于人类癌症的分子诊断、早期检测和治疗具有广泛的可能。
发明概述本发明提供了在人类细胞、组织和包括血清和唾液在内的体液中检测PPN/MG61表达和/或酶活性以及通过抑制酰基转移酶活性而抑制过表达PPN/MG61的癌细胞生长的诊断方法。
在一个实施方案中，本发明提供了一种测量PPN/MG61的基因转录本(例如mRNA)的方法，该方法通过使用反转录PCR(RT-PCR)进行或者通过使用基于扩增(例如PCR)来直接估测DNA拷贝数的方法来实施。
在第二个实施方案中，本发明提供了一种用于测量PPN/MG61蛋白的数量或者测量表达这些蛋白的细胞的数量的方法，该方法使用任何一种广为认可的免疫结合分析而进行，这些分析包括使用同PPN/MG61相结合的单特异性抗体进行的ELISA(酶联免疫吸附分析)。
PPN/MG61的翻译蛋白水平还可以通过使用本领域的技术人员所熟知的任何手段而进行检测。这些手段包括分析性生化方法如电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层层析(TLC)、超扩散(hyperdiffusion)色谱等等。被分离的蛋白还可以根据标准方法进行测序以鉴定多态性(polymorphisms)。
在第三个实施方案中，本发明提供了一种用于对PPN/MG61的酶(O-酰基转移酶)活性进行测量和/或定量的方法，该方法通过使用其底物的转换而进行。
第一和第二细胞的PPN/MG61表达水平和/或酶活性的差异被用于检测或者诊断某种癌症、诊断某种癌症的转移可能性、监测某种癌症的预后和发展或者监测对某种癌症的治疗的疗效。这些癌症包括，肺癌、乳腺癌、直肠结肠癌、类癌瘤(carcinoid)、胃癌、神经胶质瘤、肝细胞瘤、平滑肌肉瘤、肝癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、头颈癌、阴道或睾丸癌、脑瘤、子宫颈癌、食道癌、淋巴瘤、恶性黑素瘤、间皮瘤、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肾细胞癌、眼癌、横纹肌肉瘤、肉瘤、未分化瘤以及白血病，但不限于这些。
在第四个实施方案中，本发明提供了一种用于制造检测本发明所披露的PPN/MG61表达水平和/或酶活性的试剂盒的方法，该试剂盒可被用于检测或者诊断某种癌症、诊断某种癌症的转移可能性、监测某种癌症的预后和发展或者监测对某种癌症的治疗的疗效。
在另一个实施方案中，本方法提供了一种用于在体外和体内对某种组织进行成像的方法。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法和/或本发明所披露的试剂盒，该方法和/或试剂盒用于对抑制PPN/MG61的医疗有效的化合物进行筛选。
本发明所包括的PPN/MG61特异性化合物包括，某种与PPN/MG61结合、模拟其底物并抑制其酶活性的小分子化合物，某种与PPN/MG61蛋白结合的肽或者单特异性抗体，或者同PPN/MG61的mRNA/cDNA进行杂交的核酸探针/引物，但不限于这些。
本发明的一个进一步的实施方案包括一种对需要进行治疗的受试者的PPN/MG61所介导的癌症进行治疗的方法，该方法包括以治疗有效量的PPN/MG61抑制剂化合物的药学制剂对该受试者进行给药；其中该PPN/MG61抑制剂化合物根据情况可具细胞毒性。优选的PPN/MG61抑制剂化合物包括PPN/MG61特异性化合物，但不限于此。在本发明这一方面的一个优选的实施方案中，该药学制剂被包埋入一种气囊导管(balloon catheter)或者stent之中，并且以时间依赖性方式进行释放。该实施方案进一步包括单独地给癌症患者施用所述药学制剂，或者同第二种治疗药物(例如化疗药物)和/或放疗一起施用。
附图简述

图1.PPN/MG61在人类正常和癌细胞系中的表达。在多种癌细胞系中的PPN/MG61表达的RT-PCR分析，所使用的细胞系包括非小细胞肺癌(NSCLC)细胞系(A549、H460、H838和H1703)、乳腺癌细胞系(MCF-7，BT474和HuL100)、恶性多间皮瘤细胞系(H513，H2052，H290，MS-1和H28)、结肠癌细胞系(SW480)、头颈癌细胞系(U87)、Hela细胞系、肉瘤细胞系(Mes-SA)以及正常细胞(小气管上皮细胞(SAEC)，支气管上皮细胞(NHBE))。制备了来自各个细胞类型的总RNA。
图2.PPN/MG61在人类正常和癌细胞组织样本中的表达。在初期非小细胞肺癌(NSCLC)组织样本中的PPN/MG61 mRNA水平的RT-PCR分析。总RNA从新鲜切除的肺癌和同一患者体内的同源匹配的正常肺组织中制备。
图3.初期人类间皮瘤组织样本中的PPN/MG61表达水平的RT-PCR分析。总RNA从新鲜切除的癌症患者中制备。
图4.正常人类血清和来自癌症患者的血清样本中的PPN/MG61mRNA水平的RT-PCR分析，该癌症包括NSCLC、间皮瘤、结肠癌、恶性黑素瘤、肾癌、食道癌、甲状腺癌、肉瘤、卵巢癌。总RNA从血清样本中制备并且被用于该反应。
图5.正常人类血清和来自癌症患者的血清样本中的PPN/MG61mRNA水平的RT-PCR分析。血清样本未经处理并被直接用于该反应。
图6.正常人类血清和来自癌症患者的血清样本中的PPN/MG61mRNA水平的RT-PCR分析。血清样本在被用于该反应之前经热处理。
图7.靶向于PPN/MG61的siRNA在NSCLC细胞系H460中诱导细胞凋亡。A)该H460细胞在100nM的PPN/MG61 siRNA处理后(6天后)通过使用0.5％的龙胆紫进行染色。B)对PPN/MG61siRNA所诱导的细胞凋亡进行的流式细胞仪分析(膜联蛋白V-FITC和PI染色)。从左到右，H460癌细胞分别受到100nM的非沉默(non-silencing)参照siRNA和PPN/MG61 siRNA的处理。C)PPN/MG61siRNA处理后在H460细胞中的RT-PCR和Western分析。非沉默siRNA被用作为参照。β-肌动蛋白被用作为加样量对照。
图8.靶向于PPN/MG61的siRNA在NSCLC细胞系H1703中诱导细胞凋亡并且阻断Wnt/β-连环蛋白信号传导。A)该H1703细胞在100nM的PPN/MG61 siRNA处理后(4天后)通过使用0.5％的龙胆紫进行染色。B)对PPN/MG61 siRNA所诱导的细胞凋亡进行的流式细胞仪分析(膜联蛋白V-FITC和PI染色)。从左到右，H1703癌细胞分别受到100nM的非沉默参照siRNA和PPN/MG61 siRNA的处理。C)PPN/MG61 siRNA处理后在H1703细胞中的RT-PCR和Western分析。非沉默siRNA被用作为参照。β-肌动蛋白被用作为加样量对照。
图9.靶向于PPN/MG61的siRNA在NSCLC细胞系A549中诱导细胞凋亡并且阻断Wnt/β-连环蛋白信号传导。A)对PPN/MG61siRNA所诱导的细胞凋亡进行的流式细胞仪分析(膜联蛋白V-FITC和PI染色)。从左到右，A549癌细胞分别受到100nM的非沉默参照siRNA和PPN/MG61 siRNA的处理。B)PPN/MG61 siRNA处理后在A549细胞中的RT-PCR和Western分析。非沉默siRNA被用作为参照。
图10.靶向于PPN/MG61的siRNA在间皮瘤细胞系H2052中诱导细胞凋亡并且阻断Wnt/β-连环蛋白信号传导。A)对PPN/MG61siRNA所诱导的细胞凋亡进行的流式细胞仪分析(膜联蛋白V-FITC和PI染色)。从左到右，H2052癌细胞分别受到100nM的非沉默参照siRNA和PPN/MG61 siRNA的处理。B)PPN/MG61 siRNA处理后在H2052细胞中的RT-PCR和Western分析。非沉默siRNA被用作为参照。β-肌动蛋白被用作为加样量对照。
图11.靶向于PPN/MG61的siRNA在乳腺癌细胞系MCF-7中诱导细胞凋亡并且阻断Wnt/β-连环蛋白信号传导。A)对PPN/MG61siRNA所诱导的细胞凋亡进行的流式细胞仪分析(膜联蛋白V-FITC和PI染色)。从左到右，MCF-7乳腺癌细胞分别受到100nM的非沉默参照siRNA和PPN/MG61 siRNA的处理。B)PPN/MG61 siRNA处理后在MCF-7细胞中的RT-PCR和Western分析。非沉默siRNA被用作为参照。β-肌动蛋白被用作为加样量对照。
图12.阴性参照实验靶向于PPN/MG61的siRNA在缺乏PPN/MG61表达的正常细胞培养物SAEC和NHBE中并不诱导细胞凋亡并且不阻断Wnt/β-连环蛋白信号传导。A)流式细胞仪分析(膜联蛋白V-FITC和PI染色)。从左到右，SAEC(顶部)和NHBE(底部)分别受到100nM的非沉默参照siRNA和PPN/MG61 siRNA的处理。B)PPN/MG61 siRNA处理后在正常细胞中(SAEC和NHBE)的RT-PCR和Western分析。非沉默siRNA被用作为参照。β-肌动蛋白被用作为加样量对照。
图13.在膜结合的O-酰基转移酶家族中的一个保守区域的多排列比较。所示的仅为被选择的蛋白质。物种和酶的名称为简写AT，拟南芥；BS，枯草芽胞杆菌；CE，线虫；DM，果蝇；HS，人类；MM，小鼠；PA，绿脓杆菌；SA，金黄色葡萄球菌；SC，酿酒酵母；SI，Simmondsia chinensis；TP，梅毒螺旋体；ACAT，胆固醇酰基转移酶；DGAT，二酰基甘油O-酰基转移酶；WaxSyn，蜡合成酶。
定义与另一种多聚核苷酸或者多肽具有特定百分比的“序列相同性”的一种多聚核苷酸或者多肽，指的是当进行排列比较时，对两种序列进行比较时的相同碱基或者氨基酸的百分比。序列相似性可以以多种不同的方式进行测定。为测定序列相等性，使用一些方法和计算机程序进行序列排列比较，这些方法和程序包括BLAST，可通过万维网上于http//ww.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/获得。另一种排列比较算法为FASTA，可在来自Madison，Wis.，USA，a wholly owned subsidiary ofOxford Molecular Group，Inc.的遗传学计算机组(GCG)包中获得。用于排列比较的其他方法在Methods in Enzymology，vol.266Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis(1996)，ed.Doolittle，Academic Press，Inc.，a division of Harcourt Brace & Co.，SanDiego，Calif.，USA.中有所描述。在序列中允许空位的排列比较程序特别令人感兴趣。Smith-Waterman是一种在序列排列中允许空位的算法。见，Meth.Mol.Biol.70173-187(1997)。另外，使用Needleman和Wunsch排列比较方法的GAP程序可被用于进行序列的排列比较(见，J.Mol.Biol.48443-453(1970))。使用Smith Waterman的局部同源性算法(Advances in Applied Mathematics 2482-489(1981))以测定序列相等性的BestFit程序令人感兴趣。空位产生罚分(gapgeneration penalty)一般介于1到5，通常介于2到4，在多个实施方案中为3。空位延伸罚分(gap extension penalty)一般介于0.01到0.20，并且在多种情况下为0.10。该程序的缺省参数通过待比较的输入序列进行测定。在优选的情况下，该序列相同性使用程序所决定的缺省参数进行测定。该程序可获自Genetics Computing Group(GCG)package，from Madison，Wis.，USA。该排列比较区域长度的百分比通过对最强排列中的个体序列的残基数进行计数而计算。该数除以目标或者受测(query)的序列的总残基数以得一个百分比。序列百分相等性通过对目标和受测多核苷酸序列之间的匹配残基数进行计数，并且将最强排列区域中的总匹配数除以目标或者受测序列的残基数而计算。
“PPN/MG61特异性化合物”指的是，例如，合成或者天然的氨基酸多肽、蛋白质、小的合成有机分子或者脱氧核糖核酸或者核糖核酸序列，这些化合物与PPN/MG61结合的亲和性是其它蛋白质和核酸的20倍或者更高。例如，抗PPN/MG61蛋白或者其肽片段的多克隆或者单克隆(包括经典的或者噬菌体展示)抗体，或者同PPN/MG61mRNA杂交的核酸探针，但不限于这些。优选地，PPN/MG61特异性化合物选自结合PPN/MG61(Seq ID No1，或者任何与Seq ID No1具有至少80％相同性的序列或者具有PPN/MG61活性的序列)的小分子化合物、单特异性抗体或者结合PPN/MG61的scFv以及核酸探针，所述核酸探针包括反义寡聚物、siRNA以及shRNA，这些探针应与PPN/MG61 mRNA和/或cDNA(Seq ID No2，或者任何与Seq IDNo2具有至少80％相同性的序列)杂交。特别优选地，小分子是棕榈酸盐或溴代棕榈酸盐或其他棕榈酸盐衍生物。与PPN/MG61 mRNA和/或cDNA结合的核酸序列的长度可以是6bp或6bp以上，优选6至1386bp，更优选6至50bp，更优选6至20bp，更优选6至15bp，特别优选6至10bp。优选地，与PPN/MG61 mRNA和/或cDNA结合的核酸序列与PPN/MG61基因(SEQ ID NO2)，或它的互补序列，有至少80％，优选至少90，更优选95％，最优选100％的序列同源性。或者，与PPN/MG61 mRNA和/或cDNA结合的核酸序列与PPN/MG61基因(SEQ ID NO2)的互补序列中的某段序列有至少80％，优选至少90，更优选95％，最优选100％的序列相同性。
在本发明中，除非另外说明，“PPN/MG61”表示PPN/MG61蛋白或多肽，斜体字“PPN/MG61”表示编码PPN/MG61蛋白的基因。
本文所使用的“医疗有效量”的药物组合物或其中的化合物指的是一种抑制PPN/MG61活性的量。该药物组合物一般含有介于约0.001到约100mg/kg的每剂单位(例如，药片、胶囊、粉末、注射剂、药匙量等等)。在一个实施方案中，该药物组合物含有约0.01到约50mg/kg化合物的每剂量单位，在优选的情况下为约0.05到约20mg/kg。用于测定该药物组合物的医疗有效剂量的方法在本领域中是已知的。例如，用于以该药物组合物对人类进行给药的有效剂量可从动物研究的结果中进行数学计算。进一步，本发明的化合物可以以鼻腔内形式进行给药，该给药通过适当的鼻腔内载体的局部应用，或者通过透皮路线使用透皮皮肤贴的形式进行，该透皮皮肤贴为本领域的技术人员所熟知。为以透皮递送系统的方式进行给药，该剂量给药应为连续的，而非通过剂量方案(dosage regimen)间断进行。
本文中可交替使用的术语“个体”、“受试者”、“宿主(host)”和“患者”指的是哺乳动物，包括，小鼠、猿、人类、猫、犬、马、牛、哺乳类牲畜、哺乳类竞技动物和哺乳类宠物，但不限于这些。
发明详述本发明首次提供了证据表明，可能作为酰基转移酶发挥功能的人类PPN/MG61在特定的组织病患状态下被上行调节(upregulated)。特别地，PPN/MG61在多种人类癌症中被丰富地表达，包括肺癌、乳腺癌、直肠结肠癌、间皮瘤、头颈癌和恶性黑素瘤。与之对比，在培养的正常细胞中观察不到PPN/MG61的表达。
本发明还首次提供了证据表明，人类PPN/MG61的过表达为癌细胞存活所必需。敲低PPN/MG61 mRNA和/或抑制PPN/MG61的酰基转移酶活性在多种类型癌症中诱导了细胞凋亡，特别是在肺癌中。
因此，在某种细胞中对PPN/MG61存在的检测以及定量或者在体内对PPN/MG61存在的检测提供了一种方法，该方法用于对疾病状态进行诊断或者监测，这些疾病包括，癌症和肿瘤转移，但不限于这些。因此，对PPN/MG61的上行调节或者上调的过表达进行抑制提供了一种方法，该方法用于治疗某种疾病状态，特别是由PPN/MG61的表达所介导的癌症。
本发明涉及的人类细胞选自肾上腺细胞、脑细胞、乳腺细胞、结肠细胞、上皮细胞、内皮细胞、心脏细胞、免疫细胞、肾脏细胞、肝细胞、肺细胞、卵巢细胞、胰腺细胞、前列腺细胞、皮肤细胞、脾细胞、胃细胞、睾丸细胞、甲状腺细胞、子宫细胞和脉管细胞；上皮细胞选自内皮细胞、非胶质神经细胞、结肠细胞、乳腺细胞、肾脏的近小管(proximal tubules)细胞、前列腺的平滑肌细胞、子宫的平滑肌细胞以及睾丸的平滑肌细胞；免疫细胞选自多形核白细胞、单核细胞、巨噬细胞、上皮样细胞(epitheloid cells)、巨大细胞、小神经胶质细胞、肝巨噬细胞(Kupffer cell)和肺泡巨噬细胞。
本发明进一步提供了一些组合物，这些组合物包括药物组合物，该药物组合物包括本发明的多肽、多聚核苷酸、抗体、重组载体以及宿主细胞。这些组合物可包括某种缓冲液，该缓冲液根据多肽、多聚核苷酸、抗体、重组载体以及宿主细胞所需的应用而进行选择，并且可包括其它适于目的应用的物质。本领域的技术人员可容易地选择适当的适于目的应用的缓冲液，其中很多种在本领域中是已知的。在某些情况下，该组合物可含有一种药用赋形剂，其在本领域中是已知的并且在此无需详细讨论。
本发明提供了一些特异于PPN/MG61的抗体。适当的抗体通过对某种宿主动物进行免疫而获得，该免疫使用含有目的蛋白的全部或者某一部分的肽而进行。适当的宿主动物包括，小鼠、大鼠、绵羊、山羊、仓鼠、兔等等。该蛋白质免疫原的来源可以是小鼠、人类、兔、猴等等。该宿主动物一般应为该免疫原不同的物种，例如使用人类蛋白对小鼠进行免疫，等等。
该免疫原可包括完整的蛋白或片段以及其衍生物。优选的免疫原包括该目的蛋白的全部或者一部分，其中这些残基含有存在于天然目的蛋白中的翻译后修饰，例如糖基化。包括细胞外结构域的免疫原通过本领域所指的多种方法进行生产，例如，使用传统重组方法进行的克隆基因的表达，从肿瘤细胞培养物上清中分离，等等。
为进行多克隆抗体的制备，第一个步骤为使用目的蛋白对宿主动物进行免疫化，其中该目的蛋白在优选的情况下应基本上纯净，含有低于约1％的杂质。该免疫原可包括完整的目的蛋白，其片段或者衍生物。为提高该宿主动物的免疫反应，该目的蛋白可同佐剂进行组合，其中适当的佐剂包括，明矾、葡聚糖、硫酸盐、大多聚阴离子、油和水乳液，例如福氏佐剂、福氏完全佐剂等。该目的蛋白也可同合成的载体蛋白或者合成的抗原进行偶联。可对多种宿主进行免疫化以产生多克隆抗体。这样的宿主包括，兔、豚鼠、诸如小鼠、大鼠这样的啮齿类、绵羊、山羊等等。通常以该目的蛋白对该宿主进行皮内给药，一次初始剂量后继之以一次或者多次的额外加强剂量，该加强剂量通常为两次。免疫化之后，从该宿主体内收集血液，随后将血清同血细胞分离。在所产生的抗血清中存在的Ig可进一步进行级分分离，该分离使用已知的方法进行，例如ELISA、铵盐分离、DEAE层析等等。
单克隆抗体通过传统的方法而产生。通常情况下，免疫化的宿主动物的脾脏和淋巴结提供了血细胞的来源。该血细胞通过与骨髓瘤细胞进行融合而永生化，从而产生了杂交瘤细胞。使用标准的方法对来自个体杂交瘤的培养物上清进行筛选以鉴定产生具有所需特异性的抗体的细胞。用于抗人类蛋白单克隆抗体的适当动物包括小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔等等。该抗体可从杂交瘤细胞上清或者从腹水中进行纯化，该纯化通过传统方法进行，例如，使用结合于不可溶介质的蛋白质进行的亲合层析，使用蛋白质A琼脂糖、蛋白质G琼脂糖等等进行的亲合层析。
抗体可以以单链形式产生而非正常的多聚体结构。单链抗体的设计见Jost et al.(1994)J.B.C.26926267-73和其它文献。编码该重链可变区和轻链可变区的DNA序列被连接于一个间隔区(spacer)，该间隔区编码至少约4个小中性氨基酸残基，这些氨基酸包括甘氨酸和/或丝氨酸。通过这种融合而编码的蛋白质允许保持原抗体特异性和亲合性的功能性可变区组装。
为进行体内应用，特别是用于对人类的注射，需要降低该抗体的抗原性。某种受体对抗该封闭药剂的免疫反应将会显著地降低该治疗的有效期。对抗体进行人源化的方法在本领域中是已知的。人源化抗体可以是具有转基因人类免疫球蛋白恒定区基因的动物的产物(例见，美国专利申请WO 90/10077和WO 90/04036)。或者，该目的抗体可通过重组DNA方法进行加工处理以将CH1、CH2、CH3、铰链结构域和/或框架结构域使用对应的人类序列进行替换(见，WO92/02190)。
Ig cDNA对于杂合免疫球蛋白基因构建的应用在本领域中是已知的(Liu et al.(1987)P.N.A.S.843439和(1987)J.Immunol.1393521)。从杂交瘤或者其它产生抗体的细胞中分离出mRNA并且将之用于产生cDNA。目的cDNA可使用特异性引物(美国专利号4,683,195 and 4,683,202)通过聚合酶链式反应进行扩增。或者，产生一个文库并对其进行筛选以分离目的序列。编码该抗体可变区的DNA序列随后同人类恒定区序列进行融合。该人类恒定区基因的序列可见于Kabat et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，N.I.H.publication no.91-3242。人类C区域基因从已知的克隆中可容易获得。对同种型的选择应根据所需效应器功能的指导进行，例如补体结合或者在受体依赖的细胞毒作用中的活性。优选的同种型为IgG1、IgG3和IgG4。人类轻链恒定区，κ或者λ均可被使用。随后通过传统方法对该杂合人源化抗体进行表达。
在另一个实施方案中，该抗体可以全部为人类抗体。例如，可以应用与人类抗体相同的异种人类抗体(xenogenic human antibodies)。异种人类抗体指的是与人类抗体相同的抗体，即，它们完全是人类抗体，不同之处在于它们使用非人类宿主产生，这些宿主经过遗传工程处理以表达人类抗体。例见，WO 98150433；WO 98,24893和WO99/53049，这些文献在此引为参考。
诸如Fv、F(ab′)2和Fab这样的抗体片段可通过对完整蛋白的切割而制备，例如，通过蛋白酶或者化学切割。或者设计一种截短的基因。例如，编码F(ab′)2片段的一部分的杂合基因可包括编码H链的CH1结构域和铰链区DNA序列，继之以一个翻译终止密码子，从而产生截短分子。
H和L链的J区域的共有序列可被用于设计寡核苷酸，用作为引物以向该J区域中引入限制性位点，从而用于随后的V区片段同人类C区片段的连接。C区域的cDNA可通过定点诱变而进行修饰，从而将一个限制性位点置于该人类序列的同源位置。
表达载体包括质粒、反转录病毒、YAC、EBV衍生的附加体(episomes)等等。方便的载体编码功能性的完整人类CH或者CL免疫球蛋白序列，携带有适当的限制性位点以便于任何VH或者VL序列可被方便地插入和表达。在这样的载体中，剪切通常在被插入的J区剪切供体位点和人类C区之前的剪切受体位点之间发生，该剪切同样还在人类CH外显子中的剪切区域中进行。多聚腺苷酸化和转录终止在编码区域下游的天然染色体位点处存在。所产生的杂合抗体可加入任何强启动子，包括反转录LTR，例如SV-40早期启动子、劳氏肉瘤病毒LTR和莫洛尼氏小鼠白血病毒LTR；天然Ig启动子等等。
本发明的多肽和核酸组合物可用于多种不同的用途。目的应用包括研究、诊断和治疗药物的筛选/发现/制备应用，以及医疗组合物。目的应用还包括PPN/MG61同源物的鉴定；作为新启动子元件的来源；表达调控因子的鉴定；在诸如聚合酶链式反应(PCR)这样的杂交应用中作为探针和引物；生物物种中表达模式的鉴定；用于PPN/MG61功能的细胞或者动物模型的制备；用于PPN/MG61功能的体外模型的制备。
通过多种方法可鉴定出同源物。所提供的cDNA的片段可被用作为针对来自于目标有机体的cDNA文库的杂交探针。该引物可为一个大片段，或者一个或多个小简并引物。具有序列相似性的核酸通过在低严苛性的条件下，如，50℃下以及6×SSC(0.9M氯化钠/0.09M柠檬酸钠)中的杂交并且当在55℃下以及1×SSC(0.15mM氯化钠/0.015M柠檬酸钠)中保持结合而被检测。序列的相等性可通过在严苛性条件下，如，50℃或更高温度下以及0.01×SSC(15mM氯化钠/1.5mM柠檬酸钠)中的杂交而被检测。与提供的核酸序列，例如同Seq ID No2具有基本相同的核酸，以及与该基因的遗传变化版本具有基本相同的核酸同所提供的序列在严苛的杂交条件下结合。通过使用这些探针，特别是使用DNA序列的标记探针，同源或者相关基因可被分离。
5′侧生(flanking)区域的序列可被用于包括增强子结合位点在内的启动子元件，该元件在表达基因的组织中提供了发育的调控。该组织特异性表达可被用于测定表达模式以及用于提供模拟天然表达模式的启动子。该启动子区域中天然存在的多态性可被用于测定表达中的天然变化，特别是同疾病(尤其是癌症)相关的表达变化。
或者，可将突变引入该启动子区域以在实验定义(experimentallydefined)系统中测定改变表达的作用。用于对参与转录因子的结合的特定DNA基元进行鉴定的方法在本领域中是已知的，例如，与已知结合基元的序列相似性、凝胶延迟(gel retardation)研究等。
调控序列可被用于鉴定表达的转录和翻译调控所需的顺式作用序列，特别是在不同的组织和发育的不同阶段进行的鉴定，并且可被用于鉴定调控和介导表达的顺式作用序列和反式作用序列。这样的转录和翻译控制区域可被可操作地连接于一种基因，从而促进野生型或者目的蛋白在培养细胞、胚组织、胎组织或者成体组织中的表达，并且用于基因治疗。
小DNA片段可被用作为PCR引物，杂交筛选探针等等。较大的DNA片段，即，大于100nt的片段可被用于所编码多肽的生产。对于诸如PCR这样的扩增反应，应使用一对引物。在优选的情况下所选择的引物对应产生一种至少约为50nt的扩增产物，在优选的情况下至少约为100-300nt。用于引物序列的选择的算法通常是已知的，并且可在商品化的软件包中获得。扩增引物同DNA的互补链进行杂交并且将进行相向引导。
DNA可被用于在生物物种中鉴定基因的表达。对细胞进行特定核苷酸序列的存在，例如基因组DNA或RNA的存在进行检定的方法在文献中已经被较好地确立。简而言之，从细胞样品中分离DNA或者mRNA。通过RT-PCR对该mRNA进行扩增，使用反转录酶以形成一个互补DNA链，随后使用对DNA序列特异的引物通过聚合酶链式反应进行扩增。或者，通过凝胶电泳分离该mRNA序列，将其转移至一个适当的支持物，例如硝酸纤维素、尼龙等，并且随后使用该DNA的片段作为探针进行检定。还可使用其它的方法，例如寡核苷酸连接分析、原位杂交以及对阵列于固体芯片上的DNA探针进行杂交等等。同序列进行杂交的mRNA的检测指示了样品中的基因表达。
本发明的基因序列，包括侧生启动子区域和编码区域，可通过多种本领域所知的方式进行突变，从而在启动子强度、编码蛋白序列等等中产生目的变化。具有这样的突变的DNA序列或者蛋白质产物通常基本上类似于本文所提供的序列，即，分别只在至少一个核苷酸或者氨基酸上有变化，可能在至少两个但不多于十个核苷酸或者氨基酸上有变化。该序列变化可为替换、插入、缺失或者它们的组合。这些缺失可进一步包括较大的变化，例如缺失某个区域或者外显子。其它的目的修饰包括表位标记，例如，通过FLAG系统、HA等等进行的表位标记。对于亚细胞定位的研究，可使用具有绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白。
本发明的核酸可被用于产生转基因的非人类动物或者在细胞系中产生位点特异性基因修饰。由此，在一些实施方案中，本发明提供了一种非人类的转基因动物，该动物含有一种核酸分子作为整合入该动物基因组的转基因，该核酸分子含有一种PPN/MG61序列，该序列同一种启动子可操作性地连接从而使编码PPN/MG61的核酸分子在细胞或者动物中表达。这些转基因动物可通过同源重组产生，其中内源基因座有所改变。或者，将一种核酸分子随机地整合进入该基因组。用于稳定整合的载体包括质粒、反转录病毒和其它动物病毒，YAC等等。
经修饰的细胞或者动物可用于基因功能和调控的研究。例如，可在宿主的天然基因中产生一系列小规模缺失和/或替换以测定不同的外显子在癌症发生、信号传导等中的作用。令人产生兴趣的是这些基因对于构建用于癌症的转基因动物模型的应用，其中该蛋白的表达特异性地降低或者缺乏。具体的目的构建体包括反义构建体、小干扰RNA(siRNA)、短发卡RNA(shRNA)，该RNA阻断PPN/MG61的表达；显性隐性突变的表达；以及基因的过表达。当引入某个序列时，被引入的序列可以是宿主动物的天然基因序列的全部或者部分，或者是对于宿主动物来说是外源序列的全部或者部分，例如本发明的人类序列。诸如Lac Z这样的可检测标记可被引入该基因座，其表达的上调将导致表型上易于检测的变化。
还可以在一些细胞或者组织中表达基因，例如PPN/MG61基因或其变体，其表达水平在所述细胞或者组织中的正常情况下不存在，或者在发育的异常时间内表达。还可以产生一些宿主细胞(包括转基因动物中的宿主细胞)，这些细胞含有一种异源核酸分子，该分子编码一种多肽，该多肽具有调控内源PPN/MG61启动子或者其它转录调控区域的功能。
用于同源重组的DNA构建体应含有人类基因的至少一部分或者宿主动物天然基因的至少一部分，其中该基因具有所需的遗传修饰，并且含有目标基因座的同源区域。用于进行随机整合的DNA构建体不需要含有介导重组的同源区域。为方便起见，包括入用于阳性和阴性选择的标记。用于通过同源重组而产生具有目的基因修饰的方法在本领域中是已知的。
对于胚性干细胞(ES)，可利用ES细胞系或者可从宿主中新鲜获得胚细胞，宿主的例子如小鼠、大鼠、豚鼠等。这样的细胞在适当的纤维原细胞饲养(fibroblast-feeder)层上进行生长或者在存在白细胞抑制因子(LIF)的情况下生长。当ES或者胚细胞已经转化时，它们可被用于产生转基因动物。在转化之后，这些细胞可被铺于适当培养基的饲养层上。含有该构建体的细胞可通过使用选择培养基进行检测。在使这些克隆生长的充分时间后，将这些细胞检出并且分析是否发生该构建体的同源重组或者整合。阳性克隆可随后被用于胚操作和胚泡注射。胚泡获自4到6周大的排卵过度的雌体。用胰酶处理ES细胞，并且将经修饰的细胞注射进入该胚泡的囊胚腔。注射之后，将该胚泡返回伪孕雌体的各个子宫角。随后使该雌体足月分娩并对所产生的后代进行该构建体的筛选。通过提供不同表现型的胚泡和遗传修饰的细胞可容易地检测杂合(chimeric)后代。
对该杂合动物进行针对修饰基因的筛选并且将具有该修饰的雌体和雄体进行交配以产生纯合后代。如果该基因变化在发育的某些点上致死，可获得组织或者器官作为同种异体或者同类系的移植物或者移植体，或者获得体外培养物。该转基因动物可以是任何非人类的哺乳类动物，例如实验室动物、家养动物等等。该转基因动物可被用于功能性研究、药物筛选等等，例如，对某种作用于PPN/MG61活性的候选药物的效果进行测定。
本发明还提供了一种诊断疾病状态的方法，特别是诊断癌症的方法，该方法基于在目标生物样本中所观察到的PPN/MG61水平和/或活性以及/或者PPN/MG61多核苷酸的水平而进行。本文所使用的样本包括生物液体，例如血液、脑脊髓液、眼泪、唾液、淋巴液、渗出液、乳腺导管灌洗液(breast ductal lavage fluid)、精液等等；细胞；器官或者组织培养物所产生的液体；肿瘤活组织检查样本；粪便样品；以及从生理组织中抽提的液体。所述样本还包括这些液体的衍生物和组分。对于固体组织可对细胞进行解离，或者对组织切片进行分析。在替代的情况下可制备这些细胞的裂解物。
本发明的检测方法可以定性或者定量。因此，本文所使用的术语“检测”、“测定”等等指的是定性和定量测定，并且包括“测量”。
本发明的检测方法包括用于在生物样品中检测PPN/MG61多肽的方法、在生物样品中检测PPN/MG61 mRNA的方法以及在生物样品中检测PPN/MG61的酶活性的方法。
在一些实施方案中，检测方法提供了在生物样品(例如血液、血清)中对癌细胞进行检测的方法。根据实施例中的描述，人类PPN/MG61 mRNA水平在特定癌症中有所提高，例如在肺癌、乳腺癌、直肠结肠癌和间皮瘤中。由此，同正常(非癌)组织相比较，检测到编码PPN/MG61的mRNA的水平升高，则检测到生物样品中存在癌组织。
这些检测方法可作为试剂盒的一部分提供。因此，本发明进一步提供了用于在生物样品中检测PPN/MG61多肽或PPN/MG61多聚核苷酸的存在和水平的试剂盒。使用这些试剂盒的程序方法可被临床实验室、实验性实验室、医学从业人员和个人所实施。本发明的用于检测PPN/MG61多肽的试剂盒包括可特异性结合于PPN/MG61的一个部分(moiety)，包括PPN/MG61特异性化合物或者抗体，但不限于这些。本发明的用于检测PPN/MG61多聚核苷酸的试剂盒包括特异性与PPN/MG61多聚核苷酸杂交的一个部分。
在一些实施方案中，本发明的用于检测PPN/MG61寡核苷酸的试剂盒，例如检测编码PPN/MG61的mRNA的试剂盒包括一对核酸，其作为“正向”和“反向”引物发挥功能，这些引物特异性地对编码PPN/MG61的mRNA的cDNA拷贝进行扩增。这些“正向”和“反向”引物作为一对被分离的核酸分子提供，各长约10到200个核苷酸，该引物对中的第一核酸分子含有至少10个连续核苷酸的序列，该序列同SEQ ID NO02中的一段核酸序列具有100％的核苷酸相同性，该引物对中的第二核酸分子含有一个至少10个连续核苷酸的序列，该序列同SEQ ID NO02中的一段核酸序列的反向互补序列具有100％的核苷酸相同性，其中该第二核酸分子的序列在SEQ ID NO02中位于第一核酸分子的核酸序列的3′。该引物核酸分子可使用任何已知的方法进行制备，例如，自动合成等等。SEQ ID NO3，4，5，6，7，8，9，10，11和12是正向”和“反向”引物的一些例子。
本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒含有如上所述的一对核酸。这些核酸存在于适当的贮存介质中，例如缓冲溶液，在典型情况下贮存于适当的容器中。该试剂盒包括该核酸对，并且可进一步包括一种缓冲液、用于聚合酶链式反应(PCR)的试剂(例如脱氧核苷三磷酸(dATP，dTTP，dCTP，和dGTP)、热稳定的DNA聚合酶、反转录酶、适于PCR的缓冲液，含有离子Mg2+的溶液(例如MgCl2)以及其它本领域的技术人员所熟知的用于进行PCR，或者反转录PCR(RT-PCR)或者实时RT-PCR的成分)。该试剂盒进一步包括该试剂盒的使用指导，该指导可以以多种形式提供，例如印刷资料或者在光盘上等等。该试剂盒可进一步包括从生物样品(例如，血液、血清样本、活组织切片样本等等)中抽提DNA所必需的试剂，以及包括产生mRNA的cDNA拷贝的试剂。根据下文更为详尽的描述，该试剂盒可用于诊断应用。被分离的核酸分子对在扩增反应(例如，PCR、RT-PCR或者实时RT-PCR)中作为引物使用。
在一些实施方案中，该第一和/或第二核酸分子含有一种可检测标记物。适当的标记物包括荧光染料，例如异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、得克萨斯红、藻红蛋白、别藻蓝蛋白、6-羧基荧光素(6-FAM)、2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基-2′，4，4′，5，7，7′-六氯羧基荧光素(HEX)、5-羧基荧光素(5-FAM)或者N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)，还包括放射活性标记物，例如32P、35S、3H等等。该标记物可为一种双程系统(two stage system)，其中该扩增DNA被连接于生物素、半抗原等，它们具有一种高亲合性结合配对分子，例如亲合素、特异性抗体等等，其中该结合配对分子同一种可检测标记物连接。该标记物可同引物之一或者两者均连接。或者，在扩增中所使用的核苷酸合并物(pool)被标记，从而将该标记物引入扩增产物。
试剂盒可根据情况提供附加的组分，这些组分可用于所述方法，所述组分包括缓冲液、显色试剂、标记物、反应表面、检测手段、参照样品、标准物、指导说明以及解释信息，但不限于这些。
当试剂盒提供对PPN/MG61多肽的检测时，该试剂盒包括一种或者多种特异于该PPN/MG61的抗体。在一些实施方案中，特异于该PPN/MG61的抗体受到可检测的标记。在其它的实施方案中，特异于该PPN/MG61的抗体未受标记；而是提供了第二种可检测标记的抗体，该抗体可同特异于该PPN/MG61的抗体(“第一”抗体)结合。该试剂盒可进一步包括封闭试剂、缓冲液以及用于显色的试剂和/或用于检测可检测标记物的试剂。该试剂盒可进一步包括使用指导、参照以及解释性信息。
当试剂盒提供对PPN/MG61酶活性的检测时，该试剂盒包括一种底物，该底物在受到PPN/MG61作用时提供一种可检测的产物。该试剂盒可进一步包括可检测标记物显色和检测所必需的试剂。该试剂盒可进一步包括使用指导、参照以及解释性信息。
本发明进一步提供了用于在生物样品中检测PPN/MG61多肽的存在和/或测量PPN/MG61多肽的水平的方法，该方法使用一种PPN/MG61特异性抗体。该方法一般包括a)将该样品同特异于PPN/MG61多肽的抗体进行接触；以及b)检测该抗体同该样品分子之间的结合。
当于适当的参照进行对比时，PPN/MG61特异性抗体的特异性结合的检测是在该样品中存在PPN/MG61多肽的迹象。适当的参照包括已知不含有PPN/MG61多肽的样品；以及一种同非特异于PPN/MG61的抗体相接触的样品，例如同抗特异性抗体(anti-idiotypeantibody)接触的样品。多种用于检测特异性抗体抗原作用的方法在本领域中是已知的并且可被用于该方法，该检测方法包括，标准的免疫组织化学方法、免疫沉淀、酶法免疫分析以及放射性免疫，但不限于这些。通常情况下该PPN/MG61特异性抗体应直接或者间接地进行可检测标记。直接标记包括放射性同位素；具有可检测产物的酶(例如，荧光素酶、β-半乳糖苷酶等等)；荧光标记(例如，异氰酸荧光素，罗丹明、藻红蛋白等等)；荧光发射金属，例如152Eu或者镧系的其它金属，这些金属通过诸如EDTA这样的金属螯合基团连接于抗体；化学发光化合物，例如发光氨、isoluminol、acridinium盐等等；生物发光化合物，例如虫荧光素、绿色荧光蛋白等等。
该抗体可连接(偶联)于某种不溶支持物，例如聚苯乙烯平板或者微球。间接标记包括特异于PPN/MG61特异性抗体的二抗，其中该二抗根据上文描述进行标记；以及特异性结合分子对的成员，例如生物素-亲合素等等。该生物学样品可同一种固体支持物或者载体之上的固定物进行接触，例如硝酸纤维素，这些支持物或者载体能够固定化细胞、细胞团或者可溶蛋白。该支持物可随后使用适当的缓冲液进行洗涤，随后与PPN/MG61特异性抗体进行接触，该抗体经过可检测标记。检测方法在本领域中已知，并且应经选择适合于该可检测标记所发射的信号。通常与适当的参照和适当的标准进行对比以完成检测。
本发明进一步提供了一些方法，这些方法适于在生物样品中检测PPN/MG61酶活性的存在和/或测量PPN/MG61酶活性的水平。这些方法一般涉及到a)将该样品同一种底物相接触，该底物在受到PPN/MG61作用时产生可检测的产物；以及b)检测该酶反应的产物。
任何酰化化合物均适于本分析的应用，所述酰化化合物在通过PPN/MG61的酰基转移酶活性进行酰基裂解的情况下，导致吸收度、荧光或者其它适于检测的物理性质变化。
本发明进一步提供了一些方法，这些方法用于在生物样品中检测PPN/MG61 mRNA的存在。这些方法可被用于，例如，对影响PPN/MG61基因表达的某种化合物进行直接或者间接估测。这些方法一般包括a)在允许杂交的条件下将该样品同本发明的PPN/MG61多聚核苷酸进行接触；以及b)对可能存在的杂交进行检测。
在同适当的参照进行对比的情况下对杂交的检测是PPN/MG61多聚核苷酸存在的显示迹象。适当的参照包括，例如，已知不含有PPN/MG61 mRNA的样品，以及使用与PPN/MG61 mRNA“同义”的标记多聚核苷酸。允许杂交的条件在本领域中已知，并且在上文中有更详尽的描述。使用经标记的PPN/MG61多聚核苷酸可以通过任何已知的方法完成检测，这些方法包括，原位杂交、PCR、RT-PCR、实时RT-PCR和“Northern”或者RNA印迹，或者这些方法的组合，但不限于这些。用于这些多聚核苷酸的多种标记物和标记方法在本领域中是已知的，并且可被用于本发明的分析方法。特异性杂交可通过与适当的参照进行对比而进行测定。
在一些实施方案中，这些方法涉及到在生物样品中产生某种mRNA的一个cDNA拷贝，并且使用一对分离的核酸作为扩增反应(例如，PCR)中的正向和反向引物对该cDNA进行扩增。该核酸对中的各个核酸分子长度介于10到200核苷酸之间，该引物对中的第一核酸分子含有一个至少10个连续核苷酸的序列，该序列同SEQ IDNO02中的一段核酸序列具有100％的核苷酸相同性，该引物对中的第二核酸分子含有一个至少10个连续核苷酸的序列，该序列同SEQID NO02中的一段核酸序列的反向互补序列具有100％的核苷酸相同性，其中该第二核酸分子的序列位于SEQ ID NO02中第一核酸分子的核酸序列的3’。该引物核酸分子使用任何已知的方法进行制备，例如，自动合成等等。SEQ ID NO3，4，5，6，7，8，9，10，11和12是正向”和“反向”引物的一些例子。
使用PCR扩增的方法可对于单一细胞中的DNA进行，尽管使用至少约105个细胞比较方便。聚合酶链式反应的使用的描述见Saiki etal.(1985)Science 239487，当前方法的综述可见于Sambrook，et al.Molecular CloningA Laboratory Manual，CSH Press 1989，pp.14.2-14.33。在该扩增反应中可含有一种可检测标记物。适当的标记物包括荧光染料，例如异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、得克萨斯红、藻红蛋白、别藻蓝蛋白、6-羧基荧光素(6-FAM)、2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基-2′，4，4′，5，7，7′-六氯羧基荧光素(HEX)、5-羧基荧光素(5-FAM)或者N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)，还包括放射活性标记物，例如32P、35S、3H等等。该标记物可为一种双程系统(two stagesystem)，其中该扩增DNA被连接于生物素等，它们具有一种高亲合性结合配对分子，例如亲合素、特异性抗体等等，其中该结合配对分子同一种可检测标记物连接。该标记物可同引物之一或者两者均连接。或者，在扩增中所使用的核苷酸合并物被标记，从而将该标记物引入扩增产物。
多种方法可用于在特定的组织中测定某种基因或者蛋白质的表达水平。可通过多种方法进行诊断从而在患者的样品中测定正常或者异常的PPN/MG61的存在与否或者量的改变。例如，检测可利用对细胞或者组织切片进行染色根据传统方法而实施，该染色使用标记抗体进行。细胞受到透化处理以对胞质分子染色。向该细胞样品中加入目的抗体，并且保温足够的时间以允许对表位的结合，该时间通常为约10分钟。该抗体可使用放射性同位素、酶、荧光剂、化学发光物或者其它用于直接检测的标记。或者，使用第二抗体或者试剂扩增该信号。这样的试剂在本领域中为人所熟知。例如，第一抗体可同生物素进行偶联，加入同辣根过氧化物酶偶联的亲合素作为第二试剂。或者，第二抗体偶联于一种荧光化合物，例如荧光素、罗丹明、得克萨斯红等等。最终的检测使用一种在过氧化物酶存在下发生颜色变化的底物。结合抗体的存在与否可通过多种方法进行检测，这些方法包括对分散细胞的流式细胞仪、显微镜、放射显影、闪烁计数等等。
在替代的情况下可以着眼于PPN/MG61基因的表达。可以进行生化研究以测定在编码区域或者控制区域的序列多态性是否同疾病相关。同疾病相关的多态性可能包括影响蛋白质活性的基因缺失或者截短，改变表达水平的突变等等。
可能影响基因的表达水平的启动子序列或者增强子序列的变化可通过本领域中已知的多种方法与正常的等位基因表达水平进行比较。用于测定启动子或者增强子强度的方法包括对被表达的天然蛋白的定量；将多种控制元件插入具有报告基因的载体，该报告基因的例子如氯霉素乙酰基转移酶、荧光素酶、β-半乳糖苷酶等等，该基因可提供方便的定量；等等。
用于对特异性序列，例如对疾病相关的多态性进行核酸分析的方法有很多。在可以获得大量DNA的情况下，直接使用基因组DNA。或者，将该目标区域克隆进入适当的载体并且增长至足以用于分析的量。表达该基因的细胞可被用作为mRNA的来源，该mRNA可被直接分析或者进行反转录成为cDNA以用于分析。该核酸可以通过传统的方法，例如PCR，进行扩增以提供足以用于分析的量。聚合酶链式反应的使用的描述见Saiki et al.(1985)Science 239487，当前方法的综述可见于Sambrook，et al.Molecular CloningA LaboratoryManual，CSH Press 1989，pp.14.2-14.33。或者，在本领域中已知多种方法可以利用寡核苷酸连接作为检测多态性的方法，例如Riley et al.(1990)，Nucl.Acids Res.182887-2890；以及Delahunty et al.(1996)，Am.J Hum.Genet.581239-1246。
在该扩增反应中可含有一种可检测标记物。适当的标记物包括荧光染料，例如异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、得克萨斯红、藻红蛋白、别藻蓝蛋白、6-羧基荧光素(6-FAM)、2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基-2′，4，4′，5，7，7′-六氯羧基荧光素(HEX)、5-羧基荧光素(5-FAM)或者N，N，N′，N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)，还包括放射活性标记物，例如32P、35S、3H等等。该标记物可为一种双程系统(two stagesystem)，其中该扩增DNA被连接于生物素等，它们具有一种高亲合性结合配对分子，例如亲合素、特异性抗体等等，其中该结合配对分子同一种可检测标记物连接。该标记物可同引物之一或者两者均连接。或者，在扩增中所使用的核苷酸合并物被标记，从而将该标记物引入扩增产物。
核酸分子，例如经扩增或者克隆的片段，通过本领域已知的多种方法进行分析。核酸可以通过双脱氧或者其它方法进行测序，并且将碱基序列同野生型序列相比较。通过Southern印迹、点印迹等方法与变化序列的杂交也可已被用于测定其存在。参照组以及多种变化序列与固定化于固体支持物的寡核苷酸探针阵列的杂交模式可被用作为检测变化序列的存在的手段。单链构象多态性(SSCP)分析、变性梯度凝胶电泳(DGGE)以及凝胶基质中的异源双链分析可被用于根据电泳迁移率而检测由DNA序列变化所导致的构象变化。或者，当多态性产生或者破坏了某一限制性内切酶的识别位点的情况下，使用该内切酶消化该样品并且对该产物大小进行分级以测定是否该片段被消化。分级可通过凝胶或者毛细管电泳而进行，特别是丙烯酰胺或者琼脂糖凝胶。
在该基因中对突变的筛选可根据该蛋白的功能性或者抗原性特征而进行。蛋白质截短分析可被用于检测可影响该蛋白质生物活性的缺失。筛选中可使用多种设计用于检测蛋白质多态性的免疫分析。在多种不同的遗传突变导致某种特定的疾病表现型的情况下，功能性蛋白质分析已证明是有效的筛选工具。该编码蛋白的活性可通过与野生型蛋白质的比较而测定。
本发明的针对表达水平的诊断方法在典型的情况下涉及到目的样品的核酸丰度同参照值的比较，从而测定任何相对变化，其中该变化可被定量和/或定性测定，随后将该变化同某种异常的表达模式的存在与否相关联。本领域的技术人员已知多种在样品中测定核酸丰度的不同方法，其中令人感兴趣的特定方法包括在Pietu et al.，Genome Res.(June 1996)6492-503；Zhao et al.，Gene(Apr.24，1995)156207-213；Soares，Curr.Opin.Biotechnol.(October 1997)8542-546；Raval，J.Pharmacol Toxicol Methods(November 1994)32125-127；以及Chalifour et al.，Anal.Biochem(Feb.1，1994)216299-304中所描述的方法。
本发明提供了用于对调控PPN/MG61酶活性的药物进行鉴定的筛选方法，提供了用于对在细胞中调控PPN/MG61多肽水平的药物进行鉴定的筛选方法；以及提供了用于对在细胞中调控PPN/MG61mRNA水平的药物进行鉴定的筛选方法；用于对调控PPN/MG61从真核细胞中的释放的药物进行鉴定的筛选方法。在一些实施方案中，该分析为无细胞分析。在其它的实施方案中，该分析为基于细胞的分析。
本文所使用的术语“调控”包括“提高”和“降低”。在一些实施方案中，受到关注的是抑制PPN/MG61活性的药物，以及/或者在细胞中降低PPN/MG61多肽的水平，和/或在细胞中降低PPN/MG61mRNA的水平以及/或者降低PPN/MG61从真核细胞中的释放的药物。这样的药物作为治疗癌症的候选物受到关注。在其它的实施方案中，受到关注的是提高PPN/MG61活性的药物，这样的药物可用于治疗某些失调，这些失调可通过提高血管发生而进行治疗，例如，局部缺血症状。
术语“候选药物”、“药物”、“物质”和“化合物”在本文可互换使用。候选药物包括多种化学类别，在典型情况下为合成、半合成或天然存在的有机或者无机分子。候选药物可为有机小化合物，其分子量高于50并且低于约2,500道尔顿。候选药物可含有一些功能性基团，这些基团是与蛋白进行结构作用所必需的，特别是氢键，并且可包括至少一种氨基、羰基、羟基或者羧基基团，并且可含有至少两种这些功能性化学基团。该候选药物可含有碳环或者杂环结构和/或芳香族或者多芳香族结构，这些结构中受到一种或者多种上述功能性基团的取代。候选药物同样可从生物分子中寻求，这些分子包括肽、糖、脂肪酸、固醇、嘌呤、嘧啶，这些分子的衍生物、结构类似物或者它们的组合。
候选药物可从多种来源中获得，这些来源包括合成或者天然化合物的库(libraries)。例如，多种手段可被用于大量有机化合物和生物分子的随机合成或者定向合成，这包括随机寡核苷酸和寡肽的表达。或者，可获得或者容易地产生以细菌、真菌、植物和动物抽提物的形式存在的天然化合物的库。另外，天然或者合成产生的库和化合物可通过传统的化学、物理和生物化学方法进行方便地修饰，并且可被用于产生组合库。已知的药学试剂可被用于直接或者随机的化学修饰，例如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等等，从而产生结构类似物。
在筛选分析是一种结合分析的情况下，一种或者多种这些分子可被连接于一种标记物，其中该标记物可直接或者间接提供一种可检测信号。多种标记物包括放射性同位素、荧光剂、化学发光物、酶、特异性结合分子、颗粒，例如磁性颗粒，等等。特异性结合分子包括分子对，例如生物素和链亲合素、地高辛和抗地高辛等等。对于特异性结合成员，互补性的成员在正常情况下使用可根据已知程序进行检测的分子进行标记。
该筛选分析中可包括多种其它试剂。这些试剂包括的例子如盐、中性蛋白(例如白蛋白)、去污剂等等，这些试剂被用于辅助蛋白质-蛋白质的最佳结合和/或降低非特异性或者背景相互作用。可以使用一些提高分析效率的试剂，例如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂、抗微生物药物等等。这些成分的混合物可以以任何可以产生必需结合的次序进行添加。保温在任何适当的温度下进行，典型情况下介于4℃到40℃。保温耗时可针对最佳活性进行选择，但也可以经优化而辅助迅速的高通量筛选。典型情况下0.1到1小时应当是充足的。
本发明提供了一些方法对调控本发明的PPN/MG61多肽的酶活性的药物进行鉴定。该术语“调控”包括被测PPN/MG61活性同适当参照相比有所提高或者降低。
上文提及的方法一般包括a)将测试药物与含有PPN/MG61多肽的样品进行接触；以及b)在存在该物质的情况下对PPN/MG61的酰基转移酶活性进行分析。同适当的参照的PPN/MG61活性(例如，在缺乏被测物质的情况下含有PPN/MG61多肽的样品)相比PPN/MG61活性的降低显示该物质调控PPN/MG61的酶活性。
本文所使用的“调控PPN/MG61多肽的酰基转移酶活性的药物”描述的是任意的分子，例如合成或者天然的有机或者无机化合物、蛋白质或者药物，这些分子根据本文所述具有改变调控PPN/MG61多肽的酰基转移酶活性的能力。一般情况下，多种分析混合物可在不同的药物浓度下进行平行作用以获得对不同浓度的不同反应。在典型的情况下，一种浓度可作为阴性参照，即，在零浓度或者低于检测水平的浓度。酰基转移酶活性可以使用本领域所知的任何激酶分析进行测量。
在通过酰基转移酶活性对酰基的裂解作用下，产生吸光度、荧光或者其它易于检测的物理性质的任何酰化化合物均适于本分析的应用。
在特定的实施方案中，使用了一种含35S标记的物质。35S的释放使用任何适当的分析进行测量，例如闪烁计数等等。
在其它实施方案中，该物质含有一种酰化部分，一旦酰基通过酰基转移酶的作用而被释放，该部分便提供一种可检测信号。酰基转移酶活性可通过测量荧光进行检测。该分析可特别适用于高通量形式(high-through-put format)。
同适当的参照组相比较，调控PPN/MG61多肽的酰基转移酶活性的药物将活性提高或者降低了至少约10％，至少约15％，至少约20％，至少约25％，较为优选的情况下至少约50％，更为优选的情况下至少约100％或者两倍，更为优选的情况下至少约5倍，更为优选的情况下至少约10倍或更多。
在理想程度上提高或者降低PPN/MG61多肽的酰基转移酶活性的药物可经选择用于进一步研究，并且对细胞可用性(availability)、细胞毒作用、生物相容性等等进行估测。
在某些实施方案中，降低PPN/MG61多肽的酰基转移酶活性的药物受到特别关注。在产生疗效的各种情况下，对酰基转移酶活性的最大抑制通常不是必需的，或者甚至并不理想。降低PPN/MG61多肽的酰基转移酶活性的药物可用于降低肿瘤细胞所刺激的Wnt信号传导和/或血管发生，并且由此而可被用于治疗癌症。
在某些实施方案中，提高PPN/MG61多肽的酰基转移酶活性的药物受到特别关注。提高PPN/MG61多肽的酰基转移酶活性的药物可用于提高血管发生，并且由此而可被用于治疗局部缺血症状。
基于细胞的方法包括对调控PPN/MG61 mRNA水平和/或PPN/MG61多肽水平的药物进行检测的方法以及对调控PPN/MG61从真核细胞中释放的药物进行检测的方法。
对候选药物可能对分析中使用的细胞产生的任何细胞毒作用进行分析，该分析使用众所周知的分析而进行，例如台盼蓝染色排除，MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基-2H-四唑溴化物)分析等等。不表现出细胞毒活性的药物被视作为候选药物。
分析中使用的细胞通常为哺乳细胞，这些细胞包括人类细胞，但不限于此。这些细胞可为原代细胞培养物或者为永生化细胞系。
多种基于细胞的分析可被用于对调控PPN/MG61 mRNA水平的药物进行鉴定以及对调控PPN/MG61从真核细胞中的释放的药物进行鉴定，这些方法使用，例如，以含有编码PPN/MG61的cDNA的构建体转化哺乳类细胞从而使该cDNA过表达，或者，在替代的情况下，使用一种含有PPN/MG61启动子的构建体，该启动子同一种报告基因连接。
因此，本发明提供了一种用于鉴定药物，特别是鉴定生物活性药物的方法，该药物在细胞中调控PPN/MG61表达水平，该方法包括将待测的候选药物同一种细胞进行组合，该细胞含有一种编码PPN/MG61多肽的核酸；以及测定所述的药物对于PPN/MG61表达的效果。PPN/MG61表达水平的“调控”包括，同缺乏该待测药物的参照组相比，提高或者降低PPN/MG61 mRNA水平和/或提高或者降低该PPN/MG61多核苷酸所编码的PPN/MG61多肽水平。与未加入药物的参照相比较，在将该细胞与待测候选药物进行接触后，在PPN/MG61 mRNA和/或PPN/MG61多肽水平(即含量)上提高或者降低约1.25倍，通常至少约1.5倍，通常至少约2倍，通常至少约5倍，通常至少为约10倍或者更多是该药物调控了PPN/MG61表达的指示迹象。
受到测量的PPN/MG61 mRNA和/或PPN/MG61多肽可以由内源PPN/MG61多核苷酸编码或者可以由包含于重组载体并且引入该细胞的PPN/MG61多核苷酸编码，即，该PPN/MG61 mRNA和/或PPN/MG61多肽可被外源PPN/MG61多核苷酸编码。例如，一个重组载体可含有经分离的PPN/MG61转录调控序列，例如启动子序列，该序列与一种报告基因(例如，β-半乳糖苷酶、CAT荧光酶或者其它易于进行表达分析的基因)可操作地连接。在这些实施方案中，用于对在细胞中调控PPN/MG61表达水平的药物进行鉴定的方法包括将待测的候选药物同一种细胞相组合，该细胞含有一种核酸，该核酸含有一种PPN/MG61转录调控元件，该元件同报告基因可操作地连接；以及测定所述的药物对于该报告基因表达的效果。重组载体可含有一种被分离的的PPN/MG61转录调控序列，例如启动子序列，该序列与编码PPN/MG61多肽的序列可操作地连接，或者该转录调控序列同某种PPN/MG61融合蛋白的编码序列可操作地连接，该融合蛋白含有PPN/MG61多肽，该PPN/MG61多肽与可以辅助检测的多肽进行融合。在这些实施方案中，该方法包括，将待测的候选药物同一种细胞相组合，该细胞含有一种核酸，该核酸含有一种PPN/MG61转录调控元件，该元件同PPN/MG61多肽编码序列可操作地连接；以及测定所述的药物对于PPN/MG61表达的效果，该测定可通过测量该细胞所产生的PPN/MG61 mRNA、PPN/MG61多肽或者PPN/MG61融合多肽的量而进行。
基于细胞的分析一般包括的步骤有将该细胞同待测药物进行接触、形成测试样品以及在适当的时间后估测该药物对PPN/MG61表达的效果。参照样品含有相同的细胞但不添加入候选药物。在该测试样品和参照样品中测量PPN/MG61的表达水平。在该测试样品和参照样品的PPN/MG61表达水平之间进行比较。例如，当使用产生PPN/MG61的表达的构建体转化哺乳细胞系时，可根据上文描述对PPN/MG61 mRNA的水平进行检测和测量。用于使该药物与细胞相接触的适当的时间长度可根据经验进行测定，并且一般为足以使该药物进入该细胞并且使该药物对PPN/MG61 mRNA和/或多肽水平具有可测量的效果的时间。一般来说，适当的时间介于10分钟和24小时，更典型的情况下约1-8小时。
测量PPN/MG61 mRNA水平的方法在本领域中是已知的，其中多种方法在上文有所描述，这些方法中的任何一种均可被用于本发明的方法以对在细胞中调控PPN/MG61 mRNA水平的药物进行鉴定，这些方法包括，PCR，例如使用经可检测标记的寡核苷酸引物进行的PCR，RT-PCR，实时RT-PCR以及多种杂交分析，但不限于这些。类似地，PPN/MG61多肽水平可以使用任何标准方法进行测量，其中多种方法在上文有所描述，这些方法包括诸如ELISA这样的免疫分析，例如使用一种经可检测标记的特异于PPN/MG61多肽的抗体进行的ELISA，但不限于这些。
筛选分析可以包括多种其它的试剂。所包括的试剂如盐、诸如白蛋白这样的中性蛋白，去污剂等等，这些试剂可用于辅助最佳的蛋白质-蛋白质结合和/或降低非特异性或者背景相互作用。可以使用提高该分析的效率的试剂，例如蛋白酶抑制剂、核酸抑制剂、抗微生物药物等等。
这些筛选方法可通过本领域已知的多种不同的方式进行设计，其中可以使用多种分析配置和方案。例如，这些组分之一可结合于某种固体支持物，并且其余的组分同结合于该支持物的组分进行接触。该方法的上述组分可基本上同时或者在不同时间进行组合。保温在任何适当的温度下进行；典型的情况下介于4到40℃。保温耗时可针对最佳活性进行选择，但也可以经优化而促进迅速的高通量筛选。典型情况下0.1到1小时应当是充足的。在这些接触和保温步骤之后，本方法在一般情况下进一步包括一个洗涤步骤以除去会在检测时产生背景信号的标记，例如放射活性或者荧光标记的非特异性结合的组分，但并非必须如此。在根据情况而进行的洗涤步骤之后，随即检测结合复合物的存在。
通过上述方法可对多种不同的候选药物进行筛选。候选药物包括多种化学类别，在典型情况下为合成、半合成或天然存在的有机或者无机分子。候选药物可为有机小化合物，其分子量高于50并且低于约2,500道尔顿。候选药物可含有一些功能性基团，这些基团是与蛋白进行结构作用所必需的，特别是氢键，并且可包括至少一种氨基、羰基、羟基或者羧基基团，并且可含有至少两种这些功能性化学基团。该候选药物可含有碳环或者杂环结构和/或芳香族或者多芳香族结构，这些结构中受到一种或者多种上述功能性基团的取代。候选药物同样可从生物分子中寻求，这些分子包括肽、糖、脂肪酸、固醇、嘌呤、嘧啶，这些分子的衍生物、结构类似物或者它们的组合。
候选药物可从多种来源中获得，这些来源包括合成或者天然化合物的库。例如，多种手段可被用于大量有机化合物和生物分子的随机合成或者定向合成，这包括随机化寡核苷酸和寡肽的表达。或者，可获得或者容易地产生以细菌、真菌、植物和动物抽提物的形式存在的天然化合物的库。另外，天然或者合成产生的库和化合物可通过传统的化学、物理和生物化学方法进行方便地修饰，并且可被用于产生组合库。已知的药学试剂可被用于直接或者随机的化学修饰，例如酰化、烷基化、酯化、酰胺化等等，从而产生结构类似物。
用于对调控PPN/MG61从真核细胞中的释放的药物进行鉴定的方法一般包括将正常产生PPN/MG61的细胞同测试药物进行接触，并且对PPN/MG61释放的影响进行测定。
PPN/MG61从真核细胞中的释放的“调控”包括，同缺乏该待测药物的参照组相比，提高或者降低PPN/MG61从真核细胞中的释放。与未加入药物的参照相比较，在将该细胞与待测候选药物进行接触后，在PPN/MG61 mRNA和/或PPN/MG61多肽水平(即含量)上提高或者降低约1.25倍，通常至少约1.5倍，通常至少约2倍，通常至少约5倍，通常至少约10倍或者更多是该药物调控了PPN/MG61表达的指示迹象。
基于细胞的分析一般包括的步骤有将该细胞同待测药物进行接触、形成测试样品以及在适当的时间后估测该药物对PPN/MG61从真核细胞中的释放的效果。参照样品含有相同的细胞但不添加入候选药物。在该测试样品和参照样品中测量PPN/MG61从真核细胞中的释放。在该测试样品和参照样品的PPN/MG61从真核细胞中的释放之间进行比较。可以使用传统的方法测量PPN/MG61的活性，以此估测PPN/MG61从真核细胞中的释放。例如，当使用产生PPN/MG61的表达的构建体转化哺乳细胞系时，可根据上文描述对从真核细胞中的释放的PPN/MG61酶活性进行检测和测量，或者可根据上文描述对PPN/MG61多肽的水平进行检测和测量。用于使该药物与细胞相接触的适当的时间长度可根据经验进行测定，并且一般为足以使该药物进入该细胞(如果必需)，或者同该细胞进行其它的作用(例如，与细胞表面成分)并且使该药物对PPN/MG61释放具有可测量的效果的时间。一般来说，适当的时间介于10分钟和24小时，更典型的情况下约1-8小时。
本发明进一步提供了使用本发明的筛选分析而鉴定出的药物，以及含有这些药物的组合物，这些组合物包括药物组合物。这些组合物可以使用众所周知的试剂和方法进行配制。在一些实施方案中，这些组合物以制剂形式提供，该制剂含有药用赋形剂。本领域中已知多种药用赋形剂，并且在本文中无需进一步讨论。药用赋形剂在多种出版物中易被充分地描述，这些出版物包括，例如，A.Gennaro(2000)“RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，”20th edition，Lippincott，Williams，& Wilkins；Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems(1999)H.C.Ansel et al.，eds.，7thed.，Lippincott，Williams，& Wilkins；以及Handbook of Pharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe et al.，eds.，3rded.Amer.Pharmaceutical Assoc.。
这些药用赋形剂，例如佐剂、载体或者稀释剂，易于为公众所获得。更进一步，药用物质，例如pH调节剂和缓冲剂、渗透液调节剂、稳定剂、润湿剂等等，易于为公众所获得。
本发明的核酸组合物和多肽组合物还可以在需要提高宿主体内PPN/MG61活性的情况下作为药物，特别是提高该多肽的活性，或者用于在特定的解剖位置提供PPN/MG61活性。
在一些实施方案中，PPN/MG61在一种药物组合物中被提供，该药物组合物具有一种药用赋形剂。
这些基因、基因片段或者被编码的蛋白或者蛋白质片段可用于治疗同PPN/MG61相关的失调。可以使用表达载体向细胞内引入该基因。这样的载体一般在该启动子序列附近具有方便的限制性位点，用于提供核酸序列的插入。转录盒可经制备而含有一种转录起始区域、该目标基因或其片段，以及转录终止区域。可将该转录盒引入多种载体，例如质粒、反转录病毒，如慢病毒；腺病毒等等，其中该载体在这些细胞中瞬时地或者稳定地维持，通常维持至少约一天的时间，更通常的情况下维持至少约数天到数周。
基因或者蛋白质可以通过多种途径被引入组织或者宿主细胞，这些途径包括病毒感染、微注射或者囊泡融合。喷射(jet)注射也可被用于肌肉间给药，描述见Furth et al.(1992)，Anal Biochem 205365-368。该DNA可被包被于金微粒之上，并且通过颗粒轰击设备(particlebombardment device)或者“基因枪”进行皮内递送，描述见文献(例见，Tang et al.(1992)，Nature 356152-154)，其中这些金微粒被DNA所包埋，随后被轰击进入皮肤细胞。
在另一个实施方案中，该活性药物在宿主体内调控编码目的蛋白的基因的表达，通常情况下对其进行削弱或者下行调节。例如，反义分子、小干扰RNA(siRNA)、短发卡RNA(shRNA)可被用于在细胞中对该基因的表达进行下行调节。该反义试剂可以是反义寡核苷酸(ODN)，特别是来自天然核酸而具有化学修饰的合成的ODN，或者是这样的RNA形式反义分子的核酸构建体。该ODN、siRNA和shRNA序列同该目标基因的mRNA或者cDNA互补，并且抑制该目标基因产物的表达。可以用ODN、siRNA和shRNA分子之一或者组合进行给药，其中一种组合可以包括多种不同的序列。
反义序列、siRNA和shRNA分子可以通过对适当的载体中的目的基因序列的全部或者部分进行表达而产生，其中该转录起始的定向使得一个反义链作为RNA分子而产生。或者，反义、siRNA和shRNA分子是合成的。
反义寡核苷酸、siRNA和shRNA分子可以通过本领域中所示的方法进行合成。优选的寡核苷酸来自天然磷酸二酯结构并有化学修饰，从而提高这些核苷酸的细胞内稳定性和结合亲合性。本领域中已对多种这样的改变骨架、糖或者杂环碱基的化学性的修饰进行了描述。
在骨架化学性上的有用变化有硫代磷酸酯；非桥(non-bridging)氧被硫所取代的二硫代磷酸酯；亚磷酰胺；烷基磷酸三酯以及boranophosphates。非手性磷酸衍生物包括3′-O′-5′-S-硫代磷酸酯、3′-S-5′-O-硫代磷酸酯、3′-CH2-5′-O-膦酸盐以及3′-NH-5′-O-亚磷酰胺。肽核酸以肽的连接取代了整个核糖磷酸二酯骨架。糖修饰也可被用于增强稳定性和亲合性。可以使用脱氧核糖的β-异头物(anomer)，其中碱基依天然α-异头物进行反转。该核糖的2′-OH可经改变以形成2′-O-甲基或者2′-O-烯丙基糖，该糖提供了对降解的抗性而不损害亲和性。杂环碱基的修饰必须维持适当的碱基配对。一些可用的替换包括以脱氧尿嘧啶代替脱氧胸腺嘧啶；以5-甲基-2′-脱氧胞嘧啶和5-溴-2′-脱氧胞嘧啶代替脱氧胞嘧啶。5-丙炔基-2′-脱氧尿苷和5-丙炔基-2′-脱氧胞苷已被证明当分别替代脱氧胸腺嘧啶和脱氧胞嘧啶时提高了亲合性和生物活性。
本发明提供了多种治疗方法。在一些实施方案中，提供了调控蛋白质的酶活性的方法，包括对其进行调节和抑制。本方法在对多种不同病症的治疗中找到用途，这些病症包括，癌症；炎症；可通过提高Wnt信号传导和/或血管发生而影响的失调，如局部缺血性失调；以及血栓症，但不限于这些。
宿主或者患者可来自于任何哺乳类物种，例如灵长类，特别是人类。用于实验性探索的动物模型令人关注，这些模型提供了人类疾病治疗的模型。
本文所使用的术语“药物”指的是调控具有酶学活性的PPN/MG61的水平的物质。在一些实施方案中，药物为通过本发明的筛选分析所鉴定的药物。“调控具有酶学活性的本PPN/MG61的水平”包括提高或者降低PPN/MG61的酶活性；提高或和降低具有酶学活性PPN/MG61蛋白的水平；以及提高或者降低编码具有酶学活性的PPN/MG61蛋白的mRNA水平。在一些实施方案中，药物为PPN/MG61，其中该PPN/MG61自身被用于对个体进行给药。在一些实施方案中，药物为特异于PPN/MG61的抗体。
可通过降低PPN/MG61活性和/或降低PPN/MG61多肽或者mRNA水平而影响的病症包括与肿瘤中的Wnt信号传导和/或血管发生的促进相关的病症或由其导致的病症。由此，本方法可用于降低Wnt信号传导和/或血管发生所诱导的肿瘤。在一些实施方案中提供了一些方法用于治疗癌症。这些实施方案中的某些方案中，提供了用于降低肿瘤生长的方法。在其它的实施方案中提供了用于降低分化因子从ECM中的释放的方法。
降低肿瘤生长的方法以及降低PPN/MG61活性的方法通常包括，以某种降低酶活性PPN/MG61的水平的药物对个体进行给药。同适当的参照相比，有效量的药物降低了酶活性PPN/MG61水平至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％或者更多。同适当的参照相比，有效量的药物降低了肿瘤生长至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约40％，至少约50％或者更多。
提供了降低因子从ECM中的释放的方法，这些因子的例子如生长因子和分化因子。这些方法一般包括，以某种降低酶活性PPN/MG61水平的药物对个体进行给药，其中酶活性PPN/MG61水平的降低导致了因子从肿瘤附近或者周边的ECM中释放的降低。
分化和生长因子包括，Wnt、纤维原细胞生长因子(FGF)、肝素结合的类EGF生长因子、肝细胞生长因子、Wnt家族的分泌糖蛋白的成员，血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生的生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF)如TGF-β、骨骼形态发生蛋白、GM-CSF以及肝细胞生长因子，但不限于这些可以使用本发明的方法进行治疗的肿瘤包括，恶性瘤，例如非小细胞肺癌、结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、恶性黑素瘤、导管瘤、子宫内膜瘤、胃癌、胰腺癌、间皮瘤、口腔黏膜发育异常(dysplastic oralmucosa)、侵入性口腔癌、transitional and squamous cell urinarycarcinoma等等；还包括神经恶性增生，例如成神经细胞瘤、成胶质细胞瘤、星细胞瘤、神经胶质瘤等等；血液恶性病变，例如儿童急性白血病、非霍杰金氏淋巴瘤、慢性淋巴性白血病、恶性皮肤T细胞(malignant cutaneous T-cells)、蕈样霉菌病、非MF皮肤T细胞淋巴瘤、淋巴瘤样丘疹病、T细胞富集皮肤淋巴增生(T-cell rich cutaneouslymphoid hyperplasia)、大疱性类天疱疮、盘状红斑狼疮、扁平苔癣等等。
通过本领域已知的任何手段可对肿瘤细胞的生长是否被抑制或者降低进行估测，这些方法包括，测量肿瘤体积；对肿瘤是否增殖进行测定，例如使用3H-掺入分析；以及/或者对肿瘤细胞进行计数，但不限于这些。
在一些实施方案中，本发明提供了降低炎症的方法，该方法包括提高酶活性PPN/MG61的水平。在一些实施方案中，该方法包括以PPN/MG61对个体进行给药。在其它的实施方案中，该方法包括以药物(例如，通过上文所述的筛选方法所鉴定的药物)对个体进行给药，其中所述的药物为在个体中提高酶活性PPN/MG61水平的药物。医疗有效量的药物的量足以从相当比例的配基中除去酰基部分，从而使炎症被防止或者改善。由此，本文在炎症的上下文中所使用的“治疗”应指的是防止或者改善炎症以及/或者炎症相关的症状。
为测定用于给药的PPN/MG61或者药物的剂量，必须注意不可指望完全除去所有的酰基基团。为进行正常的治疗，在发生伤口、感染或者疾病状态的区域的组织中必须送入至少一部分白血细胞或者嗜中性细胞。用于给药PPN/MG61或者药物的量根据患者的特定需求而进行调整，同时应考虑多种因素，例如待治疗的疾病类型。
这些PPN/MG61和/或药物可被用于治疗多种疾病，包括诸如风湿性关节炎、哮喘、成人呼吸窘迫综合征、类肉状瘤病、过敏性肺炎、多发性硬化、同种异体移植物排异以及淋巴瘤向皮肤位置的扩布。本发明的组合物应可应用于治疗任何疾病状态，其中该免疫系统转而对抗身体，导致了白细胞在组织中积累的程度使之引发组织损伤、肿胀、炎症和/或病痛。例如，当大量白血细胞迅速进入患病区域的关节并且进攻周边组织时产生了风湿性关节炎的炎症。
在一些实施方案中，该发明提供了用于增强血管发生的方法。这些方法一般涉及到，以一种有效量的PPN/MG61对患有症状的哺乳动物进行给药，该症状可通过增强血管发生而进行治疗。在许多实施方案中，PPN/MG61对某一解剖位置进行局部给药。
根据本发明的方法进行的治疗所影响的症状和疾病的例子包括与血管阻塞相关的任何症状，例如动脉、静脉或者毛细系统的阻塞。这样的症状和疾病的具体例子包括，冠状动脉阻塞疾病、颈动脉阻塞疾病、动脉阻塞疾病、末梢动脉阻塞疾病、动脉硬化症、myointimalhyperplasia(例如，由于血管手术或者气囊血管成形术或者vascularstenting)、闭塞性血栓性管炎、成血栓失调、脉管炎等等，但未必限于这些。使用本发明的方法可以预防的症状和疾病的例子包括，多种局部缺血症状中(例如，心肌缺血、四肢缺血、中风相关的缺血)的任何一种，心脏病发作(心肌梗塞)或者其它与血流减弱相关的血管坏死、中风、四肢坏死或者丧失等等，但未必限于这些。
由此，本发明提供了治疗缺血症状的方法。以有效量的PPN/MG61进行的给药促进了血管发生，其结果是对缺血组织血液供应的提高。同适当的参照相比，在以PPN/MG61进行给药之后，对缺血组织的血液供应(血流)提高了至少约10％，至少约20％，至少约30％，至少约50％，至少约75％，至少约100％或者更多。可通过本领域所已知的任何方法对局部缺血组织的血液供应是否提高进行测量，这些方法包括，温度记录(thermnography)、红外记录；透皮PO2，透皮PCO2、激光多普勒、多普勒波形、距肱指数(ankle brachial index)、脉搏体积记录(pulse volume recording)、趾压(toe pressure)、双波形(duplex waveform)、磁共振成像影、同位素冲失(isotope washout)以及NAD/NADH荧光分光密度，但不限于这些。这些方法在本领域中为人所熟知，并且在多个出版物中已被描述。
血管发生是否有所提高可以使用本领域中任何已知的方法进行测定，这些方法包括，例如，刺激新生血管向浸以松弛素的植入物内的生成；刺激血管在角膜或者前眼室内的生长；刺激内皮细胞增殖、迁移或者体外管形成；以及鸡绒膜尿囊膜分析；仓鼠颊囊分析；聚乙烯醇绵盘分析(polyvinyl alcohol sponge disk assay)。这些分析在本领域中为人熟知并且在多种出版物中有所描述，这些出版物包括，例如Auerbach et al.((1991)Pharmac.Ther.511-11)，在此引为参考。
如上所述，一种有效量的活性药物(例如，小分子、抗PPN/MG61抗体或者PPN/MG61)被用于对该宿主进行该药，其中“有效量”指的是足以产生所需结果的剂量。在一些实施方案中，所需的结果至少为PPN/MG61酶活性同参照相比的降低。在其它的实施方案中，该所需结果为PPN/MG61酶活性同参照相比的提高(在个体中，或者在该个体的局部解剖位置)。
在典型的情况下，本发明的组合物应含有的活性成分介于低于1％到约95％，优选的情况下介于约10％到约50％之间。一般情况下，对儿童应以约100mg到约500mg进行给药，对成人应以约500mg到约5g进行给药。给药一般情况下通过注射进行并且通常通过注射对局部区域进行给药。给药的频率应当基于患者反应考虑决定。其它有效剂量可由本领域中的普通技术人员通过试验产生的剂量反应曲线容易地测定。
为计算PPN/MG61的量，本领域的技术人员可利用容易获得的有关除去给定量PPN/MG61所必需的酶量的信息。例如，如果给定的酶具有的活性可使一个单位的酶在生理pH下从底物中进行1微摩尔/分钟的SO4的消除，则出于治疗目的应对70kg的人类以1到10单位进行静脉内给药。提高酶活性PPN/MG61水平所必需的药物的量可以通过体外实验进行计算。例如，通过对提高酰基基团从给定量的底物中的去除所必需的药物量进行计算并且估测待治疗区域中该底物(或其体内对应物)的量，可以测定用于给药的药物的量。该药物量理应根据所使用的特定药物而有所变化。
在本发明的方法中，活性药物可以使用任何方便的手段进行给药，该手段能够导致所需的PPN/MG61活性抑制。由此，该药物可被引入用于治疗性给药的多种制剂。更特定的情况下，本发明的药物可通过与适当的药用载体或者稀释剂进行组合而被配制入药物组合物，并且可被配制入固体、半固体、液体或者气体形式的制剂，例如药片、胶囊、粉末、颗粒、药膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂和气溶胶。
同样地，这些药物的施用可以以多种方式完成，包括经口、口腔、直肠、非肠胃道、皮内、透皮、intracheal等等给药。
在药学药剂的形式下，该药物可以以其药用盐的形式进行给药，或者它们可被单独使用或者同其它的药学活性化合物进行适当地关联使用以及组合使用。以下的方法和赋形剂仅是例子，绝非限制。
对于口腔制剂，该药物可被单独使用或与适当的添加剂组合使用，从而产生药片、粉末、颗粒和胶囊，例如与传统添加剂组合，如乳糖、甘露糖、玉米淀粉或者马铃薯淀粉；与粘合剂相组合，例如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯树胶、玉米淀粉或者明胶；与崩解剂(disintegrator)相组合，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉或者羧甲基纤维素钠；与润滑剂相组合，例如滑石或者硬脂酸镁；并且如果需要，与稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和调味剂相组合。
适当的赋形剂载体为，例如，水、盐、葡萄糖、甘油、乙醇等等，以及它们之间的组合。另外，如果需要，该载体可含有最小量的辅助物质，例如润湿剂或者乳化剂或者pH缓冲剂。制备这些药剂形式的实际方法为本领域的技术人员所知或者显而易见。例见Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Easton，Pa.，17thedition，1985。用于给药的组合物或者制剂在任何情况下应含有一定量足以在待治疗对象体内获得所需状态的氯酸盐/硒酸盐以及/或者PPN/MG61。
通过溶解、悬浮或者乳化于含水溶剂或者非水溶剂中，该药物可被配制成为用于注射的制剂，非水溶剂的例子如植物油或者其它类似的油、合成的脂肪酸甘油酯、丙二醇或者高级脂肪酸酯；如果需要，可含有传统的添加剂，例如增溶剂、等渗药物、悬浮药物、乳化剂、稳定剂和防腐剂。
该药物可被用于气溶胶制剂从而通过吸入进行给药。本发明的化合物可被配制进入可加压的推进剂，例如二氟二氯甲烷、丙烷、氮等等。
进一步，该药物可通过与多种基质进行混合而被制入栓剂，例如与乳化基质或者水溶基质混合。本发明的化合物可通过栓剂进行直肠给药。该栓剂可包括的载体如可可油、碳蜡和聚乙二醇，这些栓剂在体温下融化，而在室温下为固态。
所提供的用于口腔或者直肠给药的单位剂量形式，例如糖浆、酏剂以及悬浮物，其中每剂量单位，如每茶匙量、每汤匙量、每片或者每栓，含有预定量的组合物，该组合物含有一种或者多种抑制剂。类似地，用于注射或者静脉内给药的单位剂量可在组合物中含有抑制剂，该组合物为无菌水溶液、生理盐水或者另一种药用载体。
本文所使用的术语“单位剂量形式”指的是实际中不连续的单位，该单位适用作人类或者动物对象的一个单元的剂量，每单位含有预定量的本发明的化合物，该量经计算足以产生所需的效果，该化合物同药用稀释剂、载体或者负载物联合。用于本发明的新单位剂量形式的规格取决于所使用的特定化合物以及需获得的效果，以及各化合物在宿主体内所关联的药效学。
药用赋形剂，例如佐剂、载体或者稀释剂，易于为公众所得。进一步，药学上可接受的辅助性物质，例如pH调节剂和缓冲剂，渗透压调节剂、稳定剂、润湿剂等等，易于为公众所得。
当药物为一种多肽、多聚核苷酸，它们的类似物或者拟似物(mimetic)，例如反义序列、siRNA或者shRNA组合物的情况下，该药物可通过任意途径被引入组织或者宿主细胞，这些途径包括病毒感染、微注射或者囊泡融合。喷射注射也可被用于肌肉间给药，描述见Furth et al.(1992)，Anal Biochem 205365-368。该DNA可被包被于金微粒之上，并且通过颗粒轰击设备或者“基因枪”进行皮内递送，描述见文献(例见，Tang et al.(1992)，Nature 356152-154)，其中这些金微粒被DNA所包埋，随后被轰击进入皮肤细胞。
技术人员应会认同，剂量水平可根据具体化合物、症状严重程度以及受试者对副作用的敏感度而变化。对于给定化合物的优选的剂量易于被本领域中的技术人员通过多种手段所测定。
治疗指的是使与困扰该对象的病症相关的症状至少有所缓和，其中的缓和被广义地用于指同待治疗的病症相关的某一参数，例如症状，程度的降低，病症的例子如炎症及其相关的病痛。同样，治疗还包括该病症或者至少其相关的症状被完全抑制，例如，防止其发生，或者完全停止，例如被终止，从而使该宿主不再罹患该病症或至少不再罹患该病症的特征症状。
多种宿主根据本方法是可治疗的。一般情况下，这些宿主是“哺乳动物”或者“哺乳类”，其中这些术语被广义地用于描述一些属于哺乳类的有机体，这些有机体包括食肉目(例如，犬和猫)、啮齿目(例如小鼠、豚鼠和大鼠)以及灵长动物(例如人类、黑猩猩和猴)。在许多实施方案中，该宿主为人类。
根据上文描述，本发明的PPN/MG61和药物自身可被使用，可相互一起使用，或者同药用赋形剂材料联合使用。
提供了具有单位剂量活性药物的试剂盒，通常是口服或者可注射药剂。在这些试剂盒中，除含有单位剂量的容器外还应有说明书，该说明书描述了该药物在治疗目的病症中的应用和附加优点。优选的化合物和单位剂量为本文上文所述。
在有利的情况下，本发明的PPN/MG61和药物可以与至少一种其它的非铂和含铂的抗肿瘤药物一起被用于对患有恶性增生的对象进行给药。例如，一种抗PPN/MG61的化合物可以在剂量方案(dosingregimen)中与一种细胞毒性化合物，例如DNA烷基化药物，或者与一种抗血管发生药物或者抗肿瘤药物(化合物或者单克隆抗体)一起进行给药，但本发明不限于此。优选的抗肿瘤药物选自cladribine(2-氯-2′-脱氧-β-D-腺苷)、苯丁酸氮芥((4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸)、DTIC-Dome(5-(3，3-二甲基-1-triazeno)-咪唑-4-甲酰胺)、铂类化疗药物以及非铂类化疗药物。含铂的抗肿瘤药物包括顺铂(顺-二氨络二氯铂)，但不限于此。不含铂的抗肿瘤药物包括环磷酰胺、氟尿嘧啶、表柔比星、氨甲蝶呤、长春新碱、阿霉素、博来霉素和鬼臼乙叉苷，但不限于这些。各种抗肿瘤药物以医疗有效量内给药，该量在本领域中为人所熟知，并且根据所使用的药物、恶性增生类型以及其它症状有所变化。
实施例以下的实施例用于为本领域中的普通技术人员提供有关如何实施和使用本发明的完整披露和描述，并且这些例子并非意在对本发明者所认为的发明范围进行限制，亦非意指下文的实验是被实施的全部实验而且是仅可实施的实验。
实施例1人类正常和癌细胞系中的PPN/MG61表达我们使用半定量RT-PCR研究了PPN/MG61 mRNA在多种人类癌细胞系中的表达以及在正常人类原代细胞中的表达(图1)。我们所测试的人类癌细胞系包括非小细胞肺癌(NSCLC)(A549、H460、H838和H1703)、乳腺癌(MCF-7，BT474和HuL100)、恶性多间皮瘤细胞系(H513，H2052，H290，MS-1和H28)、结肠癌细胞系(SW480)、头颈癌细胞系(U87)、子宫颈癌(Hela)、肉瘤细胞系(Mes-SA、Saos-2和A204)。我们所测试的正常人类原代细胞为小气管上皮细胞(SAEC)、支气管上皮细胞(NHBE)以及正常的间皮细胞(LP-9)。制备了来自各个细胞类型的总RNA并且等量的总RNA被用于各个RT-PCR分析。在各个样品中对一种持家(housekeeping)基因GAPDH进行扩增并被用作为内参和加样量对照。在所有三种正常的人类细胞培养物中，未见到PPN/MG61 mRNA的表达(图1)。与之对比，在我们所测试的所有人类癌细胞系中均观察到了高水平的PPN/MG61 mRNA的表达(图1)。这些结果提示，PPN/MG61在多种或者所有人类癌细胞系中被高度表达，但在正常人类细胞中未检测到。
实施例2PPN/MG61在人类正常和癌症肺组织样品中的表达我们下一步使用半定量RT-PCR在原代非小细胞癌(NSCLC)组织样品和它们在同样患者体内所对应的正常肺样品中检测了PPN/MG61 mRNA的表达(图2)。经受对肿瘤的治疗性初步切除的患者的新鲜肺癌组织和邻近的正常肺组织在手术时被收集，并且立即速冻于液氮之中。这些组织样品，在液氮冷冻器中保存于-170℃直至使用。
随后从这些新鲜切除的肺癌和同样患者的自体对应的正常肺组织中制备总RNA，并且将等量的总RNA用于各个RT-PCR分析。在我们所测试的24个对应人类非癌和癌化肺组织样品中，我们发现，与对应的正常肺组织样品相比，几乎所有的(23个)肺癌组织样品(95.8％)过表达了PPN/MG61 mRNA(图2)。在所有的正常肺样品中仅观察到了最低的或者无PPN/MG61表达。
实施例3在原代人类间皮瘤组织样品中的PPN/MG61表达水平的RT-PCR分析我们还通过使用半定量RT-PCR在原代间皮瘤组织和正常复合(plural)组织样品中检测了PPN/MG61 mRNA的表达。经受对肿瘤的治疗性初步切除的患者的新鲜间皮瘤组织和邻近的正常复合组织在手术时被收集，并且立即速冻于液氮之中。这些组织样品，在液氮冷冻器中保存于-170℃直至使用。随后从该患者的新鲜切除的间皮瘤和正常组织中制备总RNA，并且将等量的总RNA用于各个RT-PCR分析。在我们检测的所有的癌化间皮瘤组织样品中，我们发现64.7％(17中的11个)的间皮瘤组织样品过表达了PPN/MG61 mRNA(图3)。在所有的正常组织中未观察到PPN/MG61表达。
实施例4在正常人类血清和来自癌症患者的血清样品中的PPN/MG61表达水平的RT-PCR分析随后我们测试在癌症患者的血清样品中是否检测到PN/MG61mRNA的频繁过表达。血清样品根据标准程序从多种癌症患者中进行收集，包括NSCLC、间皮瘤、结肠癌、恶性黑素瘤、肾癌、食道癌、甲状腺癌、恶性毒瘤和卵巢癌。随后在收集血清的三个小时内从这些血清样品中制备总RNA，并且用于RT-PCR反应(图4)。在我们所测试的来自癌症患者血清的32个样品中，我们发现93.8％(32中的30个)的样品过表达了PPN/MG61 mRNA(图4)。在全部八个正常参照组中未观察到PPN/MG61的表达，在参照组中总RNA从八个不同的正常人的血清中制备(图4)。
在第二个实验中，我们测试了PPN/MG61 mRNA的过表达是否可通过使用RT-PCR从癌症患者的血清样品中直接检测而无需总RNA的分离(图5)。在该实验中，所有的血清样品在收集后未经进一步处理被直接加入该RT-PCR反应(每25μl反应系统中1μl血清)。该实验在血清收集后三个小时内进行。36个循环之后，我们在16个癌症患者的血清样品中的10个(62.5％)检测到了PPN/MG61 mRNA的过表达。与之对比，同样的实验条件下在全部四个正常血清样品中未观察到PPN/MG61的表达(图5)。
在第三个实验中，我们测试了PPN/MG61 mRNA的过表达是否可通过使用RT-PCR从癌症患者的经热处理的血清样品中直接检测而无需总RNA的分离(图6)。在该实验中，在血清收集后所有的血清样品在75℃下加热了10分钟并且随后被加入该RT-PCR反应(每25μl反应系统中1μl热处理的血清)。该实验同样在血清收集后三个小时内进行。36个循环之后，我们在22个癌症患者的血清样品中的12个(54.5％)检测到了PPN/MG61 mRNA的过表达。与之对比，同样的实验条件下在全部四个正常血清样品中未观察到PPN/MG61的表达(图6)。综上所述，通过使用不同的方法，我们能够在收集自癌症患者的血清样品中直接以较高的频率(超过55％)检测到PPN/MG61 mRNA的过表达。但是，在相同的条件下，我们在收集自不同的非癌症人的所有正常血清样品中未检测到PPN/MG61的表达。
实施例5PPN/MG61 siRNA在非小细胞肺癌(NSCLC)细胞中诱导了细胞凋亡并且阻断了Wnt/β-连环蛋白信号传导为进一步理解PPN/MG61在人类NSCLC发展期间所扮演的角色，我们检测了PPN/MG61对于NSCLC细胞存活和增殖是否必需，该检测通过使用RNA干扰(RNAi)进行的PPN/MG61表达的敲低而完成。小干扰RNA(siRNA)经设计并在Qiagen，Inc.合成。随后遵照Elbashir等人(2001)所描述的方案进行RNAi。以PPN/MG61siRNA进行4-6天的处理在我们所测试的表达PPN/MG61的NSCLC细胞系中诱导了显著的细胞死亡(图7A和8A，P＜0.001)。但是，在经参照siRNA处理后我们未见到显著的效果。我们进一步发现细胞的杀伤很大程度上是由于在这些细胞系中所诱导的细胞凋亡所致。100nM的PPN/MG61 siRNA诱导了显著的细胞凋亡，非沉默siRNA参照未诱导细胞凋亡(100nM)(P＜0.01)(图7B，8B，和9B)。我们还通过RT-PCR分析证实了PPN/MG61 siRNA处理后(100nM，72小时)PPN/MG61表达的沉默(图7C、8C、和9C)。非沉默性siRNA用作为参照(100nM，72小时)。为检测该细胞凋亡效果是否与Wnt信号传导的抑制相关，我们显示在经PPN/MG61 siRNA处理(图7C、8C、和9C)后胞质β-连环蛋白和存活蛋白(survivin)的表达水平被下调。β-肌动蛋白在所有实验中被作为加样量对照。
实施例6PPN/MG61 siRNA在间皮瘤细胞中诱导了细胞凋亡并且阻断了Wnt/β-连环蛋白信号传导。
为进一步理解PPN/MG61在人类间皮瘤发展期间所扮演的角色，我们检测了PPN/MG61对于间皮瘤细胞的存活和增殖是否必需，该检测通过使用RNAi进行的PPN/MG61表达的敲低而完成。所使用的siRNA与上文描述相同。随后遵照Elbashir等人(2001)所描述的方案进行RNAi。以PPN/MG61 siRNA进行4-6天的处理在我们所测试的表达PPN/MG61的间皮瘤细胞系中诱导了细胞凋亡(图10)。100nM PPN/MG61 siRNA诱导了显著的细胞凋亡，非沉默性siRNA参照未诱导细胞凋亡(100nM)(P＜0.01)(图10A)。我们还通过RT-PCR分析证实了PPN/MG61 siRNA处理后(100nM，72小时)PPN/MG61表达的沉默(图10B)。非沉默性siRNA用作为参照(100nM，72小时)。为检测该细胞凋亡效果是否与Wnt信号传导的抑制相关，我们显示在经PPN/MG61 siRNA处理(图10B)后胞质β-连环蛋白和存活蛋白的表达水平被下调。同样，β-肌动蛋白在所有实验中被作为加样量对照。
实施例7PPN/MG61 siRNA在乳腺癌细胞中诱导了细胞凋亡并且阻断了Wnt/β-连环蛋白信号传导为进一步理解PPN/MG61在人类乳腺癌发展期间所扮演的角色，我们检测了PPN/MG61对于乳腺癌细胞的存活和增殖是否必需，该检测通过使用RNAi进行的PPN/MG61表达的敲低而完成。所使用的siRNA与上文描述相同。随后遵照Elbashir等人(2001)所描述的方案进行RNAi。以PPN/MG61 siRNA进行4-6天的处理在我们所测试的表达PPN/MG61的乳腺癌细胞系中诱导了细胞凋亡(图11)。100nM PPN/MG61 siRNA诱导了显著的细胞凋亡，非沉默性siRNA参照未诱导细胞凋亡(100nM)(P＜0.01)(图11A)。我们还通过RT-PCR分析证实了PPN/MG61 siRNA处理后(100nM，72小时)PPN/MG61表达的沉默(图11B)。非沉默性siRNA用作为参照(100nM，72小时)。为检测该细胞凋亡效果是否与Wnt信号传导的抑制相关，我们显示在经PPN/MG61 siRNA处理(图11B)后胞质β-连环蛋白和存活蛋白的表达水平被下调。同样，β-肌动蛋白在所有实验中被作为加样量对照。
实施例8阴性对照PPN/MG61 siRNA在缺乏PPN/MG61表达的正常细胞中未诱导细胞凋亡并且来阻断Wnt/β-连环蛋白信号传导为在未观察到PPN/MG61表达的正常细胞中测试PPN/MG61siRNA的效果，我们将PPN/MG61 siRNA转染进入两种不同的缺乏PPN/MG61表达的正常细胞培养物(图12)。在100nM PPN/MG61siRNA处理4-6天之后，与非沉默性siRNA(100nM)参照相比较我们未观察到显著的细胞凋亡的诱导(图12A)。在这些正常的组织中通过半定量RT-PCR在siRNA处理之前和之后未检测到PPN/MG61表达(100nM，72小时)(图12B)。非沉默性siRNA用作为参照(100nM，72小时)。通过证实胞质β-连环蛋白和存活蛋白的表达水平在经PPN/MG61 siRNA处理后无变化，我们还发现Wnt信号传导无抑制(图12B)。同样，β-肌动蛋白在所有实验中被用作为加样量对照。综合来说，我们的结果显示PPN/MG61的抑制可在表达PPN/MG61的癌细胞中特异地和选择性地诱导细胞凋亡，但在不表达PPN/MG61的正常细胞则非如此。这些结果还提示了PPN/MG61功能和癌细胞存活之间的强烈联系。
实施例9膜结合O-酰基转移酶家族的保守区域的多排列比较仅显示了被选择的蛋白(图13)。物种和酶的名称为简写AT，拟南芥；BS，枯草芽胞杆菌；CE，线虫；DM，果蝇；HS，人类；MM，小鼠；PA，绿脓杆菌；SA，金黄色葡萄球菌；SC，酿酒酵母；SI，西蒙得木(Simmondsia chinensis)；TP，梅毒螺旋体；ACAT，胆固醇酰基转移酶；DGAT，二酰基甘油O-酰基转移酶；WaxSyn，蜡合成酶。在超过50％的序列中的变化残基和保守残基分别以黑色和灰色背景显示，高度保守的极性残基以有色背景显示。排列比较的左侧数字显示了在序列中的位置，顶部的黑色条柱显示了长疏水区域。
序列表<110>北京雅康博生物科技有限公司<120>检测PPN/MG61表达的方法及其应用<130>
<150>
<151>2004-08-19<160>9<210>1<211>461<212>PRT<213>人PPN/MG61肽序列<400>1matfsrqeff qqllqgcllp taqqgldqiw lllaiclacr llwrlglpsy lkhastvagg 60ffslyhffql hmvwvvllsl lcylvlflcr hsshrgvfls vtiliyllmg emhmvdtvtw 120hkmrgaqmiv amkavslgfd ldrgevgtvp spvefmgyly fvgtivfgpw isfhsylqtv 180qgrplscrwl qkvarslala llclvlstcv gpylfpyfip lngdrllrnk krkargtmvr 240wlrayesavs fhfsnyfvgf lseatatlag agfteekdhl ewdltvskpl nvelprsmve 300vvtswnlpms ywlnnyvfkn alrlgtfsav lvtyaasall hgfsfhlaav llslafityv 360ehvlrkrlar ilsacvlskr cppdcshqhr lglgvralnl lfgalaifhl aylgslfdvd 420vddtteeqgy gmaytvhkws elswashwvt fgcwifyrli g 461<210>2<211>1386<212>DNA<213>人PPN/MG61 cDNA序列<400>2
atggccacct ttagccgcca ggaatttttc cagcagctac tgcaaggctg tctcctgcct 60actgcccagc agggccttga ccagatctgg ctgctccttg ccatctgcct cgcctgccgc 120ctcctctgga ggctcgggtt gccatcctac ctgaagcatg caagcaccgt ggcaggcggg 180ttcttcagcc tctaccactt cttccagctg cacatggttt gggtcgtgct gctcagcctc 240ctgtgctacc tcgtgctgtt cctctgccga cattcctccc atcgaggcgt cttcctatcc 300gtcaccatcc tcatctacct actcatgggt gagatgcaca tggtagacac cgtgacatgg 360cacaagatgc gaggggcaca gatgattgtg gccatgaagg cagtgtctct gggcttcgac 420ctggaccggg gcgaggtggg tacggtgccc tcgccagtgg agttcatggg ctacctctac 480ttcgtgggca ccatcgtctt cgggccctgg atatccttcc acagctacct acaaactgtc 540caaggccgcc cactgagctg ccggtggctg cagaaggtgg cccggagcct ggcactggcc 600ctgctgtgcc ttgtgctgtc cacttgcgtg ggcccctacc tcttcccgta cttcatcccc 660ctcaacggtg accgcctcct tcgcaacaag aaacgcaaag ccaggggcac catggtaagg 720tggctgcgag cctacgagag tgctgtctcc ttccacttca gcaactattt tgtgggcttt 780ctttccgagg ccacggccac gttggcgggg gctggcttta ccgaggagaa ggatcacctg 840gaatgggacc tgacggtgtc caagccactg aatgtggagc tgcctcggtc aatggtggaa 900gttgtcacaa gctggaacct gcccatgtct tattggctaa ataactatgt tttcaagaat 960gctctccgcc tggggacctt ctcggctgtg ctggtcacct atgcagccag cgccctccta 1020catggcttca gtttccacct ggctgcggtc ctgctgtccc tggcttttat cacttacgtg 1080gagcatgtcc tccggaagcg cctggctcgg atcctcagtg cctgtgtctt gtcaaagcgg 1140tgcccgccag actgttcgca ccagcatcgc ttgggcctgg gggtgcgagc cttaaacttg 1200ctctttggag ctctggccat cttccacctg gcctacctgg gctccctgtt tgatgtcgat 1260gtggatgaca ccacagagga gcagggctac ggcatggcat acactgtcca caagtggtca 1320gagctcagct gggccagtca ctgggtcact tttggatgct ggatcttcta ccgtctcata 1380ggctga 1386<210>3<211>20<212>DNA<213>人PPN/MG61 cDNA引物对#1_1<400>35’-tacctgaagcatgcaagcac-3’<210>4<211>20
<212>DNA<213>人PPN/MG61 cDNA引物对#1_2<400>45’-cggtgtctaccatgtgcatc-3’<210>5<211>20<212>DNA<213>人PPN/MG61 cDNA引物对#2_1<400>55’-tcctcagtgcctgtgtcttg-3’<210>6<211>20<212>DNA<213>人PPN/MG61 cDNA引物对#2_2<400>65’-gcatccaaaagtgacccagt-3’<210>7<211>20<212>DNA<213>人PPN/MG61 cDNA引物对#3_1<400>75’-ctcggtcaatggtggaagtt-3’<210>8<211>20<212>DNA<213>人PPN/MG61 cDNA引物对#3_2
<400>85’-caagacacaggcactgagga-3’<210>9<211>20<212>DNA<213>人PPN/MG61 cDNA引物对#4_1<400>95’-tgcctgtgtcttgtcaaagc-3’<210>10<211>20<212>DNA<213>人PPN/MG61 cDNA引物对#4_2<400>105’-gcatccaaaagtgacccagt-3’<210>11<211>20<212>DNA<213>人PPN/MG61 cDNA引物对#5_1<400>115’-ctcggtcaatggtggaagtt-3’<210>12<211>20<212>DNA<213>人PPN/MG61 cDNA引物对#5_2<400>125’-ggtggaaactgaagccatgt-3’
<210>13<211>21<212>RNA<213>人PPN/MG61 siRNA靶序列#1<400>135’-aagttgtcacaagctggaacc-3’<210>14<211>21<212>RNA<213>人PPN/MG61 siRNA靶序列#2<400>145’-aacaagaaacgcaaagccagg-3’
权利要求
1.一种用于测量人类PPN/MG61的表达和酶水平的方法，该方法包括(a)以一种人类PPN/MG61特异性化合物与人类细胞相接触从而形成化合物-PPN/MG61的多复合物；以及(b)通过检测该复合物的存在而对该细胞所表达的PPN/MG61水平进行测量；其中PPN/MG61特异性化合物选自结合PPN/MG61的小分子化合物、单特异性抗体或者结合PPN/MG61的scFv以及核酸探针，所述核酸探针包括反义寡聚物、siRNA以及shRNA，这些探针应与PPN/MG61mRNA和/或cDNA杂交，其中PPN/MG61的氨基酸序列为SEQ ID No1，或者任何与Seq ID No1具有至少80％相同性的序列或者具有PPN/MG61活性的序列。
2.一种用于检测人类PPN/MG61的活性和表达的方法，该方法包括(a)以一种PPN/MG61特异性化合物与第一种细胞进行接触以形成第一种化合物-PPN/MG61的多复合物，该细胞在基础水平上表达PPN/MG61；(b)以一种PPN/MG61特异性化合物与第二种细胞进行接触以形成第二种化合物-PPN/MG61的多复合物，该细胞在过度扩增的水平上表达PPN/MG61；(c)通过检测第一种和第二种多复合体的存在而对该第一种和第二种细胞所表达的PPN/MG61水平进行测定；(d)对第一种和第二种细胞表达的PPN/MG61水平的差异进行测量；其中PPN/MG61特异性化合物选自结合PPN/MG61的小分子化合物、单特异性抗体或者结合PPN/MG61的scFv以及核酸探针，所述核酸探针包括反义寡聚物、siRNA以及shRNA，这些探针应与PPN/MG61 mRNA和/或cDNA杂交，其中PPN/MG61的氨基酸序列为SEQ ID No1，或者任何与Seq ID No1具有至少80％相同性的序列或者具有PPN/MG61活性的序列。
3.一种对组织进行体内成像的方法，该方法包括(a)以一种PPN/MG61特异性化合物对人类进行给药，其中该化合物含有一种可检测标记物，并且其中该化合物与一种人类细胞进行结合，该细胞在过度扩增的水平上表达PPN/MG61；以及(b)对该人类组织中的这些细胞的定位进行测定，该测定通过使该可检测标记物成像而进行；其中PPN/MG61特异性化合物选自结合PPN/MG61的小分子化合物、单特异性抗体或者结合PPN/MG61的scFv以及核酸探针，所述核酸探针包括反义寡聚物、siRNA以及shRNA，这些探针应与PPN/MG61 mRNA和/或cDNA杂交，其中PPN/MG61的氨基酸序列为SEQ ID No1，或者任何与Seq ID No1具有至少80％相同性的序列或者具有PPN/MG61活性的序列。
4.一种对抑制PPN/MG61的医疗有效化合物进行筛选的方法，该方法包括(a)以一种PPN/MG61特异性化合物与第一种细胞进行接触以形成第一种化合物-PPN/MG61的多复合物，该细胞在过度扩增的水平上表达PPN/MG61；(b)以一种PPN/MG61的潜在抑制剂第二种细胞进行接触以形成第二种化合物-PPN/MG61的多复合物，该细胞在过度扩增的水平上表达PPN/MG61；(c)通过检测第一种和第二种多复合体的存在而对该第一种和第二种细胞所表达的PPN/MG61水平进行测定；(d)对第一种和第二种细胞表达的PPN/MG61水平的差异进行测量，从而测定该潜在的抑制化合物对PPN/MG61的表达和/或活性的抑制；其中PPN/MG61特异性化合物选自结合PPN/MG61的小分子化合物、单特异性抗体或者结合PPN/MG61的scFv以及核酸探针，所述核酸探针包括反义寡聚物、siRNA以及shRNA，这些探针应与PPN/MG61 mRNA和/或cDNA杂交，其中PPN/MG61的氨基酸序列为SEQ ID No1，或者任何与Seq IDNo1具有至少80％相同性的序列或者具有PPN/MG61活性的序列。
5.权利要求1-4任一项的方法，其中细胞选自肾上腺细胞、脑细胞、乳腺细胞、结肠细胞、上皮细胞、内皮细胞、心脏细胞、免疫细胞、肾脏细胞、肝细胞、肺细胞、卵巢细胞、胰腺细胞、前列腺细胞、皮肤细胞、脾细胞、胃细胞、睾丸细胞、甲状腺细胞、子宫细胞和脉管细胞。
6.权利要求5的方法，其中上皮细胞选自内皮细胞、非胶质神经细胞、结肠细胞、乳腺细胞、肾脏的近小管细胞、前列腺的平滑肌细胞、子宫的平滑肌细胞以及睾丸的平滑肌细胞。
7.权利要求5的方法，其中免疫细胞选自多形核白细胞、单核细胞、巨噬细胞、上皮样细胞、巨大细胞、小神经胶质细胞、肝巨噬细胞和肺泡巨噬细胞。
8.权利要求2的方法，其中在过度扩增的水平上表达PPN/MG61的人类细胞是癌细胞或处于肿瘤微环境中的细胞。
9.权利要求8的方法，其中该癌细胞选自肺癌、乳腺癌、直肠结肠癌、类癌瘤、胃癌、神经胶质瘤、肝细胞瘤、平滑肌肉瘤、肝癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、头颈癌、阴道或睾丸癌、脑瘤、子宫颈癌、食道癌、淋巴瘤、恶性黑素瘤、间皮瘤、骨髓瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、甲状腺癌、肾细胞癌、眼癌、横纹肌肉瘤、肉瘤、未分化瘤以及白血病。
10.权利要求8的方法，其中该处于肿瘤微环境中的细胞选自胶质纤维原细胞、胶质单核细胞和成肌纤维细胞。
11.PPN/MG61抑制剂化合物在制备用于治疗PPN/MG61介导的癌症的药物中的用途，其中PPN/MG61抑制剂化合物选自小分子、抗体、scFv、反义寡聚物、小干扰RNA、小发卡RNA。
12.权利要求11的用途，其中该PPN/MG61抑制剂化合物为一种PPN/MG61特异性化合物。
13.权利要求12的用途，其中该PPN/MG61特异性化合物为一种小分子、肽或单链Fv片段。
14.权利要求12的用途，其中该PPN/MG61特异性化合物选自单特异性抗体，该抗体根据情况经一种细胞毒性药物的标记，该PPN/MG61特异性化合物还选自一种核酸探针，该核酸探针根据情况与PPN/MG61 mRNA杂交。
15.权利要求11的用途，其中所述药物与第二种医疗药物组合或与化疗组合。
16.权利要求15的用途，其中该第二种医疗药物为一种化疗药物。
17.一种药物组合物，其包含抑制PPN/MG61的化合物和药用赋形剂。
18.一种药物组合物，其包含PPN/MG61蛋白和药用赋形剂。
全文摘要
本发明涉及对人类Porcupine(PPN)/MG61的水平进行比较性检测的方法及其应用，Porcupine(PPN)/MG61蛋白为膜结合的O－酰基转移酶的一个家族成员，它是果蝇极性基因Porcupine(Porc)的人类同源物。
文档编号C12Q1/48GK1737159SQ20041007008
公开日2006年2月22日 申请日期2004年8月19日 优先权日2004年8月19日
发明者许军普, 秦晓华 申请人:北京雅康博生物科技有限公司