一种金属气管支架材料的通用改性方法及应用

1.本发明属于生物医用高分子材料和介入医学的交叉领域，具体涉及一种金属气管支架材料的通用改性方法及应用。


背景技术：

2.随着介入医学的发展，临床上对金属气管支架的需求越来越高，研发用于气管狭窄治疗的新型气管支架具有重要意义。目前，临床上使用的金属裸支架易引起接触部位肉芽组织增生。患者需接受二次手术治疗，术后易出现大咯血、气管黏膜撕裂、气管塌陷等并发症，严重危害了患者的预后质量。因此，研发可控编辑金属支架材料表面理化和生物学性能的加工技术至关重要。
3.目前，用于支架改性的技术主要包括浸渍涂层技术、静电纺丝技术、喷涂涂层技术和热熔涂层技术。虽然以上技术具有各自的优势，同时也存在一些不足，如在实际生产和应用中存在载药量不足、药物暴释、易崩解、毒副作用大、加工难度大等缺陷。电化学沉积技术(zou x,ji l,ge j,sadoway dr,edward ty,bard aj.electrodeposition ofcrystalline silicon films from silicon dioxide for low
‑
cost photovoltaic applications.nat commun 2019,10(1):1
‑
7)作为一种具有吸引力的涂层加工技术，其是采用常温电解的方法将金属、盐或氧化物薄而紧密的沉积于导电衬底材料表面。壳聚糖(riaz rajokams,zhao l,mehwish hm,wu y,mahmood s.chitosan and its derivatives:synthesis,biotechnological applications,andfuture challenges.appl microbiolbiotechnolog2019,103(4):1557
‑
1571)作为自然界唯一存在的天然碱性多糖，电解时，带正电的壳聚糖分子向阴极移动，阴极的局部高ph值环境使壳聚糖分子从溶液中析出，可沉积于支架材料表面形成薄而致密的壳聚糖涂层。因此，通过电沉积技术可制备得到具有壳聚糖涂层的气管支架，该改性方法不仅工艺简单、绿色环保和可控编辑，而且赋予支架优异的生物相容性。
4.此外，结合生物素
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链霉亲和素技术(serrano
‑
plana j,rumo c,rebelein jg,peterson rl,barnet m,ward tr，enantioselective hydroxylation of benzylic c(sp)
‑
hbonds by an artificial iron hydroxylase based on the biotin
‑
streptavidin technology，j.am.chem.soc.2020，142(24))可进一步获得多功能化的气管支架。例如，生物素通过与伯胺基反应从而对各种蛋白类物质(血管抑制肽、cd146抗体等)和壳聚糖分别进行生物素标记。标记后的蛋白类物质和壳聚糖可进一步通过链霉亲和素形成不可逆的化学交联。制备得到的功能化气管支架材料具有原位起效、作用持久、无药物暴释、全身毒副作用小等优势，能较好的克服现有药物洗脱支架存在的缺点与不足。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供了一种可控编辑金属气管支架的通用改性方法，所述改性方法主要是结合电化学沉积技术和生物素
‑
链霉亲和素
技术，在裸支架表面制备得到壳聚糖功能化涂层。
6.本发明选用壳聚糖为主要原料，其具有优异的生物相容性和生物可降解性，广泛用于体内组织工程。由于壳聚糖溶液的正电性和ph敏感性，可采用电化学沉积技术在裸金属支架表面制备得到具有优异生物相容性的壳聚糖涂层。为进一步增加壳聚糖金属支架的功能性，结合生物素
‑
链霉亲和素技术，可以将生物活性蛋白如血管抑制肽通过交联反应偶联在壳聚糖涂层上。所制备的壳聚糖功能化金属支架具有生物相容性、广谱抗菌性和抑制血管生成活性，有望通过调控炎症微环境达到抑制增生性瘢痕形成的效果。
7.为实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
8.一种金属气管支架材料的通用改性方法，其特征在于：包括如下步骤：以铂片为阳极，以导电金属气管支架为阴极，以壳聚糖溶液作为电解质进行电沉积加工，制备得到壳聚糖覆膜金属气管支架；采用商品化生物素化试剂盒分别标记壳聚糖覆膜金属支架和生物活性蛋白；采用链霉亲和素将壳聚糖覆膜金属支架和生物活性蛋白偶联起来，即可制备得到具有可控生物活性和生物相容性的新型气管支架材料。
9.所述的壳聚糖溶液的质量分数为0.5％
‑
1％，是通过将壳聚糖粉末缓慢溶解在0.5
‑
5％的稀盐酸或稀醋酸溶液中制备得到。
10.所述的电沉积的参数设置为：恒流电流：0.1
‑
1ma，通电时间：0.5
‑
5h。
11.所述的电沉积的参数设置为：电极间距：2
‑
10cm,铂片面积：1
‑
10cm2,恒流电流：0.1
‑
1ma，通电时间：0.5
‑
5h。
12.所述的生物活性蛋白包括但不限于：抗菌肽、成血管肽、多肽类生长因子以及抗体和病毒衣壳蛋白等。
13.本发明所获得的壳聚糖功能化金属支架中，结合的生物活性蛋白为血管抑制肽，该壳聚糖功能化气管支架可显著降低大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的克隆形成能力，展现出优异的广谱抗菌性能。此外，其可显著诱导人脐静脉内皮细胞(huvec)的细胞周期阻滞于g0/g1期，并抑制huvec细胞的体外迁移能力，具备抑制血管生成的能力。因此，本发明金属支架改性方法不仅工艺简单、绿色环保和可控编辑，而且赋予支架优异的生物相容性，在抑制增生性瘢痕形成上具有潜在的应用前景。
14.本发明具有如下优点和有益效果：(1)充分利用来源丰富、价格低廉的壳聚糖，原料及复合物均具有生物相容性；(2)采用工艺简单、绿色环保和可控编辑的的电沉积加工技术，可根据不同患者的临床需求，可通过优化溶液浓度、电流大小和电解时间等参数精准定制壳聚糖涂层的厚度和致密程度，从而调节支架材料的抗菌性和降解速率；(3)通过生物素
‑
链霉亲和素技术可实现不同蛋白类物质的结合，赋予支架多种功能；(4)该金属支架改性方法不仅为临床预防气道增生性瘢痕狭窄提供了一种性能优异的备选材料，还可以作为一种通用的加工策略推广于心血管支架、消化道支架和尿道支架等应用领域。
附图说明
15.图1是实施例1所获得的改性金属支架的流程图。
16.图2是实施例1和实施例2所获得的改性金属支架的实物图。
17.图3是实施例1所获得的壳聚糖功能化气管支架(图注中标记为modified scaffold)、金属支架(图注中标记为scaffold)、空白对照(图注中标记为b.c.)与大肠杆菌
(e.coli)和金黄色葡萄球菌(s.aureus)共培养的光镜图和统计分析结果，从左往右依次为空白对照组、金属支架组和壳聚糖功能化气管支架组，从上往下依次为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。
18.图4是实施例1所获得的壳聚糖功能化气管支架(图注中标记为modified scaffold)、金属支架(图注中标记为scaffold)、空白对照(图注中标记为b.c.)与人脐静脉内皮细胞(huvec)共培养的细胞周期结果和迁移结果，图4a为各组与huvec共培养后的细胞周期流式图，图4b为huvec在g0/g1期所占比例，图4c为各组与huvec共培养后的huvec的迁移图，
19.图4d为huvec的迁移统计结果。
具体实施方式
20.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
21.实施例1
22.将壳聚糖溶于1％hcl溶液中配制质量浓度为1％的壳聚糖溶液。向100ml壳聚糖溶液中加入0.2ml过氧化氢，混匀，常温超声5min。之后将阳极铂片和阴极金属支架浸没在上述100ml壳聚糖溶液中，设置两极距离为2.5cm。采用可编程直流电源在电极两端施加1ma的电流，作用1h后即可得到壳聚糖涂层的金属支架。
23.采用微波多肽合成仪合成血管抑制肽，并通过高效液相色谱仪进行分离纯化。之后，通过生物素标记试剂盒标记壳聚糖涂层的金属支架和血管抑制肽，然后在反应体系中加入适量链霉亲和素进行化学交联。最后获得壳聚糖功能化气管支架，标记为modified scaffold。获得的支架产品洗净备用。
24.将金属支架(图注中标记为scaffold)和空白对照(图注中标记为b.c.)分别作为阳性对照和阴性对照。
25.图1是实施例1所获得的改性金属支架的流程图，如图所示，铂片作为阳极，金属支架作为负极沉积壳聚糖，得到壳聚糖涂层支架；之后，壳聚糖与血管抑制肽通过生物素
‑
链霉亲和素系统进行化学交联，得到壳聚糖功能化气管支架。
26.实施例2
27.将实施例1中获得的壳聚糖涂层支架，流水下冲洗1h后使用光镜拍照。
28.图2为实施例1和实施例2所获得的壳聚糖涂层支架的光镜图片，如图可见，支架表面形成均匀透明的壳聚糖涂层。
29.实施例3
30.采用大肠杆菌(e.coli)和金黄色葡萄球菌(s.aureus)评价支架材料的广谱抗菌性。即将菌液od
600
值调整至0.2，然后加入支架材料共培养4h。吸取0.1ml的菌液逐级稀释10
‑2至10
‑7倍后均匀涂布于lb平板上，37℃恒温培养过夜后拍照并统计菌落数量。以抗生素溶液作为质控组，另设置空白对照组。抑菌率按照如下公式计算得到：
[0031][0032]
图3为壳聚糖功能化气管支架(图注中标记为modified scaffold)、金属支架(图注中标记为scaffold)、空白对照(图注中标记为b.c.)与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌共培
养的光镜图，从左往右依次为空白对照组、金属支架组和壳聚糖功能化气管支架组，从上往下依次为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。如图所示，壳聚糖功能化气管支架组的细菌存活率明显低于金属支架组和空白对照组，壳聚糖功能化气管支架可显著降低大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的克隆形成能力，具有优异的广谱抗菌性能。
[0033]
实施例4
[0034]
选取人脐静脉内皮细胞(huvec)构建细胞模型。将上述细胞接种于材料表面或浸提液中。共培养一段时间后，采用流式细胞术检测细胞周期分布。
[0035]
图4a为壳聚糖功能化气管支架(图注中标记为modified scaffold)、金属支架(图注中标记为scaffold)、空白对照(图注中标记为b.c.)与人脐静脉内皮细胞(huvec)共培养的细胞周期分布图，从左往右依次为空白对照组、金属支架组和壳聚糖功能化气管支架组。
[0036]
图4b为人脐静脉内皮细胞(huvec)与上述三组共培养后在g0/g1期所占比例。壳聚糖功能化气管支架可显著诱导huvec的细胞周期于g0/g1期，并抑制huvec细胞的体外迁移能力，证实具备抑制血管生成的能力。
[0037]
实施例5
[0038]
采用transwell实验评价支架材料对huvec细胞迁移能力的影响。将无血清细胞悬液接种于transwell小室上层，下层加入足量完全培养基，培养24h后统计下层迁移细胞的数目。
[0039]
图4d为所获得的壳聚糖功能化气管支架(图注中标记为modified scaffold)、金属支架(图注中标记为scaffold)、空白对照(图注中标记为b.c.)与人脐静脉内皮细胞(huvec)共培养后的huvec的迁移图，如图所示，壳聚糖功能化气管支架组的huvec数目低于金属支架组和空白对照组。
[0040]
图4c为人脐静脉内皮细胞(huvec)与上述三组共培养后迁移统计结果，如图所示，相比于金属支架组和空白对照组，壳聚糖功能化气管支架可显著抑制huvec细胞的体外迁移能力，证实具备抑制血管生成的能力。
[0041]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。