专利名称：用于表述培养液特征的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种根据专利权利要求1的前序部分所述的方法，以及用于实现所述方法的设备。
因此，光学检测器就很自然地被用于测量细胞对光的吸收、散射或者细胞所发出的荧光。不幸的是，通常这些方法不能区分细胞和其周围的液体。因此在密闭的生物反应器中很难获得关于细胞数量的详细消息。
根据DE 40 32 002 C2的方法和设备因此构成了一个实质性的进步。在使用该方法的情况下，细胞被照射并且被一个显微镜和一个摄像机成像，该图像由电子图像处理技术进行分析。不需要进行细胞取样。类似于计数腔室，用光学或机械的方法确定显微体积。由图像处理技术对细胞进行有选择地检测，并且确定细胞的密度、尺寸和形态。细胞漂浮于其中的溶液、伴生物、杂质和空气泡可以可靠地与细胞区别开。在现场的显微镜检查提供了作为测量值的细胞密度和细胞尺寸分布。由这两个值可以确定干的生物量。
然而，人们还想要得到的是确定培养液的活性。细胞样品的活性被定义为活细胞数除以总细胞数(活的和死的细胞的总和)的比值。对于工业规模的培养来说，活性是一个重要的参数。在这些工艺过程中，生物量被多次使用，直至死细胞分部变得很高，以致必须采用新的细胞培养为止。另一个应用的目的在于培养物的孕育处理如果细胞样品的活性和细胞密度是已知的，用于一种植培养物的孕育处理(例如酿造厂中加酵母菌)所需体积就可以计算出来。因此，如果借助于同一个样品可以确定绝对细胞密度和活性这将是一大进步。然而，至今还不能够对每个单独的细胞将细胞活性作为附加参数加以检测。
达到此目的的所述方法和设备揭示在专利权利要求1和10中。
在本发明的方法中，对细胞的照射采用的是暗场照射。在该照射装置中，形成图像的光线没有直接来自照射光源的光线，而仅有从被照射细胞发出的光，也就是说例如是散射光。在进行图像评价时，将细胞内部的发光强度与细胞边缘的发光强度进行比较。由此可以区分活细胞和死细胞，这样培养液的活性就可以被确定。
所述方法利用了细胞折射光线的特性。活细胞让光线基本上对准向前的方向，而死细胞则漫射地将光线折射到所有方向上。如果采用一种对细胞折射光进行角度选择性检测的光学装置，也就是说一个暗场装置，并且将后者做成一个现场观测的显微镜，就可以在反应器中直接检测细胞活性。
其他的优选改进结构将在权利要求2到9和11到20中明确说明。
图2显示了带有变化的照射装置的第二实施例；图3显示了一个实施例，该实施例除了提供暗场显微镜检查之外，还提供亮场显微镜检查；图4显示了一个实施例，该实施例除了提供暗场显微镜检查之外，还提供荧光显微镜检查；图5显示了一个实施例，该实施例除了提供暗场显微镜检查之外，还提供相位对比显微镜检查；以及图6显示了一个实施例，该实施例除了提供暗场显微镜检查之外，还提供干涉对比度显微镜检查。
在试样体积16的外侧安装一个显微镜物镜18，使该物镜18的光轴与管轴重合。在物镜18的与玻璃镜片12、14相对的一侧安装了一个电子图像记录器20，该图像记录器20的接收表面与物镜18的光轴呈现直角。从玻璃镜片14到物镜18的距离以及从物镜18到图像记录器34的距离是这样根据物镜18的焦距而选择的，以致一个物体，也就是说，特别是在试样体积16内的一个待检查的细胞22可以清晰地在图像记录器20的接收表面上成像。
在玻璃镜片12、14的与物镜18和图像记录器20相对的一侧是一个带有一个基本为点状的光源26的暗场聚光器24、一个布置在物镜18的光轴上的凸镜28和一个以径向对称形式并且基本上环绕着所述光轴布置的凹镜30，在
图1中该凹镜只被部分地显示出来。图1中所示的暗场聚光器24是所谓的心形聚光器。光源26的光线被凸镜28反射到凹镜30上，而凹镜30将光线反射成为一种弱会聚的旋转对称光束，与物镜18的光轴偏斜地进入到试样体积16中。因此，从凹镜30发出的光束在试样体积16中相互交叉并且在试样体积中射到细胞22上，从而使细胞得到照射。
以下将描述图1中的装置的操作模式。为了使试样体积16中的培养液固定不动，管10壁上的开口被密封住，这样其流动被阻断。然后，将可移动的玻璃镜片14向固定的玻璃镜片12的方向上移动，直到这两个玻璃镜片12、14之间的空间足够小，以致使试样体积16仅由很薄一层液体形成。该层的厚度将对应着物镜18的景深，这样所有在试样体积16中的细胞22都能够清晰地成像。
暗场聚光器24的光线射到细胞22上，但却并不直接传到物镜18中，因为后者被安装在暗场聚光器24的光路之外。因此，只有由被照射的细胞22所发出的光进入到物镜18中，并且所述的光在图像记录器20的光敏接收表面上产生了一个清晰的细胞22的图像。该图像被数字化并且由图像处理软件进行分析。
为了将活细胞22和死细胞22区分开，利用了这样一个事实，即在通过暗场照射而进行所述的成像的情况下，活细胞的内部显得比其边缘暗得多，而死细胞的内部与其边缘基本上一样明亮。因此，借助于比较各细胞的边缘与内部的亮度通过图像处理方法，能够以一种简单的方式对培养液活性进行评估，从而在此基础上决定所涉及的细胞是活的还是死的，然后确定在总的细胞数中所占的活细胞的分额。
如果细胞22仅在图像记录器曝光的时间内(约1/50秒)被短暂照射，可以不用通过密封开口来使试样体积16中的培养液固定不动，这样尽管有细胞22的运动，也能够产生清晰的图像。通过对光源26进行脉冲操作可以获得这种短暂的照射。例如，闪光灯、LEDs和激光都适合作为光源26。
图2显示了一个与图1的装置相类似的第二实施例，该实施例包括一个带有多个点状光源32、34的暗场聚光器，其中两个对置的光源以示例的方式显示在图2中。这些光源32、34被配置成王冠状并且关于光轴旋转对称。其光线由透镜36、38聚焦到试样体积16中，这样就产生了一条与图1的心形聚光器18相对应的光路，其中这些透镜36、38的光轴相互交叉于试样体积16中的一点。
图3显示了本发明的设备的另一实施例，该实施例除了可以进行暗场显微镜检查之外，同时还可以进行亮场显微镜检查。为此，该装置带一个聚光器24，所述聚光器24是一个带有一个基本上为点状光源26、一个凸镜28和一个环绕着显微镜的物镜18的光轴布置的凹镜30的装置，所述装置与图1所示的心形聚光器24相对应，可以进行在图1中所描述的对试样体积16的暗场照射。然而，与图1中所示的聚光器24不同的是，凸镜28被设计用来将一部分从光源26发出的光线反射到凹镜30上，而让其余部分的光线穿过。该透射的部分穿透地照射试样体积16，这样穿过培养液和细胞22的部分可以进入物镜18中，并且在图像记录器20上产生一个图像。这样，在图像记录器20上总共产生了两个图像一方面，是通过细胞22的暗场照射所形成的被照射细胞的图像，另一方面，是透过细胞22的亮场照射光线的透射图像。为了将这两个图像分离开，将一个分光立体块布置在显微镜物镜18和图像记录器20之间的光轴上，该分光立体块将一部分进入到分光器44的光线以垂直于光轴的方向反射。这条光线投射到与第一图像记录器20同样设置的第二图像记录器42上，以便生产一个图像并对其进行数字化处理。
图像的处理要求从光学上将这两个图像相互分开。这一点是通过以下的方法完成的使两种类型照射的光线，也就是说，暗场照射和亮场照射的光线发生偏振，并且根据在图像光路中的不同偏振方向，利用一个偏振分光器44，再次使从试样体积16进入到物镜18的光线分离，这样透过分光器44的光线对应于第一偏振方向，而被分光器44反射的光线对应于与第一偏振方向垂直的偏振方向。用于不同照射的光线的偏振编码是通过凸镜28上的偏振涂膜来进行的，该涂膜的效果是使从凸镜24反射的用于暗场照射的光线在第一方向即与图面垂直的方向上发生偏振，从而使得由于暗场照射而从细胞22发出进入到显微镜物镜18的光线对应于该偏振方向。分光器44是这样布置的，即它反射在该方向偏振的光线并且在第二图像记录器42上产生一个起源于暗场照射的图像。相反，透过凸镜28的光线的偏振方向与被反射的光线的偏振方向呈现直角，这样透过细胞22并且进入到显微镜物镜18中的光线同样在该方向上偏振并且也透过分光器44，从而在第一图像记录器20上产生了一个对应于亮场照射的图像。
以类似的方式，用于暗场照射和亮场照射的光线可以进行颜色编码，这样用于暗场照射的光线与亮场照射的透射光线有不同的波长。通过以没有显示的方式放置在各图像记录器20、42之前的相应滤色镜，就可以对由各种照射产生的图像进行简单的区分。
还可以省略第二图像记录器42和分光器44，这样两个图像都产生在一个图像记录器20上。在这种情况下，利用了数字图像记录器的每个像素分别只对一种颜色(红，绿或黄)敏感的特性。通过在每一种情况下读出总是对一种颜色敏感的像素并且将它们组合起来以形成一个图像的方式，就这样可以出现不同颜色的图像。
一种非常简单类型的颜色编码包括设置一个宽光谱带的光源和对凸镜28进行二向色性的涂膜，这样它将反射一个波长的光线，而使另一个波长的光线透过。
另外，也可以设置不同的单色光源，例如，LEDs或激光用于两种照射光路。
图4中所显示的装置还适合于除了进行暗场显微镜检查之外，还进行荧光显微镜检查。该装置一方面设置了由图1可知的暗场聚光器24。另外还在与暗场聚光器24相对置的管区域中设置了另一个光源46，该光源46相对于显微镜物镜18的光轴偏置且其光线由一个分光器48在显微镜物镜18的方向上反射90度角，并且由后者聚焦到试样体积16中。安装在荧光源46和分光器48之间的是一个滤光镜50，该滤光镜50在光谱上压缩从荧光源46发出的激励光。该激励光激励试样体积16中的细胞22发出荧光，并且使发出的荧光在相反的方向上透过显微镜物镜18并且投射到分光器48上。分光器48是这样设计的，即与激励光相反，它可以透过在光谱上移到较高波长的荧光，并且可以在图像记录器20上进行荧光成像。结果，在图像记录器20上产生了两个不同的图像，即以通常的方式由暗场照射产生的图像，和一个荧光图像。暗场图像和荧光图像的分离是通过已描述的对图像记录器20进行转储分离的分离方法来进行的，也就是说是通过分离不同不同色敏感度的像素的数据来进行的。另外一种可能性在于，通过以快速的次序使暗场聚光器24的光源26和荧光源46产生脉冲并且以瞬间分开的形式读出图像记录器20上的图像的方式，可以瞬间分离图像。
图5显示了一个装置，该装置适合于除了进行暗场显微镜检查外同时进行相位对比显微镜检查。所显示的装置基本上对应于图3。暗场聚光器24的凸镜26被加上涂层从而这样进行偏振，即它反射在一个方向偏振的光线，并且透射与其垂直的偏振方向偏振的光线，因此对试样体积16的暗场照射和亮场照射同时进行。如图3中所示，在成像光路上设置了一个分光器44，该分光器44反射在一个方向偏振的光线，并且透射在与其垂直的方向偏振的光线，这样透射光可以在一个布置在显微镜物镜18的光轴上的图像记录器20上产生一个图像，而反射光的图像可以产生在另外一个在反射方向上的图像记录器42上。以这种方法，由不同照射类型所产生的图像可以通过偏振的方法加以区分，正如参考图3所充分描述的那样。
与图3不同，一个用于相位对比显微镜检查的装置被布置在亮场光路上。所述装置包括一个正好配置在凸镜后面的环形光阑52，以及一个布置在显微镜物镜18与分光器44之间的移相板54。所述环形光阑52和移相板54与显微镜物镜18的光轴成直角。光源26的透过凸镜28的光线首先通过环形光阑52，并且在通过试样体积16之后进入显微镜物镜18，而该显微镜物镜借助于移相板54和分光器44，聚焦在第一图像记录器20上。比起图3所示的简单亮场照射装置，该本身已知的相位对比装置产生更高的对比度。
图6所示的装置除了可进行暗场照射显微镜检查之外，还提供了干涉对比显微镜检查。这种设计基本上与图5所示的用于相位对比的装置对应，但是在图6中，环形光阑52被一个λ/4板56和一个安装在该λ/4板56之后的沃拉斯顿棱镜58替代，并且在显微镜物镜18和分光器44之间的成像光路上，没有采用图5中的相位板54，而是采用了一个第二沃拉斯顿棱镜60。另外，一个附加的分析器62被插入到分光器44和第一图像记录器20之间的透射光路上。
凸镜28被用已知的方法加上涂层，可以这样进行偏振，即透过凸镜28的光线被偏振。这种光线穿过λ/4板56和第一沃拉斯顿棱镜58，该棱镜58将各光束分成两束不同的偏振光射入到试样体积16内。如果光束在那投射到一个物体上，例如投射到一个细胞22上，该物体可以引起不同光束的光路产生差别。穿过试样体积16的光束由显微镜物镜18聚焦并且投到第二沃拉斯顿棱镜60上，该棱镜60重新将两束光结合起来。这些光束通过分光器44投到第一图像记录器20上，并且在此产生一个干涉对比图像。由于试样体积16中的物体所产生的光路的差别，因此产生了一个有高对比度的图像，通过沿显微镜物镜18的光轴移动第二沃拉斯顿棱镜60，可以改变对比度。
对于已经讨论的装置，除了干涉对比成像以外，还可以在第二图像记录器42上产生一个由分光器44的反射光束形成的图像，该图像以已知的方法来自于暗场照射。
权利要求
1.一种用于表述培养液特征的方法，特别是表述在一个生物反应器中的培养液的特征的方法，其中通过对包含在所述培养液中的细胞(22)进行照射，对细胞(22)进行显微镜成像，并且通过对所述显微镜图像的评价，对所述培养液进行现场分析，其特征在于所述照射是由暗场照射实现的，并且所述图像评价包括将从细胞内部和从细胞边缘发出的光的强度进行对比，通过所述对比来区分活细胞和死细胞(22)，以便确定所述培养液的活性。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于除了进行暗场照射以外，还进行亮场照射。
3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于还进行用于荧光激励的照射，并且图像评价包括观测由细胞(22)发出的荧光。
4.根据权利要求1到3之一的方法，其特征在于还进行对细胞(22)的干涉对比观测。
5.根据权利要求1到4之一的方法，其特征在于还进行对细胞(22)的相位对比观测。
6.根据权利要求2到5之一的方法，其特征在于不同的偏振光被用于各种类型的照射，并且借助于产生各图像的光线的不同偏振，区别由各种照射产生的图像。
7.根据权利要求2到6之一的方法，其特征在于不同波长的光线被用于各种类型的照射，并且借助于产生各图像的光线的不同波长，区别由各种照射产生的图像。
8.根据权利要求1到7之一的方法，其特征在于所述照射是由脉冲光实现的。
9.根据权利要求1到8之一的方法，其特征在于为了进行图像评价，在成像过程中，培养液的待成像的试样体积(16)暂时被固定。
10.一种用于表述培养液特征的设备，特别是用于表述生物反应器中的培养液的特征的设备，所述设备有一个照射装置(24)用于对培养液的试样体积(16)进行照射、一个显微镜物镜(18)用于对试样体积(16)中的细胞进行成像和一个图像评价装置(20)用于分析所述图像，其特征在于所述照射装置(24)被设置用于暗场照射，而图像评价装置(20)被设计用于将从细胞内部和比细胞边缘发出的光的强度进行对比，并且用来在此对比的基础上区分活细胞和死细胞。
11.根据权利要求10的设备，其特征在于所述照射装置(26)、显微镜物镜(18)和图像评价装置(20)都布置在一根管(10)中，所述管(10)的壁上带有一些开口，以便培养液流过所述试样体积(16)。
12.根据权利要求11的设备，其特征在于所述试样体积(16)的厚度由两个玻璃镜片(12，14)限制，所述两个玻璃镜片与显微镜物镜(18)的光轴垂直，其中至少一个镜片可以沿所述光轴移动。
13.根据权利要求11或12的设备，其特征在于所述管(10)上带有关闭所述开口的装置，以便固定所述试样体积(16)。
14.根据权利要求10到13之一的设备，其特征在于所述照射装置(24)用于进行脉冲操作。
15.根据权利要求10到14之一的设备，其特征在于所述照射装置(24)还被设计成用于亮场照射。
16.根据权利要求10到15之一的设备，其特征在于有一个对培养液进行荧光激励的荧光源(42)，所述图像评价装置(20)设置用于对从细胞(22)发出的荧光进行分析。
17.根据权利要求10到16之一的设备，其特征在于为了对细胞(22)进行干涉对比观测，在照射装置(24)的光路中安装第一沃拉斯顿棱镜(58)，并且在成像光路中安装第二沃拉斯顿棱镜(60)。
18.根据权利要求10到17之一的设备，其特征在于为了对细胞(22)进行相位对比观测，在照射装置(24)的光路中安装一个环形光阑(52)，并且在成像光路中安装一个移相板(60)。
19.根据权利要求10到18之一的设备，其特征在于在照射装置(24)和/或荧光源(42)的光路中布置一些偏振装置(24)，并且在成像光路中布置一些偏振选择装置(44)。
20.根据权利要求10到19之一的设备，其特征在于在照射装置(24)和/或荧光源(42)发出光的光路中，设置一些单色化装置(24、50)，或者光源(26，46)本身就是单色的，并且在成像光路中布置一些波长选择装置(44)。
21.根据权利要求19或20的设备，其特征在于所设置的偏振选择或波长选择装置是分光器(44)，所述分光器(44)透射第一偏振的或波长的光线，以便在第一图像记录器(20)上成像，并且将第二偏振的或波长的光线反射到第二图像记录器(42)上。
全文摘要
一种用于表述培养液特征的方法，特别是表述在一个生物反应器中的培养液的特征的方法，其中通过对包含在所述培养液中的细胞(22)进行照射，对细胞(22)进行显微镜成像，并且通过对所述显微镜图像的评价，对所述培养液进行现场分析。所述照射是由暗场照射实现的，并且所述图像评价包括将从细胞内部和从细胞边缘发出的光的强度进行对比，通过所述对比来区分活细胞和死细胞(22)，以便确定所述培养液的活性。
文档编号G01N21/21GK1399717SQ00814173
公开日2003年2月26日 申请日期2000年10月11日 优先权日1999年10月11日
发明者克里斯托弗·比特纳 申请人:因诺瓦蒂斯有限公司