专利名称：多功能分子雷达的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种多功能分子雷达，是一种新型生物测量仪器。通过光路和探测系统的整合，它可以在同一套装置上实现激光扫描共焦荧光成像、双光子荧光成像、单光子和双光子荧光关联谱仪、梯度场荧光关联谱仪的全部功能，实现对活细胞体系中特定生化成份的成像和目标分子的运动学测量。
已有的激光扫描共焦荧光显微镜基本装置如
图1所示单光子共焦成像采用可见波段激光(波长一般为488nm)进行荧光激发。激发光经衰减片(11)衰减后，透过低通双色分束片(5)(波长小于488nm时透过)，再经过X-Y扫描振镜组(4)实现光束扫描，最后通过高数值孔径显微物镜(3)聚焦在溶液或活细胞样品(2)中。聚焦区域(1)内特定荧光粒子所发出的背向荧光被显微物镜(3)收集，经过X-Y扫描振镜组(4)之后，被低通双色分束片(5)反射，再经过滤光片(6)去除散射的激发光和其他杂光，然后由透镜(7)会聚于孔径可调的共焦小孔上(8)上，被探测器(9)接收后输入到信号系统(10)进行信号采集与处理。共焦小孔与聚焦点(1)的像大小一致，利用空间滤波抑制焦点区(1)以外的荧光以及杂散光，提高荧光测量的信噪比。上述装置技术成熟，一般用于活细胞体系的成像研究，但由于其采用的激发光源为可见或偏紫外，因此在长时间观测中对活细胞内的杀伤作用较大，而且其采用的波长单一，无法实现连续可调。
双光子荧光显微镜装置基本与共焦显微镜相同，如图2所示荧光激发光源采用红外波段飞秒激光器，波段为680-1080nm；高通双色分束片(12)对于波长大于680nm的激发光束透过，可见波段荧光被反射。另外，由于只有在焦点处能够产生双光子荧光，不需要空间滤波，因而探测器前不加共焦小孔，该装置的主要特点是采用了波长较长的红外激发光，对活细胞样品的杀伤作用较小，可适用于长时间对样品的观测研究，由于其波长连续可调，对于荧光染料选择余地较大。但由于该项技术较新，其实用领域还有待进一步探索。
已有技术中，针对活细胞或溶液体系，为了测量生物分子的结构变化、微观化学反应、细胞内酶动力学等过程信息，一般采用荧光关联谱仪。其原理是通过测量微区内少量发光分子的荧光涨落信号，并对其作关联分析，从而得到有关荧光分子浓度、扩散速度等影响涨落的物理制信息。
单光子与双光子激发荧光关联谱仪的基本光路分别为图3和图4，其结构分别与共焦荧光显微镜和双光子荧光显微镜相似。主要区别在于图一和图二中的X-Y扫描振镜组(4)被全反射镜(13)分别取代。另外，荧光关联谱仪的探测器为雪崩二级管单光子计数器(16)，信号系统(17)中采用多路定标器和自关联卡记录数据，数据处理与系统控制软件也与扫描荧光显微镜完全不同，包括自关联数据处理与最小二乘法拟合功能，以便从实验数据中获得荧光粒子的扩散系数和焦点区域内荧光粒子数目等一系列参数。该装置采用的技术属于单分子探测领域，操作难度较大，适用于细胞体系中目标生物分子的动力学测量。
综上所述，现有扫描荧光显微镜和荧光关联谱仪都是独立系统，功能单一。实际研究中，针对一个具体的生物体系开展研究时，多参数复合测量是非常必要的。扫描成像的方法可以获得细胞层次的信息，荧光关联谱仪的方法可以获得分子层次的信息。因此，在现有条件下，对一个特定生物对象进行成像研究时，若需要同时对该对象的特定部位开展分子动力学方面的研究，需将其再移到荧光关联谱仪上，由于在移动过程中的研究环境会发生变化，同时要将成像区域与荧光关联谱仪的研究区域相对应也有相当的难度，其操作过程也较复杂，大大影响了实验结果的准确性。同时，建立两套独立的系统所需的光学器件数目较多，也存在一定程度上的浪费。
本发明设计的多功能分子雷达，包括激发光源部分、样品激励与荧光收集部分以及荧光信号探测与处理部分。激发光源部分包括可见激发光衰减片、红外激光衰减片和高通分束片；样品激励与荧光收集部分包括激光聚焦点、显微物镜和X-Y扫描振镜组；荧光信号探测与处理部分包括带通分束片、滤光片、聚焦透镜、可调共焦小孔、探测器和信号系统。可见波段激发光经衰减片衰减，高通双色分束片反射后，透过多波段带通分束片再经过X-Y扫描振镜组实现光束扫描，最后通过高数值孔径显微物镜聚焦在样品上。聚焦区域内特定荧光粒子所发出的背向荧光被显微物镜收集，经过X-Y扫描振镜组之后，被多波段带通分束片反射，再经过带通滤光片去除散射的激发光和其他杂光，然后由透镜会聚于孔径可调的共焦小孔上，被雪崩二级管单光子计数器接收后，输入到信号系统进行信号处理，得到荧光图像与荧光关联谱图。
使用本发明设计的多功能分子雷达，实现了激光扫描双光子(共焦)荧光显微镜与荧光关联谱仪的一体化，在一套系统上、针对同一个样品，进行了不同类型的多种测量，实验装置和仪器调节过程简单，提高了工作效率。
图1是共焦扫描荧光显微镜结构示意图。
图2是双光子扫描荧光显微镜结构示意图。
图3是单光子激发荧光关联谱仪结构示意图。
图4是双光子激发荧光关联谱仪结构示意图。
图5是本发明设计的多功能分子雷达结构示意图。
图1～图5中，1是激光聚焦点，2是样品，3是显微物镜，4是X-Y扫描振镜组，5是低通双色分束片，6是滤光片，7是聚焦透镜，8是共焦小孔，9是探测器(光电倍增管)，10是信号系统(成像)，11是可见激发光衰减片，12是高通双色分束片，13是滤光片，14是红外激光衰减片，15是双色分束片，16是探测器(单光子计数模块)，17是信号系统(荧光关联谱)，18是带通分束片，19是滤光片，20是可调共焦小孔，21是信号系统(成像与荧光关联谱)，22是高通分束片，I是激发光源部分，II是样品激励与荧光收集部分，III是荧光信号探测与处理系统。
使用本发明的多功能分子雷达，在一套系统上进行了下列五种不同的测量过程1、本发明具有激光扫描共焦荧光成像功能，已开展小鼠卵母细胞中钙成像研究。可见波段激发光(实验中选波长488nm激光)经衰减片(11)衰减，高通双色分束片(22)(对可见波段激发光反射，对红外波段激发光透射，实验中反射488nm激发光)反射后，透过多波段带通分束片(18)(透过红外与可见激发光，反射波长介于红外与可见激发光之间的荧光与波长小于可见光的荧光)，再经过X-Y扫描振镜组(4)实现光束扫描，最后通过高数值孔径显微物镜(3)聚焦在溶液或活细胞样品(2)中(实验中选用染有Fluo3的小鼠卵母细胞)。聚焦区域(1)内特定荧光粒子所发出的背向荧光(实验中Fluo3发出波长为514nm的荧光)被显微物镜(3)收集，经过X-Y扫描振镜组(4)之后，被多波段带通分束片(18)反射，再经过带通滤光片(19)去除散射的激发光(包括可见激发光与红外激发光)和其他杂光，然后由透镜(7)会聚于孔径可调的共焦小孔上(20)上，被雪崩二级管单光子计数器(16)接收后。输入到信号系统(21)，配合以光子计数卡对信号进行连续纪录，经处理后输出图像，开展细胞内钙成像研究。
2、本发明具有激光扫描双光子荧光成像功能，已开展小鼠卵母细胞中钙成像研究。荧光激发光源采用红外波段飞秒激光器(实验中激光波长选为720nm，荧光染料选用Indo-1)；经红外衰减片(14)衰减后，透过高通双色分束片(22)后按照与前述单光子共焦测量完全相同的光路进行激发和成像。但由于只有在焦点处能够产生双光子荧光(波长490nm)，不需要空间滤波，探测器共焦小孔(20)调到最大，使荧光完全通过。开展细胞内钙成像研究。
3、本发明具有单光子荧光关联谱测量功能，已开展溶液中荧光小球的动力学研究。使用光路和操作与单光子共焦荧光成像基本相同。主要区别在于X-Y扫描振镜组(4)锁住，指向样品中一个确定点，具体位置由软件控制。另外，荧光关联谱仪的信号系统(21)中包括多路定标器和自关联卡两种数据记录硬件，可以利用软件计算自关联，或利用硬件实时记录自关联函数。信号系统软件还可以对自关联函数进行最小二乘法拟合，以便从实验数据中获得荧光粒子的扩散系数和焦点区域内荧光粒子数目等一系列参数。实验中激发光采用波长488nm的激光，荧光小球受激后发出波长515nm的荧光，最后得到小球的动力学参数，如扩散系数，样品浓度等。
4、本发明具有双光子荧光关联谱测量功能，已开展溶液中荧光小球的动力学研究。使用光路和操作与双光子荧光成像基本相同。主要区别如前一节所述X-Y扫描振镜组(4)锁住，指向样品中一个确定点。另外，信号系统(21)中采用多路定标器和自关联卡记录数据，最小二乘法拟合。实验中激发光采用波长850nm的激光，荧光小球受激后发出波长505nm的荧光，最后得到小球的动力学参数，如扩散系数，样品浓度等。
5、本发明具有梯度场荧光关联谱测量功能，已开展溶液中荧光小球在外加激光梯度场中的动力学研究。其光路和操作过程与单光子荧光关联谱测量基本相同，区别在于实验中，飞秒激光器失锁模，作为红外连续激光器使用，提供激光梯度场(实验中选取波长为780nm的连续激光)。可见波长的激发光作为激励光源(实验中选用波长488nm的激光)。两束激光经分束片(22)后合束，并由成像系统聚焦于样品(2)中同一个探测点(1)。
权利要求
1.一种多功能分子雷达，其特征在于该分子雷达包括激发光源部分、样品激励与荧光收集部分以及荧光信号探测与处理部分；所述的激发光源部分包括可见激发光衰减片、红外激光衰减片和高通分束片；所述的样品激励与荧光收集部分包括激光聚焦点、显微物镜和X-Y扫描振镜组所述的荧光信号探测与处理部分包括带通分束片、滤光片、聚焦透镜、可调共焦小孔、探测器和信号系统；可见波段激发光经衰减片衰减，高通双色分束片反射后，透过多波段带通分束片再经过X-Y扫描振镜组实现光束扫描，最后通过高数值孔径显微物镜聚焦在样品上，聚焦区域内特定荧光粒子所发出的背向荧光被显微物镜收集，经过X-Y扫描振镜组之后，被多波段带通分束片反射，再经过带通滤光片去除散射的激发光和其他杂光，然后由透镜会聚于孔径可调的共焦小孔上，被雪崩二级管单光子计数器接收后，输入到信号系统进行信号处理，得到荧光图像与荧光关联谱图。
全文摘要
本发明涉及一种多功能分子雷达,包括激发光源部分、样品激励与荧光收集部分以及荧光信号探测与处理部分,可见波段激发光经衰减片衰减,高通双色分束片反射后,透过分束片再经过扫描振镜组实现扫描,最后通过高数值孔径显微物镜聚焦在样品上,特定荧光粒子发出的背向荧光被显微物镜收集,经过扫描振镜组后被分束片反射,再经过带通滤光片去除散射的激发光等,然后由透镜会聚于共焦小孔上,被单光子计数器接收后,输入到信号系统进行处理,得到荧光图像与荧光关联谱图。使用本发明的多功能分子雷达,可以在一套系统上、针对同一个样品,进行了不同类型的多种测量,实验装置和仪器调节过程简单,提高了工作效率。
文档编号G01N33/52GK1349093SQ0113667
公开日2002年5月15日 申请日期2001年10月26日 优先权日2001年10月26日
发明者马辉, 丁尧, 孙非, 刘广, 金雷, 陈瓞延 申请人:清华大学