专利名称：采用心脏灌流法去除组织内红细胞制备分散的细胞悬液的方法
技术领域：
本发明涉及一种采用心脏灌流法去除组织内红细胞制备分散的细胞悬液的方法，属生物医学领域。
用荧光分光光度法测定细胞内阳离子浓度的变化有助于了解细胞功能的启动、加强或抑制，是研究某些疾病和药物作用机理的有效方法。其中，细胞制备的质量是研究胞内离子浓度变化的关键问题，通常规定细胞悬液中所的细胞的存活率必须大于90％，另一同样重要的问题是所制备的细胞悬液中不能有红细胞；否则将影响其测定值。文献中报道的组织红细胞的分离方法是将组织取出后，用Hank’s液冲洗数次，在解剖显微镜下将血管剔除、冲洗、以减少红细胞的含量。该方法很难达到既清除红细胞，又保证分散细胞达到90％以上存活率的要求，因若冲洗时间稍长，则细胞死亡率增加，若冲洗时间不足，组织内过多的红细胞将严重影响实验结果的可靠性和培养结果，且在显微镜下操作极不便。
本发明的目的在于克服现有技术之不足，而提供一种简便快捷，去除组织中的红细胞效果佳、细胞存活率高的采用心脏灌流法去除组织内红细胞制备分分散的细胞悬液的方法。
本发明是这样实现的该方法由分离组织内的红细胞、组织消化处理、离心和吹打工序制成。其中组织内红细胞分离里采用心脏灌流方法，即将Hank’s液或生理盐水通过左心室心尖部缓慢推入所测对象的心脏，待从心脏右心室流出的液体无色时，停止灌流，此时动物各脏器由红色变为无色，随后取出需测部位的组织，置于内盛Hank’s液的培养皿中冲洗，仔细剔除细胞膜，再置于内盛Hank’s液的小烧杯中剪碎成糜状，用胰蛋白酶消化，含小牛血清的DMEM终止消化，再经巴氏管吹打和离心过滤后得到细胞悬液。上述过程除心脏灌流法外，其余各工序均按常规方法进行。
本发明的实施例如下实例一(用心脏灌流法去除大脑组织中的红细胞制备分散的细胞悬液的方法)取出生0-2天的昆明种小鼠，酒精擦洗消毒后剪开肋骨，在露出心脏的右心耳处开一口，从左心室心尖部将注射器插入，缓慢推入Hank’s液，此时可见右心耳流出血液，最后流出无色灌流液，组织变为无色，每只小鼠需灌流0.5—1ml，历时10-15秒。灌流结束后取大脑组织置于内盛Hank’s液的培养皿中，剔除组织膜分离并取出所需的组织，用虹膜剪将组织剪碎成糜状，用0.125％胰蛋白酶在37°条件下消化，当组织变得透明略粘时，用含10％小牛血清的DMEM培养基终止消化。然后用200目的筛过滤，滤液经1000转/分的速度离心分离，弃上清后的沉淀用Hank’s液再洗一次，最后加入含血清的DMEM培养液，经巴氏管吹打成分散的细胞悬液备用。
实施例二(用心脏灌流法去除脏器组织中的红细胞制备分散的细胞悬液的方法)整个过程基本同实施例一，不同之处为灌流液为生理盐水，取大脑以外任一脏器部位的组织进行红细胞分离。
发明人经实例得到的采用心脏灌流法制备分散的细胞悬液的细胞死亡率及红细胞清除度的数据与常规方法所得数据的比较如下 本发明与现有技术相比，具有方法简便快捷，去除组织中的红细胞效果佳，分散的组织细胞存活率高等优点，适用于制备分散的组织细胞的细胞悬液，为细胞的培养和细胞的内离子测定提供符合要求的实验材料。
权利要求
一种采用心脏灌流法去除组织内红细胞制备分散的细胞悬液的方法，由组织红细胞分离，组织消化处理、离心和吹打工序制成，其特征在于组织内红细胞分离工序采用心脏灌流法，即将灌流液经左心室心尖部缓慢推入所测对象的心脏，待从心脏右心室流出的液体无色时，停止灌流，此时动物各脏器由红色变为无色，随后取出需测部位的组织并将其剪碎成糜状，然后将其置于盛有培养液的培养管中待用。
全文摘要
本发明涉及一种采用心脏灌流法去除组织内红细胞制备分散细胞悬液的方法,属生物医学领域。本发明与公知方法不同之处在于用心脏灌流分离组织中的红细胞。本发明具有方法简便快捷,去除组织中的红细胞效果佳,分散的组织细胞的存活率高等优点,可用于制备各种组织的分散的细胞悬液。
文档编号G01N1/34GK1336540SQ00122410
公开日2002年2月20日 申请日期2000年7月28日 优先权日2000年7月28日
发明者李朝翠, 蔡景霞 申请人:中国科学院昆明动物研究所