一种面向生物单细胞检测应用的两步压印方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及面向生物单细胞检测应用的两步压印方法，特别是一种基于两次压印工艺和图形复刻的方法研究。
[0002]主要是通过两次压印工艺，在生物活性材料薄膜的表面加工出高精度的微米级结构图形，在这些微米结构上培养观察微生物个体，可以实现生物单细胞检测。本发明实现简单方便，加工出的微米结构精度高，并且在实现生物单细胞检测时具有高通量、可控、可视化的优点，具有重要的实用价值和良好的应用前景。
【背景技术】
[0003]自然界中不同种类的微生物一般都是以群体的形式存在，个体之间通过某些特殊方法进行信息交流和沟通。近年来，研究人员对微生物种群中的个体之间信息交流方法的研究越来越广泛。由于这种个体间信息交流方法在自然界中普遍存在和广泛应用，因此通过研究微生物个体间的行为特征和信息交流，可以实现药物筛选、毒性检测等，参见Parsek，M.R.and E.P.Greenberg,Soc1microb1logy:the connect1ns between quorumsensing and b1films.Trends in Microb1logy，2005.13(I):p.27-33.。随着生物微操作技术的快速发展，3D打印，参见Connell，J.L.，et al., 3D printing ofmicroscopicbacterial communities.Proceedings ofthe Nat1nal Academy of Sciences of theUnited States of America，2013.110(46):p.18380-18385.、微流道、微腔和微滴发生器等方法，被广泛应用于生物单细胞检测领域，这些方法实现了对微生物个体间的信息交流和行为特征变化的高精度观察。以上所述方法尽管实现了生物单细胞检测，但是都需要昂贵的设备和较高的加工成本，难以应用在需要高通量的生物单细胞检测领域，并且在后期对微生物个体的行为特性进行观察统计时也不具备可视化的优点。
[0004]随着MEMS技术的快速发展，其被广泛应用在各个领域。微纳加工为单细胞生物检测领域提供了一种新的方法，而微纳压印由于其成本低廉、操作简单等优点，有很好的应用前景。热压印工艺是在微纳米尺度获得并行复制结构的一种成本低而速度快的方法，仅需一个模具，完全相同的结构可以按需复制到大的表面上。热压印由Stephen Y.Chou于1995年首次提出并申请专利，参见专利US5772905“Nanoimprint lithography”。
[0005]目前，基于生物活性材料的微压印工艺，在技术实现上还是遇到非常大的难题，这是因为微压印工艺及脱模过程中温度、压力条件单一且压印模板固定，很容易损坏生物材料的活性，不利于后续细菌或细胞的培养。
【发明内容】
[0006]本发明目的是针对基于生物活性材料的微压印工艺难以实现这一技术难题，提出一种面向生物单细胞检测应用的两步压印方法。
[0007]本发明技术方案:
[0008]—种面向生物单细胞检测应用的两步压印方法，步骤如下:
[0009]第1、在基底表面采用刻蚀法、生长法、电镀法、光刻法或沉积法制备微米结构作为模板，所制备的微米结构为倒金字塔、锥形或孔柱阵列;所述的基底材料为硅、镍、铜或锌等硬质薄板；
[0010]第2、热压印工艺前，为使脱模简单，在上述微米结构模板表面采用旋涂法、喷涂法、浸润法、蒸发法或溅射法制备疏水涂层，疏水涂层材料为本征静态接触角大于90度的任意疏水材料，得到带有疏水涂层的微米结构模板；
[0011]第3、基于上述第2步所述带有疏水涂层的微米结构模板，进行热塑性聚合物材料的一次热压印工艺，压印温度略高于热塑性聚合物材料的熔点，且在压印过程中通过晶圆镊子手动施加压力，并保持所施加压力的均匀性，经过2min-6min的压印时间，对模板和聚合物材料迅速冷却至室温，然后进行脱模工艺，经历一次热压印工艺的图形复刻，得到表面带有微结构的聚合物材料。
[0012]第4、以上述第3步带有微结构的聚合物材料为模板，进行生物活性材料的二次涂覆压印工艺。以旋涂、喷涂或浸润方法在聚合物模板表面涂覆一层配置好的生物活性材料，这种生物活性材料是用于实现生物单细胞检测过程中的细菌或细胞培养基，经过2°C_8°C低温环境冷藏8h-14h后，进行脱模工艺，聚合物材料的微米结构被复刻到生物活性材料薄膜表面。
[0013]本发明的优点和积极效果:
[0014]本发明方法创新性地提出一种两步压印工艺和图形复刻的方法，即一次热压印工艺和二次涂覆压印工艺。由于直接基于带有微结构的硅模板或者金属硬质模板的生物活性材料的单次压印方法中，脱模工艺比较困难，且容易损坏生物材料的活性，因此，根据本发明提出的方法，先进行基于带有微结构的硅模板或者金属硬质模板的热塑性聚合物材料的一次热压印工艺，把模板上的微结构图形复刻到热塑性聚合物薄膜上，然后以制得的聚合物薄膜为模板，进行生物活性材料的二次压印和脱模工艺，以此把硅模板或者金属硬质模板上的微结构完整地复刻到生物活性材料薄膜上。本方法实现简单方便，图形复刻精度高，经济效益好，且不损坏生物材料的活性，实现的单细胞生物检测具有高通量、可控、可视化的优点，应用前景广阔。
【附图说明】
[0015]图1为倒金字塔硅模板制备工艺流程图。
[0016]图2为两次压印工艺流程图。
[0017]图3为3维结构示意图，其中(a)为倒金字塔结构硅模板，(b)为脱模后TeflonFEP模板，(c)为脱模后明胶薄膜。
[0018]图4为刻蚀和两次压印工艺的SEM结果，其中(a)为倒金字塔硅模板SEM图，(b)为热压印后的聚合物Tef 1n FEP表面的SEM图，(c)为涂覆压印后的生物明胶材料表面的SEM图。
[0019]图中，I硅基底，2倒金字塔结构，3Tef1nFEP基底，4正金字塔结构，5生物明胶基底，6倒金字塔结构。
【具体实施方式】
[0020]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清晰明白的说明，下面就结合具体实施例对本发明进行解释说明，并不旨在表示可以构建或使用本发明示例的唯一形式。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，阐述本发明示例的功能，以及用以构建和操作本发明示例的步骤的序列，并不用于限定本发明的范围。
[0021]实施例1
[0022]—种面向生物单细胞检测应用的两步压印方法，步骤如下:
[0023 ] (I)在基底I表面采用刻蚀法局部制备微米结构2，所述基底I材料为硅片，所制备的微米结构2为倒金字塔形状，制备工艺具体如下:①清洗，将四寸硅片和掩膜板分别放入丙酮中，超声清洗15分钟，然后放入异丙醇中，继续超声清洗10分钟，最后将硅片和掩膜板放入去离子水超声清洗10分钟，用氮气枪吹干备用;