筛选方法

专利名称：筛选方法
技术领域：
本发明涉及筛选高血压病、紧张性疾病等的预防或治疗药物或调节食欲的药物等方法，其特征为，包括应用来源于人睾丸和大鼠子宫的新型受体蛋白，即TGR-1，还有编码TGR-1的DNA、TGR-1和神经介肽U(Minamino，N.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.130，1078-1085，1985等)或其衍生物或其盐。
背景技术：
多数的激素和神经递质通过细胞膜上的特异受体调节着机体的功能。这些受体大多通过偶联的鸟苷酸结合蛋白(guanine nucleotide-binding protein，以下简称G蛋白)活化进行细胞内的信息传递，同时具有7个跨膜区共同的结构，总称为G蛋白偶联型受体蛋白或7跨膜型受体。
这样的激素和神经递质与G蛋白偶联型受体的相互作用进行机体内的重要机能调解，如维持机体内的平衡、生殖、个体发育、代谢、生长、神经系统、循环系统、免疫系统、消化系统、代谢系统的调解、刺激反应等。人们已得知，这样的针对机体功能的调解存在各种各样的激素和神经递质的受体蛋白，并完成各自机能的调解，但是，是否还存在未知的物质(激素和神经递质等)以及针对这些物质的受体呢，关于这些问题现在还不清楚。
近年来，通过利用G蛋白偶联型受体蛋白的一部分构造具有氨基酸排列的类似性，根据聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，以下简称PCR)法探索编码新型受体蛋白的DNA，通过实施该方法，多数的配体不清楚的所谓孤儿G蛋白偶联型受体蛋白被克隆(Libert，F.，et al.Science，244，569-572，1989；Welch，S.K.，et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，209，606-613，1995；Marches，A.，etal.，Genomics，23，609-618，1994；Marches，A.，et al.，Genomics，29，335-344，1995)。还有基因组DNA或者cDNA的随机排列来确定G蛋白偶联型受体蛋白(Nomura，N.，et al.，DNA Research 1卷，27-35页1994年)。所述作为确定这些孤儿G蛋白偶联型受体蛋白的配体的一般方法，只有从G蛋白偶联型受体蛋白的一级结构的相似性上判断。但是很多孤儿G蛋白偶联型受体蛋白大多与已知受体的同系性不高，实际上，除了已知配体受体的亚型之外，仅仅用一级结构的相似性来判断其配体是很难的。另外，虽然可以从基因分析上判断，从很多孤儿G蛋白偶联型受体的发现相应地还有很多未知配体的存在，然而迄今为止事实上能够鉴定的孤儿G蛋白偶联型受体蛋白的例子很少。
还有，神经介肽U是一种从猪的脊髓中分离纯化的肽，其作为大鼠子宫平滑肌收缩活性的指标，最早报道的2种神经介肽U是，由8个氨基酸残基组成的神经介肽U-8和由25个氨基酸残基组成的神经介肽U-25(Minamino，N.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.130，1078-1085，1985)。神经介肽U-8的氨基酸排列与神经介肽U-25 C末端部分一致，在其上游断裂，由该断裂的部位观察到碱性氨基酸对的存在，由此可认为该两者来源于共同的前体。神经介肽U除了具有平滑肌收缩作用之外，其他的生理作用也广为所知，例如有报道说，神经介肽U具有增加血压(Minamino，N.et al)，降低内脏器官的血流(Sumi，S.et al.，Life Sci.41，1585-1590，1987)，调节肠管内离子运输(Brown.D.R.and Quito，F.L.，Eur.J.Pharmacol.155，159-162，1988)以及皮下给药后导致ACTH及其后来的皮质酮的增加(Malendowicz，L.K.et al.，InVivo，7，419-422，1993)。

发明内容
FM-3曾经被报道(WO 00/02918)作为神经介肽U的受体，然而现在必须寻找FM-3以外的受体，进一步从各个角度弄清神经介肽U的生理作用，筛选激活或抑制其机构的化合物从而开发新的药物。
本发明人，为了解决上述课题进行了认真仔细的研究，结果发现了孤儿G蛋白偶联型受体蛋白的TGR-1，还出乎意料地发现神经介肽U对表达该TGR-1的CHO细胞具有特异的细胞刺激活性。根据这些发现，进一步对其结果进行讨论，完成本发明。
即，本发明提供，
(1)一种化合物或其盐的筛选方法，该化合物或其盐能使神经介肽U或其盐和、含有与SEQ ID NO1或21所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白质或其盐之间的结合特性发生改变，其特征包括应用神经介肽U或其衍生物或其盐和、含有与SEQ ID NO1或21所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白质或其盐；(2)一种用于筛选化合物或其盐的试剂盒，该化合物或其盐能使神经介肽U或其盐和、含有与SEQ ID NO1或21所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白质或其盐之间的结合特性发生改变，其特征为，该试剂盒包含神经介肽U或其衍生物或其盐和、含有与SEQ ID NO1或21所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白质或其盐；(3)一种化合物或其盐，其能使神经介肽U或其盐和、含有与SEQ IDNO1或21所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白质或其盐之间的结合特性发生改变，所述化合物或其盐通过(1)中所述筛选方法或(2)中所述筛选试剂盒而获得；(4)一种包含(3)中所述化合物或其盐的药物；(5)(4)中所述药物是治疗和预防肥胖病、高血压病或紧张性疾病的药物；(6)(1)中所述的筛选方法或(2)中所述的用于筛选的试剂盒，其中，所述神经介肽U为含有与SEQ ID NO11所示氨基酸序列相同或基本相同的序列肽；(7)一种蛋白质或其盐，其特征在于，所述蛋白质具有与SEQ ID NO1或21所示氨基酸序列相同或基本相同的序列；(8)一种DNA，其包含编码(7)中所述的蛋白质；(9)(8)中所述的DNA，其具有SEQ ID NO2或22所示的碱基序列；(10)一种重组载体，其包含(8)中所述的DNA；(11)一种转化体，其通过(10)中所述的重组载体转化而成；(12)一种(7)中所述的蛋白质或其盐的生产方法，其特征在于，培养(11)中所述所述的转化体，使之生成(7)中所述的蛋白质；(13)一种针对(7)中所述的蛋白质或其盐的抗体。
关于本发明的神经介肽U，具体的例子除了上述的神经介肽U或其盐等之外，还有，
(14)神经介肽U或其衍生物或其盐等的例子包含SEQ ID NO5、6、7、8、9、10、12、13、14或15所示氨基酸序列的蛋白质(多肽)；另外，优选本发明的神经介肽U在其C末端氨基酸残基上的羧基为酰胺物。
本发明的TGR-1意味着是蛋白质或其盐，该蛋白质或其盐包含与所述的SEQ ID NO1或21表示的氨基酸序列相同或基本相同，然而，作为TGR-1的具体例子，还有(15)与SEQ ID NO17所示氨基酸序列相同或基本相同的蛋白质或其盐，或者，(16)在SEQ ID NO1、17或21表示的氨基酸序列中缺失1-30个氨基酸，优选缺失1-10个氨基酸，在SEQ ID NO1、17或21表示的氨基酸序列中附加(或插入)1-30个氨基酸，优选附加(或插入)1-10个氨基酸，或者在SEQ ID NO1、17或21表示的氨基酸序列中被其他氨基酸置换1-30个，优选置换1-10个氨基酸的蛋白质或其盐等具体例子。另外，更具体的以TGR-1作为例子包括在SEQ ID NO1中所示的氨基酸序列，从其N末端第4位(Met)到第415位(Thr)的氨基酸序列的蛋白质，还包括在SEQID NO17中所示的氨基酸序列从其N末端第4位(Met)到第415位(Thr)的氨基酸序列的蛋白质等。


图1表示在实施例2中通过位点传感器(Site sensor)对TGR-1受体特异地进行细胞刺激而检测其活性的结果。通过位点传感器分析(Site sensorassay)，图中表示的浓度为猪型神经介肽U-8作用于表达TGR-1受体(CHO)细胞(○)及mock CHO细胞(●)，时间为7分2秒钟，从而绘出该期间的最大酸化率。
图2表示在实施例1中得到的人型TGR-1和在实施例3中得到的大鼠型TGR-1之间的氨基酸序列的比较图。
具体实施方案下面，进一步详细说明本发明中所使用的TGR-1或其盐(下文，通常简称为TGR-1)以及神经介肽U或其衍生物或其盐(下文，通常简称为神经介肽U)的制造方法。
所述本发明中使用的TGR-1或神经介肽U均可来自于人或温血动物(例如，豚鼠、大鼠、小鼠、猪、绵羊、牛、猴子、狗、家鸡等)，两栖类(如青蛙等)以及鱼类等的所有组织(例如，垂体、胰腺、脑、肾脏、肝脏、生殖腺、甲状腺、胆囊、骨髓、副肾、皮肤、肌肉、肺、消化道、血管、心脏等)或细胞等的蛋白质(包括多肽)，其中TGR-1可以是任意一种蛋白质(包括多肽)，只要它含有与SEQ ID NO1或21所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列，而所述神经介肽U只要含有与SEQ ID NO11所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列均可。
例如，本发明的TGR-1除了上述所说的包含与SEQ ID NO1或21所示氨基酸序列的蛋白质外，还可以是与SEQ ID NO1或21所示的蛋白质具有基本相同的活性等。
所述活性基本相同是指，例如配体(神经介肽U)和受体(TGR-1)结合活性、生理特性等基本相同。氨基酸的置换、缺失、附加或插入虽然不会给多肽的生理特性或化学特性带来很大的改变，但是，在这种情况下进行其置换、缺失、附加或插入的蛋白(多肽)(神经介肽U变性体、TGR-1变性体)视为基本上与没有被置换、缺失、附加或插入的蛋白(多肽)相同。该氨基酸序列中的氨基酸基本为相同的置换物，例如，其氨基酸可以在所属分类特性的范围内选择其它的氨基酸例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸等。极性(中性)氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺等。带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸等。带负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸等。
因此，不管受体结合活性大小，蛋白质分子量等的量化要素均可不同。
更具体地说，所述与SEQ ID NO1或21所示氨基酸序列基本相同的氨基酸序列，可举例为，与SEQ ID NO1或21所示氨基酸序列的同源性为大于或等于90％，更优选大于或等于95％，进一步优选大于或等于98％的氨基酸序列。
尤其是，所述与SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同的氨基酸序列，例如，所谓其中部分氨基酸序列包含由Leu-Phe-Val，Trp-Ser-Glu，Val-Phe-Phe或Ser-Met-his所示的氨基酸序列，并且优选与SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同的氨基酸序列同源性为大于或等于90％，更优选大于或等于95％，进一步优选大于或等于98％的氨基酸序列。
作为本发明的蛋白质与SEQ ID NO1或21所示氨基酸序列基本相同的氨基酸序列，优选例如，包含与SEQ ID NO1或21所示氨基酸序列基本相同的氨基酸序列，且与SEQ ID NO1或21所示氨基酸序列的活性基本相同。
特别是，所述本发明的蛋白质与SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同，优选含有由Leu-Phe-Val、Trp-Ser-Glu、Val-Phe-Phe或Ser-Met-His所示的部分氨基酸序列，含有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同的氨基酸序列，含有与SEQ ID NO1所示氨基酸序列的活性基本相同。
所述活性基本相同，可举例为配体结合活性、信息传递作用等。所述基本相同是表示其活性性质相同。因此，优选配体结合活性和信息传递作用等活性相同(如，约0.01～100倍，优选约0.5～20倍，更优选约0.5～2倍)，这些活性的程度和蛋白质分子量等的量化要素可以不尽相同。
测定如配体结合活性和信息传递作用等的活性时，可用本领域公知的改良方法进行，例如可用随后描述的筛选方法等进行测定。
另外，所述与SEQ ID NO1或21所示的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列，可应用包含如下情形的蛋白质①在SEQ ID NO1或21所示氨基酸序列中缺失1个或不低于2个[优选1～30个左右，较优选1～10个左右，更优选数个(1～5个)]左右的氨基酸序列，②在SEQ ID NO1或21所示氨基酸序列中附加1个或不低于2个[优选1～30个左右，较优选1～10个左右，更优选数个(1～5个)]左右的氨基酸序列，③在SEQ ID NO1或21所示氨基酸序列中被其他氨基酸置换1个或置换不低于2个[优选1～30个左右，较优选1～10个左右，更优选数个(1～5个)]左右的氨基酸序列，或④这些氨基酸序列组合形成的序列。
特别是，所述SEQ ID NO1所示氨基酸序列基本相同的氨基酸序列，可优先选用①包含Leu-Phe-Val、Trp-Ser-Glu、Val-Phe-Phe或Ser-Met-His所示的部分氨基酸序列，并在SEQ ID NO1所示氨基酸序列中缺失1个或不低于2个[优选1～30个左右，较优选1～10个左右，更优选数个(1～5个)]左右的氨基酸序列，②包含Leu-Phe-Val、Trp-Ser-Glu、Val-Phe-Phe或Ser-Met-His所示的部分氨基酸序列，并在SEQ ID NO1所示氨基酸序列中附加1个或不低于2个[优选1～30个左右，较优选1～10个左右，更优选数个(1～5个)]左右的氨基酸序列，③包含Leu-Phe-Val、Trp-Ser-Glu、Val-Phe-Phe或Ser-Met-His所示的部分氨基酸序列，并在SEQ ID NO1所示氨基酸序列中被其他氨基酸置换1个或置换不低于2个[优选1～30个左右，较优选1～10个左右，更优选数个(1～5个)]左右的氨基酸序列，或④这些氨基酸序列组合形成的序列。
另外，TGR-1为蛋白质，其具体例子包括在SEQ ID NO1表示的氨基酸序列中从其N末端的第4位(Met)到第415位(Thr)的氨基酸序列，在SEQ ID NO17表示的氨基酸序列中从其N末端的第4位(Met)到第415位(Thr)的氨基酸序列等。
作为本发明的神经介肽U，除了包含SEQ ID NO11所示的氨基酸序列(多)肽等，还与SEQ ID NO11所示的氨基酸序列(多)肽的活性基本相同。作为活性基本相同，可举例为受体结合活性等。所说基本相同表示受体结合活性等性质相同。因此，受体结合活性的大小、(多)肽的分子量等的量化要素可以不尽相同。
本说明中的TGR-1或神经介肽U按照惯例肽的标记描述，左端为N末端(氨基端)，右端为C末端(羧基端)。例如包含SEQ ID NO1、21或11所示氨基酸序列的蛋白质或(多)肽其C末端通常为羧基(-COOH)或羧酸根(-COO-)，但是C末端也可为酰胺(-CONH2)或酯(-COOR)。所述酯中的R有，例如，C1-6烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、或正丁基；C3-8环烷基包括环戊基和环己基等；C6-12芳基包括苯基和a-萘基等；C7-14芳烷基如苯基-C1-2烷基或a-萘基C1-2烷基，其中苯基-C1-2烷基又如苯甲基、苯乙基、二苯甲基等；a-萘基C1-2烷基又如a-萘甲基等，此外还有通常适用于口服给药的酯如三甲基乙酰氧甲基。
在本发明中所使用的神经介肽U优选其C末端的羧基(-COOH)为酰胺(-CONH2)。
本发明中所使用的TGR-1或神经介肽U之盐可以与生理上可接受的碱(如碱金属)或酸(如无机酸或有机酸)形成盐，优选生理上可接受的酸加成盐。这类的盐有，与无机酸(例如，盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸)形成的盐，或与有机酸(例如，乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸)形成的盐等。
本发明中所使用的TGR-1或神经介肽U既可根据人或其它温血动物细胞或组织纯化多肽的公知方法(例如，FEBS Letters 398，253-258(1996)、WO96/18651号公报记载的方法)来制备，也可以用随后叙述的合成方法制备蛋白质(肽)。也可通过培养含有随后所述蛋白质(肽)之编码DNA的转化体来制备。
当从人、温血动物、两栖类、鱼类等组织或细胞中制备该蛋白质(肽)时，首先将人、温血动物、两栖类、鱼类等的组织或细胞匀浆，然后用酸、有机溶剂等抽提，通过盐析、透析、凝胶过滤、反向层析、离子交换层析、亲和层析法等多种层析技术的联用来分离纯化该抽提物。
如上所述，本发明中所使用的TGR-1或神经介肽U可按照公知的蛋白质(多肽)合成方法制备，或可用适当的肽酶切割含有TGR-1及/或神经介肽U的蛋白质(肽)来制备。其蛋白质(多肽)的合成法，例如，可以用固相合成法和液相合成法的任意一种。即，当能够构成TGR-1和/或神经介肽U的部分肽或氨基酸与其残余部分缩合，其产物有保护基时，通过除去保护基团可以制备目的蛋白质(多肽)。此时的公知缩合方法或除去保护基团方法例如在下列1)-5)中均有描述1)M.Bodanszky和M.A.Ondetti肽的合成，Interscience Publishers，纽约(1966)2)Schroeder和Luebke肽，Academic Press，纽约(1965)3)泉屋信夫等多肽合成的基础与实验，丸善公司(1975)4)矢岛治明和榊原俊平生物化学实验教材1，蛋白质化学IV，205(1977)5)矢岛治明主编药物开发续篇，卷14，肽合成，广川书店还有，反应后将一般的纯化方法如，溶剂抽提法、蒸馏法、柱层析法、液体层析法、重结晶法等进行组合来纯化回收本发明的蛋白质(多肽)。通过上述方法得到的蛋白质(多肽)若为游离体时，按照公知方法可以适当转换为盐，相反获得其盐时按照公知方法也可以转化为游离体。
为了合成本发明TGR-1或神经介肽U的酰胺物，可以使用可用于酰胺合成的市售的合成树脂。这类树脂的实例包括氯甲基树脂、羟甲基树脂、二苯甲胺树脂、氨甲基树脂、4-苄氧基苯甲醇树脂，4-甲基二苯甲胺树脂，PAM树脂，4-羟甲基甲苯乙酰胺甲基树脂，聚丙烯酰胺树脂，4-(2′，4′-二甲氧基苯羟甲基)苯氧基树脂以及4-(2′，4′二甲氧苯基-Fmoc-氨乙基)苯氧基树脂。使用这些树脂时，将那些α-氨基及侧链上官能基受到相应保护的氨基酸，在树脂上按目标多肽的序列顺序，用本领域公知的各种缩合方法缩合。反应结束时，将蛋白质(多肽)从树脂上切除下来，同时除去各种保护基团，必要时在高度稀释溶液中实施分子内二硫键形成反应，以获得目标蛋白质(多肽)。
进行上述受保护氨基酸的缩合反应时，可使用蛋白质(多肽)合成的多种活化试剂，但优选使用碳二亚胺。其碳二亚胺有DCC、N，N′-二异丙基碳二亚胺以及N-乙基-N′-(3-二甲基氨基脯氨酰基)碳二亚胺。用这些试剂活化时，直接在树脂上添加受保护的氨基酸及外消旋抑制剂(例如，HOBT，HOBBT等)，或先将受保护的氨基酸活化为对称酸酐、HOBT酯或HOOBt酯，然后添加到树脂上。适用于受保护氨基酸的活化反应或适用于与树脂的缩合反应的溶剂选自已知可用于蛋白质(多肽)缩合反应的溶剂。这样的溶剂有酰胺类如N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺以及N-甲基吡咯烷酮等；卤化烃类如二氯甲烷和氯仿等；醇类如三氟乙醇等；亚砜类如二甲亚砜等；叔胺类如吡啶等、醚类如二恶烷和四氢呋喃等；腈类如乙腈和丙腈等；酯类如乙酸甲酯和乙酸乙酯等；以及这些溶剂的适当混合物。反应温度从已知适用于肽成键反应的范围中选取，通常选约-20℃-50℃。活化的氨基酸衍生物通常以过量1.5～4倍的量使用。用茚三酮反应检验所述缩合反应程度；当所述缩合不充分时，可通过不除去保护基团而重复缩合反应来完成。当即使重复反应后仍未充分缩合时，用乙酸酐或乙酰咪唑将未反应的氨基酸乙酰化，以消除对后续反应的可能负影响。
用于该蛋白质(肽)合成时保护初始氨基酸的保护基团有，例如Z、Boc、叔戊氧基羰基、异冰片基氧羰基、4-甲氧苄氧羰基、Cl-Z、Br-Z、金刚烷(adamantyl)氧基羰基，三氟乙酰基、邻苯二甲酰基、甲酰基、2-硝基苯基亚硫酰基、二苯硫膦基，以及Fmoc。其羧基的保护基团有，例如所述R有，C1-6烷基、C3-8环烷基、C7-14芳烷基、2-金刚烷基、4-硝基苄基、4-甲氧苄基、4-氯苄基、苯甲酰甲基，苄氧羰基酰肼基、叔丁氧羰基酰肼基以及三苯甲基酰肼基等。
丝氨酸以及苏氨酸的羟基可以通过例如酯化作用或醚化作用来保护。适于酯化作用的基团有低级烷酰基如乙酰基，芳酰基如苯甲酰基，以及来自碳衍生的基团如苄氧羰基和乙氧羰基。适于醚化的基团有苯甲基、四氢吡喃基和叔丁基。
适于保护酪氨酸中酚羟基的基团有，例如Bzl、Cl2-Bzl、2-硝基苄基、Br-Z和叔丁基等。
适于保护组氨酸中咪唑基的基团有，Tos、4-甲氧-2，3，6-三甲基苯磺酰基、DNP、苄氧甲基、Bum、Boc、Trt和Fmoc。
活化原料羧基的有，如对应的酸酐、迭氮基、活化酯[与乙醇(五氯苯酚、2，4，5-三氯苯酚、2，4-二硝基苯酚、氰基甲醇、对硝基苯酚、HONB、N-羟甲基琥珀酰亚酰胺、N-羟甲基酞酰亚胺、HOBt)形成的酯]等。活化原料氨基的有与此对应的磷酸胺。
保护基的去除(脱离)方法有，在Pd-黑或Pd-碳等催化剂的存在下在氢气流中的催化还原反应；通过氢氟酸酐、甲磺酸、三氟甲磺酸、三氟乙酸或它们的混合液进行酸的处理；二异丙烯乙胺、三乙胺、哌啶、哌嗪等的碱处理；通过液氨中的钠还原反应等等。上述酸处理的脱离反应一般在约-20℃～40℃的温度下进行，在酸处理作用中，添加如甲氧基苯、苯酚、硫代甲氧基苯、间苯甲酚、对甲酚、二甲基硫化物、1，4-丁二硫醇、1，2-乙二硫醇等阳离子捕集剂是有效的。组氨酸咪唑保护基所用的2，4-二硝基苯基通过硫代苯酚除去，色氨酸吲哚保护基的甲酰基除了所述1，2-乙二硫醇、1，4-丁二硫醇等存在下经过酸处理而脱离保护之外，也可以通过碱处理如氢氧化钠稀溶液、稀释氨等除去方法。
从公知的基团中或从公知方法中适当选择与原料反应无关的官能团的保护及保护基以及其保护基的脱离，以及与反应有关的官能团的活化。
TGR-1和神经介肽U的酰胺物的其它获得方法有，如首先将羧基末端氨基酸的α-羧基酰胺化，再在氨基侧使肽链增加到所要求的长度，制造2种肽(或氨基酸)，一种为该肽链N末端只除去α-氨基保护基，另一种为C末端除去羧基保护基，使这两种肽在所述混合溶剂中缩合。有关缩合反应的详细情况与前述一样。由缩合得到的保护肽经过纯化之后，按照上述方法除去所有的保护基，可以得到粗蛋白(多肽)。这种粗蛋白(多肽)通过各种纯化的已知方法，进行冻结干燥主要的级分进而得到蛋白质(多肽)的酰胺物。
为获得TGR-1和神经介肽U的酯物，将如羧基末端氨基酸的α-羧基与要求的乙醇类缩合转换为氨基酸酯后，再与蛋白质(多肽)的酰胺物合成一样从而获得蛋白质(多肽)的酯物。
作为本发明所使用的神经介肽U的衍生物，可为任意的化合物，只要它们能与TGR-1结合的均可①神经介肽U的部分肽、②构成神经介肽U的氨基酸缺失的肽、由其它氨基酸附加到构成氨基酸的肽、构成的氨基酸被其它氨基酸置换的肽、或③神经介肽U以及①中所述的部分肽或②中所述的肽被标记的化合物。
具体地说，神经介肽U的部分肽有，包含SEQ ID NO16所示氨基酸序列或其酰胺或其酯或其盐等。优选具有SEQ ID NO16所示氨基酸序列肽，该序列肽的C末端羧基酰胺化形成酰胺物或其盐。
所述神经介肽U的部分肽，可根据在适当的肽链上切断神经介肽U制备或依据上述的蛋白质(多肽)合成法制备。神经介肽U的部分肽的酰胺或其酯也可按照上述酰胺物或其酯物的制备方法制备。进一步作为神经介肽U的部分肽的盐，可以上述TGR-1和神经介肽U盐同样的例子为例。
另外，所述的构成神经介肽U的氨基酸缺陷的肽、由其它氨基酸附加到构成氨基酸的肽、构成的氨基酸被其它氨基酸置换的肽为包含以下情形所示的氨基酸序列肽，在SEQ ID NO11所示的氨基酸序列中缺失1-3个氨基酸，优选缺失1-2个氨基酸，或者在SEQ ID NO11所示的氨基酸序列中附加(或插入)1-3个氨基酸，优选附加(或插入)1-2个氨基酸，或者在SEQID NO11所示的氨基酸序列中被其他氨基酸置换1-3个氨基酸，优选被其他氨基酸置换1-2个氨基酸。
另外，上面所述构成氨基酸缺失的肽、附加到构成氨基酸的肽或被其他氨基酸置换的肽，可举例为在SEQ ID NO5、6、7、8、9、10、12、13、14或15所示的氨基酸序列中缺失1-3个氨基酸，优选缺失1-2个氨基酸，在SEQ ID NO5、6、7、8、9、10、12、13、14、或15所示的氨基酸序列中附加(或插入)1-3个氨基酸，优选附加(或插入)1-2个氨基酸，或者在SEQ ID NO5、6、7、8、9、10、12、13、14或15所示的氨基酸序列中被其他氨基酸置换1-3个氨基酸，优选被其他氨基酸置换1-2个氨基酸。
该氨基酸序列中的氨基酸基本为相同的置换物，例如，其氨基酸可以在所属分类特性的范围内选择其它的氨基酸例如非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸等。极性(中性)氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺等。带正电荷(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、组氨酸等。带负电荷(酸性)氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸等。
上面所述神经介肽U以及①中所述的部分肽或②中所述的肽被标记的事项，按照本领域公知的方法有，同位素标记、荧光标记(例如，由荧光素标记的)、生物素标记、酶标记等。
具体地说，例如，通过公知方法可以利用神经介肽U等，该神经介肽U被[3H]、[125I]、[14C]、[35S]等标记的。
神经介肽U的衍生物的盐与所述TGR-1和神经介肽U的盐一样。
编码本发明TGR-1的DNA可以是下面情形的任何一种其DNA具有编码蛋白质的碱基序列，其蛋白质含有与SEQ ID NO1或21所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列；而编码本发明神经介肽U的DNA可以是下面情形的任何一种其DNA具有编码肽的碱基序列，其肽含有与SEQID NO11所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列。它们可以是基因组DNA、DNA基因文库、前述细胞·组织中的cDNA、前述细胞·组织中的cDNA文库、合成DNA。文库使用的载体包括噬菌体、质粒、粘粒、噬粒等。还有，从所述细胞·组织中制备的RNA组分，用该组分可以直接根据Reverse Transcriptase Polymerase chain Reaction(下文，简称RT-PCR法)进行扩增。
所述其DNA具有编码包含SEQ ID NO1所示氨基酸序列的TGR-1的DNA，可举例为包含SEQ ID NO2所示碱基序列的DNA，所述其DNA具有编码包含SEQ ID NO21所示氨基酸序列的TGR-1的DNA，可举例为包含SEQ ID NO22所示碱基序列的DNA，所述其DNA具有编码包含TGR-1的SEQ ID NO17所示氨基酸序列的DNA，可举例为包含SEQ ID NO18所示碱基序列的DNA。
进一步，所述其DNA具有编码TGR-1的碱基序列，该TGR-1包含SEQID NO1所示氨基酸序列的N末端第4位(Met)～第415位(Thr)的氨基酸序列，可以含有SEQ ID NO2所示碱基序列的5′末端第10位(A)～第1245位(C)的DNA为例。所述其DNA具有编码TGR-1的碱基序列，该TGR-1包含SEQ ID NO17所示氨基酸序列的N末端第4位(Met)～第415位(Thr)的氨基酸序列，可以含有SEQ ID NO18所示碱基序列的5′末端第10位(A)～第1245位(C)的DNA为例。
特别是，所述其DNA具有编码TGR-1的DNA碱基序列，该TGR-1包含SEQ ID NO1所示氨基酸序列，例如优先选用作为部分碱基序列含有-CTGTTTGTC-(在SEQ ID NO2中的第808位(C)～第816位(C)所示的部分碱基序列)、-TGCAGTGAA-(在SEQ ID NO2中的第888位(T)～第896位(A)所示的部分碱基序列)、-GTCTTCTTC-(在SEQ ID NO2中的第940位(G)～第948位(C)所示的部分碱基序列)或-TCCATGCAC-(在SEQ ID NO2中的第1159位(T)～第1167位(C)所示的部分碱基序列)所示的碱基序列，优选使用含有SEQ ID NO2所示碱基序列的DNA等。
更具体地说，可以使用2种DNA，一种DNA是(1)在严谨条件下，与这样一种DNA序列杂交的DNA，即这样一种DNA序列是它具有编码蛋白质或(多)肽的碱基序列，其蛋白质或(多)肽含有与SEQ ID NO1、21或11所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列；另一种DNA是(2)为了简并遗传密码，编码含有同一氨基酸序列的蛋白质或(多)肽，其蛋白质或(多)肽含有与SEQ ID NO1、21或11所示氨基酸序列相同或基本相同的氨基酸序列，但它不与(1)所具有的序列及由(1)所决定的序列形成杂合体。杂交可以用公知方法或其改良方法实施。其中所述严谨条件是指，例如42℃、50％甲酰胺4×SSPE(1×SSPE＝150mM NaCl，10mM NaH2PO4·H2O，1mM EDTA pH7.4)、5×Denhart′s溶液、0.1％SDS。
编码本发明的TGR-1或神经介肽U的DNA可以通过下面基因工程的方法生产。
作为DNA的克隆方法(克隆化)，该DNA完全编码本发明的TGR-1或神经介肽U，按照下列方法进行。即，首先合成含有本发明的多肽的部分碱基序列的DNA，用该DNA作为引物，再根据公知的PCR法从所述DNA文库等扩增目的DNA，或者通过与标记物杂交筛选，此标记物是用，例如编码具有TGR-1或神经介肽U的部分或全部的DNA片段或合成DNA，将其DNA片段插入到合适载体中的DNA文库。杂交反应可以根据分子克隆第二版(J.Sambrook等，冷泉港实验室出版社，1989)描述的方法进行。也可用商品化的文库根据所附说明书进行杂交。
DNA的碱基序列的转换，可采用公知的试剂盒，例如应用MutanTM-superExpress Km(宝酒造)，MutanTM-K(宝酒造)等，按照ODA-LA PCR、Gapped duplex和Kunkel等公知的方法或改良的方法进行。
已经克隆的编码该TGR-1或神经介肽U的DNA，既可单独使用，也可根据目的需要，在用限制酶消化后或连接一接头之后使用。该DNA可能在5′端包含ATG作为翻译起始密码子，而在3′端有TAA、TGA或TAG作为翻译终止密码子。这些翻译起始和终止密码子也可加上合适的合成DNA接头。
本发明中所使用的TGR-1或神经介肽U的DNA的表达载体可通过以下方法生产，例如，(a)从编码本发明的TGR-1或神经介肽U的DNA上切下所需DNA片段，(b)将该DNA片段连接到一合适表达载体上的启动子下游。
可以使用的载体包括来自大肠杆菌的质粒(例如，pBR322、pBR325、pUC12、pUC13)、来自枯草杆菌的质粒(例如，pUB110、pTP5、pC194)、来自酵母的质粒(例如，pSH19、pSH15)、噬菌体如λ噬菌体等、动物病毒如反转录病毒、痘苗病毒、杆状病毒等。本发明所使用的启动子可以是任意启动子，只要它能与所用基因表达宿主匹配。
如果转化的宿主为动物细胞时，分别优选SV40启动子、反转录病毒启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子、巨细胞病毒启动子、SRα启动子。当宿主为大肠杆菌属的细菌时，优选的启动子有Trp启动子、T7启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子、lpp启动子等。在使用枯草杆菌属的细菌作宿主时，优选的启动子有SPO1启动子、SPO2启动子和penP启动子等。在用酵母作宿主时，优选的启动子有PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子和ADH1启动子、GAL启动子等。在使用昆虫细胞作宿主时，优选多角体蛋白启动子、P10启动子。
表达载体除了上述之外根据需要还可以使用含有增强子、剪接信号、PolyA附加信号、选择标记物、SV40复制起点(以下简称为SV40ori)等的载体。其中选择标记物有二氢叶酸还原酶(以下简称为dhfr)基因[抗氨甲蝶呤(MTX)]、抗氨苄青霉素基因(以下简称为Ampr)、抗新酶素基因(以下简称为Neo、抗G418)等。尤其是用CHO(dhfr-)细胞将DHFR基因作为选择标记物时也可以用不合腺嘌呤脱氧核苷来选择目的基因。
又，根据需要在本发明多肽或其部分肽的N-末端加上适合于宿主的信号序列。当宿主为大肠杆菌属细菌时，可以使用phoA信号序列、OmpA信号序列等；当宿主为杆菌属细菌时可以使用α-淀粉酶信号序列、枯草菌素信号序列等；当宿主为酵母菌时可以使用MFα信号序列、SUC2信号序列等；当宿主为动物细胞时可以使用胰岛素信号序列、α-IL信号序列、抗体分子信号序列等。
使用如此构建的、含有编码本发明TGR-1或神经介肽U的DNA载体可以制造转化体。
其宿主有，如大肠杆菌属细菌、杆菌属细菌、酵母菌、昆虫细胞、昆虫、动物细胞等。
具体地说，其大肠杆菌属的例子有大肠杆菌(Escherichia cili)K12DH1[(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，60卷，160(1968)]、JM103[(Nucleic AcidsResearch)，9卷，309(1981)]、JA221[(Journal of Molecular Biology)，120卷，517(1969)]、HB101[Journal of Molecular Biology)，41卷，459(1969)]、C600[(Genetics)，39卷，440(1954)]等。
其杆菌属有枯草杆菌(Bacillus subtilis)MI114[Gene.24卷，255(1983)]、207-21[(Journal of Biochemistry)，95卷，87(1984)]等。
其酵母菌有，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AH22、AH22R-、NA87-11A、DKD-5D、20B-12等。
昆虫使用的是家蚕的幼虫等[前田等.Nature.315卷，592(1985)]。
其昆虫细胞有，例如病毒为AcNPV时从草地夜蛾幼虫(Spodopterafrugiperda cell，Sf)来的细胞系、从粉纹夜蛾中肠(Trichoplusia ni)来的细胞系MG1细胞、从粉纹夜蛾卵(Trichoplusia ni)来的High Five TM细胞、从Mamestrabrassicae来的细胞或从Estigmena acrea来的细胞等。病毒为BmNPV时有来自于蚕细胞系(Bombyx mori N，BmN细胞)等。该Sf细胞，还有如Sf9细胞(ATCC CRL1711)、Sf21细胞(Vaughu，J.L.等In Vivo.13，213-217(1977))等。
动物细胞有，例如猴子细胞COS-7，Vero、中国仓鼠细胞CHO(以下简称为CHO细胞)、DHFT基因缺陷中国仓鼠细胞CHO(以下简称为CHO(dhfr-)细胞)、小鼠L细胞、小鼠3T3、小鼠骨髓瘤细胞、人HEK293细胞、人FL细胞、293细胞、C127细胞、BALB373细胞、Sp-2/O细胞等。
为了转化大肠杆菌属细菌按照[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69卷2110(1972)]和[Gene，17卷，107(1982)]描述的方法进行转换。
为了转化杆菌属细菌按照[Molecular and General Genetics，168卷，111(1979)]描述的方法进行转换。
为了转化酵母菌按照[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75卷1929(1978)]描述的方法进行转换。
为了转化昆虫细胞或昆虫按照[Bio/Technology.6，47-55(1988)]描述的方法进行转换。
为了转化动物细胞按照[《病毒学》.52卷，456(1973)]描述的方法进行转换。
向表达载体的细胞导入法有，例如脂转染法[Felgner，P.L.et al.Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States ofAmeriica，84，7413(1987)]、磷酸钙转染[Graham，F.L.and van der Eb，A.J.Virology，52，456-467(1973)]、电穿孔法[Nuemann，E.等EMBO J.，1卷，841-845(1982)]等。
由此，可以获得用含有本发明TGR-1或神经介肽U之编码DNA的表达载体转化的转化体。
为使本发明TGR-1或神经介肽U能稳定地进行基因表达采取利用动物细胞进行选择的方法，该方法是通过克隆选择筛选细胞的，即将已导入到上面所述动物细胞的表达载体整合到染色体上。具体地说，就是把上述所说的选择标记物作为指标来选择转化体。如此地用选择标记物获得的动物细胞，通过重复克隆选择能获得稳定的细胞系，这种细胞系具有高效表达本发明TGR-1或神经介肽U的能力。当用dhfr基因作为选择标记物时，培养时的MTX浓度为逐渐上升，通过选择抗耐性的细胞系，在细胞内同时与dhfr基因一起使编码本发明TGR-1或神经介肽U的DNA扩增，也可获得更高效表达的动物细胞系。
在可以进行基因表达的条件下，培养由编码本发明的TGR-1或神经介肽U的DNA进行转化的所述转化体，通过生成、积累本发明的TGR-1或神经介肽U，可以生成本发明的TGR-1或神经介肽U。
培养宿主为大肠杆菌属细菌、杆菌属细菌的转化体时，其培养基适用于液体培养基，该转化体的发育含有必要的碳源、氮源、无机物以及其它物质。碳源有葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、蔗糖等；氮源有铵盐、硝酸盐、玉米糊、蛋白胨、酪蛋白、肉汁、黄豆饼粉、马铃薯提取液等无机或有机物质；无机物有氯化钙、磷酸二氢钠、氯化镁等。也可以添加酵母提取物、维生素、生长因子等。培养基的pH优选约为5-8。
大肠杆菌属细菌的培养基，优选含有葡萄糖、酪蛋白氨基酸的M9培养基[米勒，Journal of Experiments in Molecular Genetics，431-433，Cold SpringHarbor Laboratory，New Youk 1972]。根据需要，为使启动子更能发挥有效作用还可以添加如，3β-吲哚丙烯酸之类的药物。
当宿主为大肠杆菌属细菌时，转化体通常在15-43℃培养，时间约3-24小时，必要时可以通气或搅拌。
当宿主为杆菌属细菌时，转化体通常在30-40℃培养，时间约6-24小时，必要时可以通气或搅拌。
当培养宿主为酵母的转化体时，其培养基有Burkholder基本培养基[Bostian，K.L.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77卷，4505(1980)]或含有0.5％酪蛋白氨基酸的SD培养基[Bitter，G.A.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81卷，5330(1984)]。培养基的pH优选为约5-8。转化体通常在20-35℃培养，时间约24-72小时，必要时可以通气或搅拌。
当培养宿主为昆虫细胞的转化体时，其培养基可以选用在Grace′s Insecl培养基[Gracc，T.C.C.Nature.195，788(1962)]中适当添加固相化10％牛血清等添加物。培养基的pH优选为约6.2-6.4。转化体通常在27℃培养，时间约3-5天，必要时可以通气或搅拌。
当培养宿主为动物细胞的转化体时，其培养基包括含有约5-20％的胎牛血清的MEM培养基[Science，122卷.501(1952)]、DMEM培养基(Virology，8卷，396(1959)、RPMI1640培养基[The Journal of the American MedicalAssociation.199卷，519(1967)]、199培养基[Proceeding ofthe Society for theBiological Medicine，73卷，1(1950)]等。培养基的pH优选为约6-8。转化体通常在30-40℃培养，时间约15-60小时，必要时可以通气或搅拌。
尤其是，用CHO(dhfr-)细胞及dhfr基因作标记物时，优选使用DMEM培养基，它含有经过透析的但几乎不含胸腺嘧啶的牛胎血清。
为了从上述培养物中分离纯化本发明TGR-1或神经介肽U可以采用以下方法实施。
当从培养菌体或细胞中提取本发明的TGR-1或神经介肽U时，最适宜的方法是，培养后通过公知方法收集菌体或细胞，将其悬浮于适当的缓冲液中，通过超声、溶菌酶和/或反复冻融法等破碎菌体或细胞，再经过离心沉淀和过滤得到本发明的TGR-1或神经介肽U的粗提取液。缓冲液中也可以加入蛋白变性剂如尿素或盐酸胍等，表面活性剂如Triton X-100等(注册商标。下文通常简称为TM)。
当本发明的TGR-1或神经介肽U被分泌在培养液中时，结束培养后，按照本领域公知方法离心将菌体或细胞，使它们与上清液分开，收集上清液。
上清或包含在所获抽提物中的本发明的TGR-1或神经介肽U可通过将已知的分离和纯化方法适当组合来进行纯化。这些众所周知的分离纯化方法包括利用溶解性的方法如盐析、溶剂沉淀等；主要利用分子量差异的方法如透析、超滤、凝胶过滤、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳等；利用电荷差异的方法如离子交换层析等；利用特异性亲和力的方法如亲和层析等；利用疏水性差异的方法例如反相高效液相层析等；利用等电点差异的方法如等电聚焦电泳或层析聚焦等。
当如此获得的本发明的TGR-1或神经介肽U为游离形式时，可用众所周知的方法或其改良法将其转换为盐。相反，当获得的本发明的TGR-1或神经介肽U为盐时，可用众所周知的方法或改良法将其转换为游离形式或另一种盐形式。
重组产生的本发明的TGR-1或神经介肽U，在纯化前或纯化后，可用相应蛋白修饰酶处理，从而使本发明的TGR-1或神经介肽U经适当修饰，部分去除一段蛋白质(多肽)。这种蛋白修饰酶的例子包括胰酶、胰凝乳蛋白酶、精氨酰内肽酶、蛋白激酶、糖苷酶等。另外，为了切下N末端的氨基酸，可以使用公知的埃德曼降解法，该方法根据埃德曼(Edman)试剂(苯异硫氰酸)把末端氨基酸切下来。
如此产生的本发明的TGR-1或神经介肽U可以通过酶免疫测定法进行检测，该测定使用了特异性抗体。
下面，针对筛选化合物或其盐的方法和用于筛选化合物或其盐的试剂盒(下文，简化为本发明筛选方法、本发明筛选试剂盒)进行详细阐述，所述化合物能使神经介肽U和TGR-1之间的结合特性发生变化，该筛选方法的特征为，其应用神经介肽U以及TGR-1；该试剂盒的特征为，其中包括神经介肽U以及TGR-1。
通过使用与神经介肽U之间的结合测定系(配体-受体测定系)，所述结合测定系或者使用TGR-1，或者构建重组型TGR-1的表达系，并使用该表达系，可筛选所述神经介肽U和TGR-1之间的结合特性发生变化的化合物(如，肽、蛋白质、非肽性化合物、合成化合物、发酵产物等)或其盐。
这种化合物包括，具有TGR-1介导的细胞刺激活性(例如，促进花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白磷酸化、c-fos的激活和pH的变化等的活性等)的化合物(即TGR-1激动剂)，和不具有该细胞刺激活性的化合物(即TGR-1拮抗剂)。
所谓[能使神经介肽U和TGR-1之间的结合特性发生变化]包含两种情况，一种情况是抑制神经介肽U和TGR-1之间的结合，另一种情况是促进(延长结合时间)神经介肽U和TGR-1之间的结合。
即，本发明涉及一种筛选方法，该方法是筛选使本发明神经介肽U和TGR-1之间的结合特性发生变化的化合物或其盐，其特征为，(i)使TGR-1同本发明神经介肽U接触时，和(ii)使所述的本发明TGR-1同本发明神经介肽U及待测化合物接触时对这两者进行比较。
在(i)使TGR-1同本发明神经介肽U接触时和(ii)使TGR-1同本发明神经介肽U及待测化合物接触时的情况下，本发明筛选方法有以下特征，例如，测定并比较其结合于该TGR-1配体的结合量、细胞刺激活性(如促进花生四稀酸的游离、乙酰胆碱的游离、细胞内钙的游离、细胞内cAMP的生成、细胞内cGMP的生成、肌醇酸的生成、细胞膜电位的变化、细胞内蛋白质的磷酸化、c-fos的激活、pH的变化等活性)等。
更具体地，本发明的筛选方法(1)一种筛选化合物或其盐的方法，该化合物或其盐能使本发明神经介肽U和TGR-1之间的结合特性发生变化，其特征为，使一标记的用所述神经介肽衍生物表示的神经介肽U(以下单纯地称为「被标记的神经介肽U」)与前述TGR-1接触时，和使一标记的本发明神经介肽U及待测化合物与TGR-1接触时，测定并比较针对该TGR-1的标记的神经介肽U的结合量；(2)一种筛选化合物或其盐的方法，该化合物或其盐能使本发明神经介肽U和TGR-1之间的结合特性发生变化，其特征为，使一标记的本发明神经介肽U同含有TGR-1的细胞或该细胞的膜级分接触时，和使一标记的本发明神经介肽U及待测化合物同含有TGR-1的细胞或该细胞的膜级分接触时，测定并比较针对该细胞或该细胞膜级分结合的同一标记本发明神经介肽U的结合量；(3)一种筛选化合物或其盐的方法，该化合物或其盐能使本发明神经介肽U和TGR-1之间的结合特性发生变化，其特征为，使一标记的本发明神经介肽U，与通过培养含有编码TGR-1的DNA的转化体而表达在细胞膜上的TGR-1接触时，和使一标记的本发明神经介肽U及待测化合物与通过培养含有编码TGR-1的DNA的转化体而表达在细胞膜上的TGR-1接触时，测定并比较针对该TGR-1结合的标记本发明神经介肽U结合的量；(4)一种筛选化合物或其盐的方法，该化合物或其盐能使本发明神经介肽U和TGR-1之间的结合特性发生变化，其特征为，使能活化TGR-1的化合物(例如，神经介肽U)同含有TGR-1的细胞接触时，和能使活化TGR-1的化合物及待测化合物与含有TGR-1的细胞接触时，测定并比较TGR-1介导的细胞刺激活性(例如，促进花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白磷酸化、c-fos的激活和pH的变化等的活性)；以及(5)一种筛选化合物或其盐的方法，该化合物或其盐能使本发明神经介肽U和TGR-1之间的结合特性发生变化，其特征为，使能活化TGR-1的化合物(例如，神经介肽U)同通过培养含有编码TGR-1的DNA的转化体而表达在细胞膜上的TGR-1接触时，和能使活化TGR-1的化合物及待测化合物同通过培养含有编码TGR-1的DNA的转化体而表达在细胞膜上的TGR-1接触时，测定并比较TGR-1介导的细胞刺激活性(例如，促进花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白磷酸化、c-fos的激活和pH的变化等的活性)。
由于已知孤儿受体蛋白的FM-3(Tan，C.P.等Genomics 52，223-229，1998)具有配体活性(WO 00/02919)，所以本发明所使用的神经介肽U，通过有关上述①～⑤的活性可用FM-3替代TGR-1进行测定，可以筛选改变神经介肽U和TGR-1之间的结合特性的化合物或其盐(FM-3拮抗剂，FM-3激动剂)。
因此，根据本发明记载的筛选方法所得的TGR-1拮抗剂，TGR-1激动剂的活性，可用FM-3替代TGR-1，依据比较本发明所述筛选方法或改良的方法所得的FM-3拮抗剂，FM-3激动剂，可以选择性的得到含有拮抗剂或激动剂活性的FM-3，或可选择性的得到含有拮抗剂或激动剂活性的TGR-1。
在这里，所述「具有依据FM-3选择作用的拮抗剂」是指如下的化合物或盐，其针对FM-3活性(受体(TGR-1、FM-3)介导的细胞刺激活性(例如，促进花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白磷酸化、c-fos的激活和pH的变化等的活性)等)，大于或等于TGR-1活性的2倍，优选大于或等于10倍较弱的程度。
所述「具有依据FM-3选择作用的激动剂」是指如下的化合物或其盐，其针对FM-3活性(受体(TGR-1、FM-3)介导的细胞刺激活性(例如，促进花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白磷酸化、c-fos的激活和pH的变化等的活性)等)，大于或等于TGR-1活性的2倍，优选大于或等于10倍较强的程度。
所述「具有依据TGR-1选择作用的拮抗剂」是指如下的化合物或其盐，其针对TGR-1活性(受体(TGR-1、FM-3)介导的细胞刺激活性(例如，促进花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白磷酸化、c-fos的激活和pH的变化等的活性)等)，大于或等于FM-3活性的2倍，优选大于或等于10倍较弱的程度。
所述「具有依据TGR-1选择作用的激动剂」是指如下的化合物或其盐，其针对TGR-1活性(受体(TGR-1、FM-3)介导的细胞刺激活性(例如，促进花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白磷酸化、c-fos的激活和pH的变化等的活性)等)，大于或等于FM-3活性的2倍，优选大于或等于10倍较强的程度。
下面进一步说明所述筛选方法。
首先，作为用于本发明筛选方法的TGR-1，只要其含有所述TGR-1的均可，但是优选含有TGR-1等的人、温血动物、两栖类及鱼类脏器的细胞膜级分。然而人的脏器最难获得，因此用于本发明筛选方法的TGR-1等，通过重组体才适用于能大量表达人的TGR-1等。
在生产本发明TGR-1时，可使用上述表达方法。
在本发明筛选方法中，当使用含有TGR-1的细胞或该细胞膜级分时，可以按照随后所述方法。
在使用含有TGR-1的细胞时，该细胞可用戊二醛、福尔马林等固定。固定方法可以按照本领域公知的方法实施。
所述含有TGR-1的细胞是指，已表达TGR-1的宿主细胞，而该宿主细胞，包括所述的大肠杆菌、枯草杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等。
所述细胞膜级分是指，破碎细胞后，用本领域众所周知的方法获得的含有大量细胞膜的级分。其中细胞破碎法包括，用Potter-Elvehjem匀浆器挤压、用Waring blender或Polytron(Kinematica)破裂、超声破裂、用French press加压使细胞通过细嘴喷射而破裂。细胞膜组分分离主要通过离心力来实现，如分级离心和密度梯度离心。例如，细胞破碎液在低速(500-3000rpm)离心一小段时间(正常为1-10分钟)，得到的上清高速(15000-30000rpm)通常离心0.5-2小时。由此获得的沉淀部分用作细胞膜级分。细胞膜级分富含表达的TGR-1以及膜成分如细胞来源的磷脂和膜蛋白。
在含有该TGR-1等的细胞和细胞膜级分中，TGR-1含量优选103-108分子/细胞，更优选105-107分子/细胞。随着表达量的增加，单位细胞膜级分的配体结合活性(比活)增加，因而不但可以构建高敏感筛选体系，而且可以在同一批测得大量的样品。
为了筛选使本发明神经介肽U和TGR-1之间的结合特性发生变化的化合物而进行所述的(1)-(3)，需要合适的TGR-1级分和标记的本发明配体或有配体活性的化合物(神经介肽U及其衍生物等)。所述TGR-1级分优选天然的TGR-1级分，或与其具有同等活性的重组型TGR-1级分。此处术语“同等活性”是指在配体结合活性等同天然TGR-1所拥有的活性等同。作为标记的配体或有配体活性的化合物，有标记的配体或有配体活性的化合物(神经介肽U及其衍生物等)等。例如它们用[3H]、[125I]、[14C]或[35S]等标记。尤其是可利用标记的配体等(神经介肽U衍生物表达的神经介肽U的标记物)。
具体地说，为了筛选使本发明神经介肽U和TGR-1的结合特性发生变化的化合物，首先，将含有TGR-1的细胞或其膜级分悬浮于本方法的相应的缓冲液中，制备受体标样。可以使用任何缓冲液，只要它不干扰配体-受体结合。此类缓冲液有pH值约4-10(优选6-8)的磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液。为了降低非特异结合，可任选在缓冲液中加入表面活性剂如CHAPS、Tween-80TM(Kao-Atlas)、毛地黄皂甘或脱氧胆酸。为了抑制蛋白酶对TGR-1或神经介肽U的降解，可加入蛋白酶抑制剂如PMSF、亮抑蛋白酶肽、E-64(Peptide Institute)和胃蛋白酶抑制剂。将一定量(5000-500000cpm)的标记的用神经介肽U衍生物表示的神经介肽U的标记物加入到0.01-10ml的受体溶液中，同时还存在有10-4M-10-1μM的待测化合物。为了测定非特异性结合(NSB)，需提供一个含有过量未标记的神经介肽U反应管。在约0-50℃(优选约4-37℃)反应20分钟-24小时(优选30分钟-3小时)。在反应完成后，反应混合物用玻璃纤维滤纸等过滤，用适量的相同缓冲液洗涤。然后用液体闪烁计数仪或λ-计数仪测定在玻璃纤维滤纸中的残留放射活性。在不存在拮抗物时，从其值(B0)中减去非特异结合值(NSB)而得到的(B0-NSB)，作100％时，特异的结合量(B-NSB)，可以选择如低于80％的待测化合物作为具有能使TGR-1和神经介肽U之间的结合性发生变化的增补物质。
测定本发明神经介肽U和TGR-1的结合方法可以使用BIAcore(Amerham Pharmacia Biotech)。在这个方法中，按照仪器所附说明书中的氨基结合法将神经介肽U固定于传感器芯片上，在其传感器芯片上以2-20μl/分的流速使磷酸或Tris等的缓冲液通过，磷酸缓冲液包含从含有TGR-1细胞或含有编码TGR-1的DNA的转化体纯化而来的TGR-1或含有的TGR-1膜级分，或者包含从含有TGR-1细胞或含有编码TGR-1的DNA的转化体纯化而来的TGR-1或含有的TGR-1膜级分以及待测化合物。由于在传感器上神经介肽U与TGR-1结合而使胞质团表面发生共鸣，同时存在的待测化合物也随之变化通过观察这种变化可以筛选使TGR-1和神经介肽U之间的结合改变的化合物。该方法也可同样地进行下述的测定将TGR-1固定于传感器芯片上，在其传感器上使含有神经介肽U及待测化合物的磷酸缓冲液或Tris缓冲液通过的方法。待测化合物与上面所述一样。
用于筛选使本发明神经介肽U和TGR-1结合特性改变的化合物用所述(4)-(5)的方法进行。可按照众所周知的方法或商品化的分析试剂盒来测定TGR-1介导的细胞刺激活性(例如，促进或抑制花生四烯酸释放、乙酰胆碱释放、细胞内钙离子释放、细胞内cAMP产生、细胞内cGMP产生、磷酸肌醇的产生、细胞膜电位变化、细胞内蛋白的磷酸化、c-fos的激活和pH的降低的活性)。具体地说，首先，将包含TGR-1的细胞在多孔平板上培养。在筛选之前，先置换新鲜培养基或对细胞无毒的缓冲液，加入待测化合物并保温一定时间，然后提取细胞或回收上清将反应产物用各种方法进行定量。当利用细胞内的分解代谢酶测定作为细胞刺激活性指示剂的物质(例如花生四烯酸)的产生有困难时，可加入该分解代谢酶的抑制剂进行测定。可以检测cAMP产生的抑制活性等活性，作为细胞抑制活性，所述细胞受毛喉素等刺激而导致基本生产量增加。
测定细胞刺激活性而进行筛选时，需要合适的能表达TGR-1的细胞。其细胞优选具有所述重组型TGR-1表达细胞系，TGR-1表达转化体可以是稳定表达系或暂时性表达系。动物细胞可以使用上面所述的种类。
其中待测化合物包括，例如肽、蛋白质、非肽性化合物、合成化合物、发酵产物、细胞提取液、植物提取液、动物组织提取液等。
关于所述配体-受体检测系统，具体地使用下述的检测系统。
(1)受体表达细胞若被受体激动剂刺激的话，细胞内的G蛋白被活化便与GTP结合。这种现象在受体表达细胞的膜级分中也能观察到。通常地，GTP水解生成GDP，而在反应液中事先添加GTPγS，则GTPγS与GTP同样结合到G蛋白上，但不被水解而是保持与含有G蛋白的细胞膜结合的状态。若用标记的GTPγS通过检测残存在细胞膜上的放射性活性可以测定受体激动剂对受体表达细胞刺激的活性。利用该反应，可以测定神经介肽U对TGR-1表达细胞的刺激活性。该方法并不是如所述的(4)-(5)使用含有TGR-1细胞，而是像所述(1)-(3)一样是使用含有TGR-1膜级分的检测法，但是该方法是如所述(4)-(5)测定细胞刺激活性的，在本测定法中，显示对TGR-1膜级分促进GTPγS结合活性的物质是激动剂。在此，添加神经介肽U，或者添加神经介肽U以及待测化合物，与单独添加神经介肽U进行比较，通过观察GTPγS与TGR-1细胞膜级分产生促进结合活性的变化可以筛选使神经介肽U与TGR-1之间的结合改变的化合物。此时可以选择能显示神经介肽U对TGR-1细胞膜级分促进GTPγS结合活性的化合物作为具有能使TGR-1与神经介肽U之间的结合改变的增补物质。另一方面，只投与待测化合物，也可通过观察GTPγS与TGR-1细胞膜级分产生促进结合活性的变化可以筛选激动剂。
下面更具体地叙述有关筛选法的例子。根据上述的方法制备的含有TGR-1的细胞膜级分，用稀释膜的缓冲液(50mM Tris，5mM MgCl2，150mMNaCl，1μM GDP，0.1％BSApH7.4)稀释该膜级分。稀释度因受体表达的量而不同。将稀释的膜级分各自装入0.2ml的Falconb 2053中，加神经介肽U或者同时加神经介肽U及待测化合物，再加[35S]GTPγS使终浓度为200PM。25℃保温1小时后，再加冰冷却的洗涤缓冲液(50mM Tris，5mM MgCl2，150mM NaCl，0.1％BSA，0.05％CHAPS pH7.4 1.5ml)，用玻璃纤维滤纸GF/F过滤。65℃保温30分钟，干燥后用液体闪烁计数仪测定残留在滤纸上的膜级分中[35S]GTPγS放射活性。将只加有神经介肽U实验组的放射活性作为100％，没有加神经介肽U实验组的放射活性作为0％，求出神经介肽U对GTPγS与待测化合物结合促进活性的影响。例如，GTPγS结合促进活性低于80％时，可选择待测化合物作为具有改变TGR-1和神经介肽U结合性的增补物质。
(2)TGR-1表达细胞由于神经介肽U刺激而使细胞内cAMP的量减少。利用该反应可以测定神经介肽U对TGR-1表达细胞的刺激活性。
只要能够使TGR-1表达的动物细胞，例如对小鼠、大鼠、兔、山羊、牛等进行免疫而获得抗cAMP抗体和125I标记cAMP(均为厂家商品)，其细胞中cAMP的产量可以通过这种厂家产品进行测定，当然这种测定也适用于RIA或抗cAMP抗体与标记cAMP组合的EIA。另外，使用针对蛋白A或针对用于产生抗cAMP抗体的动物IgG等的抗体，根据SPA法对抗cAMP抗体进行定量，即SPA法使用含有固相闪烁体珠子和125I标记cAMP(使用由Amerham Pharmacia Biotech生产的试剂盒)。
在这个检测体系中，由配体来提高细胞内cAMP水平，该配体应为如毛喉素或降钙素等，它是一种能使细胞内cAMP水平提高的配体，通过添加神经介肽U，或者同时添加神经介肽U及待测化合物可以观察到细胞内cAMP水平的变化，这种变化是由于仅仅投药神经介肽U而产生的抑制细胞内cAMP的水平，进而可以筛选能使神经介肽U与TGR-1之间的结合发生变化的化合物。同时，可以选择一种化合物作为能使神经介肽U与TGR-1之间的结合发生变化的增补物质。这种化合物通过神经介肽U的刺激显示了对TGR-1表达细胞产生cAMP抑制活性。另外，通过只添加待测化合物来研究cAMP产生抑制活性，由此可以筛选具有激动剂活性的化合物。
下文较详细地阐述筛选方法。以每孔细胞密度为5×104个，将CHO已表达的TGR-1受体的细胞播种于24孔平板上，培养48小时。用含有0.2mM的3-异丁基甲基黄嘌呤和0.05％的BSA和20mM的HEPES Hank′s缓冲液(pH7.4)洗涤(下文，将含有0.2mM的3-异丁基甲基黄嘌呤和0.05％的BSA和20mM的HEPES Hank′s缓冲液(pH7.4)称作反应缓冲液)细胞。然后加0.5ml的反应缓冲液于培养箱保温30分钟。除去反应缓冲液，加入新的反应缓冲液0.25ml之后，再给细胞添加0.25ml的2μM毛喉素反应缓冲液，该缓冲液已加有1nM的神经介肽U或者1nM的神经介肽U以及待测化合物，37℃下反应24分钟。再加100μl的20％高氯酸停止反应，接着于冰块上放置1小时，进而提取细胞内cAMP。用cAMP EIA试剂盒(Amerham PharmaciaBiotech)测定提取液中的cAMP的量。用毛喉素刺激产生cAMP的量看作100％，而用1nM的神经介肽U产生抑制cAMP的量看作0％，求出待测化合物对由神经介肽U的刺激而产生cAMP抑制活性的影响。待测化合物抑制神经介肽U的活性使cAMP产生活性例如不高于80％可以选择特测化合物作为具有能改变TGR-1和神经介肽U之间结合的增补物质。
为了测定促进cAMP产生活性，使用上述方法定量在不添加毛喉素而添加待测化合物于已经表达的TGR-1的CHO细胞所产生的cAMP。这种场合，可选择cAMP产生活性的并能使TGR-1和神经介肽U的结合性变化的候补物质，例如不低于10％的待测化合物。
(3)将含有CRE(cAMP response element)的DNA，导入Picagene Basic载体或Picagene增强子载体(东洋Ink制造株式会社)的荧光素酶基因上游的多克隆位点上，以此作为CRE-报道基因载体。在转染的CRE-报道基因载体细胞中，随着cAMP的水平提高，进而刺激诱导CRE介导的荧光素酶基因表达和表达后的荧光素酶蛋白质的产生。也就是说，通过测定荧光素酶的活性可以检测细胞内导入CRE-报道基因载体而引起cAMP量的变化。将CRE-报道基因载体转染到TGR-1表达细胞利用这种细胞可以筛选能使神经介肽U与TGR-1的结合发生改变的化合物。具体筛选方法如下。
以每孔为5×103个细胞密度将转染CRE-报道基因的TGR-1表达细胞播种于24孔平板上，培养48小时。用含有0.2mM的3-异丁基甲基黄嘌呤和0.05％的BSA和20mM的HEPES Hank′s缓冲液(pH7.4)洗涤(下文，将含有0.2mM的3-异丁基甲基黄嘌呤和0.05％的BSA和20mM的HEPES Hank′s缓冲液(pH7.4)称作反应缓冲液)细胞。然后加0.5ml的反应缓冲液于培养箱保温30分钟。除去反应缓冲液，加入新的反应缓冲液0.25ml之后，再给细胞添加0.25ml的2μM毛喉素反应缓冲液，该缓冲液已加有1nM的神经介肽U或者1nM的神经介肽U以及待测化合物，37℃下反应24分钟。用Picagene细胞溶解剂(东洋Ink制造株式会社)使细胞溶解，在溶解液中添加发光底物(东洋Ink制造株式会社)。用发光光度计、液体闪烁计数仪或top计数器测定荧光素酶发出的光。能使神经介肽U与TGR-1的结合发生改变的化合物并产生了影响可以通过比较仅投药神经介肽U来测定荧光素酶发出光的大小。同时，由于神经介肽U的投药而抑制了由于毛喉素刺激而增加发光强度，但可以将能够使这种抑制得到恢复的化合物选作具有能使神经介肽U与TGR-1的结合发生改变的增补物质。另一方面，只投药待测化合物同投药神经介肽U一样由于毛喉素刺激而增加发光强度，进而观察到有同样的抑制作用，由此可以筛选激动剂。
作为报道基因可以使用例如除了荧光素酶还有碱性磷酸酶、氯霉素-乙酰基转移酶或β-半乳糖苷酶。这些报道基因的基因产物酶活性如下所述用厂家的测定试剂盒能简单地测定。例如碱性磷酸酶的活性用[和光纯药]生产的Lumi-phos 530、氯霉素-乙酰基转移酶(chlormphenicol acetyltransferase)活性用[和光纯药]生产的FAST CAT Chlormphenicol Acetyltransferase AssayKIT、β-半乳糖苷酶活性用[和光纯药]生产的Aurora Gal-XE测定。
(4)TGR-1表达细胞受到神经介肽U刺激后将花生四烯酸代谢产物释放于细胞外。在这种情况下，事先将有放射活性的花生四烯酸摄取细胞内再将该活性释放于细胞外，可以测定其放射活性。添加神经介肽U或者添加神经介肽U以及待测化合物，研究神经介肽U对花生四烯酸代谢产物释放活性的影响，由此可以筛选影响于神经介肽U与TGR-1之间结合的化合物。由于神经介肽U的刺激使花生四烯酸代谢产物释放，抑制这种活性的化合物将作为筛选具有能使神经介肽U与TGR-1的结合发生改变的增补物质。另外，仅添加待测化合物，研究TGR-1表达细胞释放花生四烯酸代谢产物活性，由此可以筛选具有激动剂活性的化合物。
对神经介肽U和TGR-1结合的影响筛选化合物的方法通过下面具体阐述。
以每孔为5×104个细胞密度将表达TGR-1受体的CHO细胞播种于24孔平板上，培养24小时后，加[3H]花生四烯酸使每孔为0.25μCi。添加[3H]花生四烯酸16小时之后，用含有0.05％的BSA和20mM的HEPES Hank′s缓冲液(pH7.4)洗涤细胞，各孔添加500μl的缓冲液，该缓冲液含有终浓度为10nM的神经介肽U或者10nM的神经介肽U以及待测化合物，这些化合物溶于含有0.05％的BSA和20mM的HEPES Hank′s缓冲液(pH7.4)。以下，将含有0.05％的BSA和20mM的HEPES Hank′s缓冲液(pH7.4)称作反应缓冲液。37℃下保温60分钟。然后将400μl的反应液加入闪光剂中，用闪光计数仪测定释放于反应液中的[3H]花生四烯酸代谢物的产量。将未添加有神经介肽U的反应缓冲液的培养基中[3H]花生四烯酸代谢物的产量看作0％，将添加10nM的神经介肽U的培养基中[3H]花生四烯酸代谢物的产量看作100％，求出待测化合物对神经介肽U与TGR-1之间结合的影响。花生四烯酸代谢产物活性如果低于50％，可以将待测化合物选作具有能使神经介肽U与TGR-1的结合发生改变的增补物质。
(5)TGR-1表达细胞通过神经介肽U刺激使细胞内Ca离子浓度增大，由此可以研究待测化合物对神经介肽U与TGR-1之间结合的影响。
将TGR-1表达细胞播种于灭菌的显微镜用盖玻片，2天后，将培养液置换于悬浮的4mM Fura-2 AM(同仁化学研究所)HBSS，室温放置2小时30分。用HBSS洗涤后，将盖玻片放入比色杯中，用荧光测定仪测定505nm荧光强度比之增加程度，这是在激发波长为340nm及380nm的情况下测定的，同时加入神经介肽U或者加入神经介肽U以及待测化合物。这时比较仅投药神经介肽U产生荧光强度的变化，根据测定添加待测化合物而产生的荧光强度的变化可以筛选对神经介肽U和TGR-1之间结合产生影响的化合物。如下所述，还可使用FLIPR(Molecular device)装置进行筛选。即，将Fluo-3AM(同仁化学研究所)加入细胞悬浮液，经过细胞吸收之后，离心，洗涤数次上清液后，将细胞播种于96孔平板之上。放入FLIPR装置中，同Fura-2AM一样加入神经介肽U或者加入神经介肽U以及待测化合物。这时比较仅投药神经介肽U产生荧光强度的变化，根据测定添加待测化合物而观察到的荧光强度的变化可以筛选对神经介肽U和TGR-1之间结合产生影响的化合物。在这些情况下，将由于添加神经介肽U而抑制荧光强度增大的化合物选作具有能使神经介肽U与TGR-1的结合发生改变的增补物质。另一方面，也可根据由于仅添加待测化合物而增大荧光强度来筛选激动剂。
如水母发光蛋白一样随着细胞内Ca离子浓度的增大而发光，首先使这样的蛋白质基因在TGR-1细胞中同时表达，随着细胞内Ca离子浓度的增加，水母发光蛋白与Ca结合形成结合型蛋白而发光，利用这个特点，添加神经介肽U或者加入神经介肽U以及待测化合物，然后与仅投药神经介肽U进行比较，通过测定添加待测化合物而产生发光强度的变化，可以筛选对神经介肽U和TGR-1之间结合产生影响的化合物。其筛选方法同上，但没有吸收荧光物质的除外。
(6)众所周知，在能够表达受体的细胞中添加受体激动剂，细胞内肌醇三磷酸浓度增大。神经介肽U的刺激观察到TGR-1细胞产生所述的反应，由此可以筛选对神经介肽U和TGR-1之间结合产生影响的化合物。将细胞播种于24孔平板上，给培养第一天的细胞添加肌醇[2-3H](2.5μCi/Well)，在培养基中充分清洗培养1天的细胞，然后，再添加神经介肽U或者加入神经介肽U以及待测化合物，之后加10％的高氯酸停止该反应。用1.5M KOH、60mM HEPES溶液中和，再过0.5ml的AGl×8树脂柱(Bio-Rad)，用5mMNa2BO360mM HCOONH4洗涤，再用液体闪烁计数仪测定用1M HCOONH40.1M HCOOH洗脱的放射活性。将未添加有神经介肽U的反应缓冲液的培养基中放射活性看作0％，将添加有神经介肽U的培养基中放射活性看作100％，求出待测化合物对神经介肽U与TGR-1之间结合的影响。肌醇三磷酸产生活性如果低于50％，可以将待测化合物选作具有能使神经介肽U与TGR-1的结合发生改变的增补物质。
(7)将含有TRE(TPA response element)的DNA，导入Picagene basic载体或Picagene增强子载体(东洋Ink株式会社)的荧光素酶基因上游的多克隆位点上，以此作为TRE-报道基因载体。在转染的TRE-报道基因载体细胞中，随着细胞内Ca2+水平的提高，进而刺激诱导TRE介导的荧光素酶基因表达和表达后的荧光素酶蛋白质的产生。也就是说，通过测定荧光素酶的活性可以检测细胞内转染TRE-报道基因载体而引起Ca量的变化。将TRE-报道基因载体转染到TGR-1表达细胞利用这种细胞可以筛选能使神经介肽U与TGR-1的结合发生改变的化合物。具体筛选方法如下。
以每孔为5×103个细胞密度将转染TRE-报道基因的TGR-1表达细胞播种于24孔平板上，培养48小时。用含有0.05％的BSA和20mM的HEPESHank′s缓冲液(pH7.4)洗涤细胞。添加10nM的神经介肽U或者添加10nM的神经介肽U以及待测化合物，37℃下反应60分钟。用Picagene细胞溶解剂(东洋Ink株式会社)使细胞溶解，在溶解液中添加发光底物(东洋Ink株式会社)。用光度计、液体闪烁计数仪或Top计数仪测定荧光素酶发出的光。能使神经介肽U与TGR-1的结合发生改变的化合物并产生了影响可以通过比较仅投药神经介肽U来测定荧光素酶的发光量。同时，由于神经介肽U的投药使细胞内Ca离子浓度提高进而增加了发光量，但是能够抑制这种增加发光量的化合物，可选作具有能使神经介肽U与TGR-1的结合发生改变的增补物质。另一方面，只投药待测化合物同投药神经介肽U一样观察到发光量的增加，可以筛选激动剂。
作为报道基因可以使用例如除了荧光素酶，还有碱性磷酸酶、氯霉素-乙酰基转移酶或β-半乳糖苷酶。这些报道基因的基因产物酶活性如下所述，用厂家的测定试剂盒能简单地测定。例如碱性磷酸酶的活性用[和光纯药]生产的Lumi-Phos 530、氯霉素-乙酰基转移酶(chlormphenicol acetyltransferase)活性用[和光纯药]生产的FAST CAT chlormphenicol Acetyltransferase AssayKIT、β-半乳糖苷酶活性用[和光纯药]生产的Aurora Gal-XE测定。
(8)对神经介肽U产生效应的TGR-1表达细胞由于MAP激酶的激活而观察到了增殖。根据MAP激酶的激活、胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入、细胞数的计测(MTT等)可以检测其增殖情况。由此可以对能够改变神经介肽U与TGR-1结合的化合物进行筛选。
有关MAP激酶活性的检测，是将神经介肽U或者神经介肽U及待测化合物添加于细胞内，然后从细胞溶解液中获得抗MAP激酶抗体，经过免疫沉淀法得到MAP激酶级分，再使用例如，[和光纯药]生产的MAP KinaseAssay Kit和γ-[32P]-ATP很容易检测到MAP激酶活性。有关掺入胸腺嘧啶脱氧核苷活性的检测，首先播种TGR-1表达细胞，将神经介肽U或者神经介肽U及待测化合物添加于细胞内，然后加[methyl-3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷，溶解该细胞，根据液体闪烁计数仪的计数来检测掺入细胞内标记胸腺嘧啶脱氧核苷的放射性。
有关TGR-1表达细胞增殖的检测，首先播种表达细胞，再添加神经介肽U或者神经介肽U及待测化合物于细胞内，进而添加MTT[(3-4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑嗡溴化物]，MTT被细胞吸收后由MTT变为MTT甲臜，用盐酸使MTT甲臜酸化并同异丙醇一起溶解细胞，然后在570nm吸收波长处进行测定，进而检测细胞的增殖情况。
利用掺入的标记胸腺嘧啶脱氧核苷活性来筛选能使神经介肽U与TGR-1结合发生改变的化合物，具体筛选过程如下在24孔平板上每孔播种5000个TGR-1表达细胞，培养1天。再在不含血清的培养基中培养2天，使细胞处于饥饿状态。给细胞添加神经介肽U或者神经介肽U及待测化合物，培养24小时，再在每个孔里添加0.015MBq的[methyl-3H]-胸腺嘧啶脱氧核苷，培养6个小时。用PBS(-)洗涤细胞，然后加入甲醇放置10分钟。加5％三氯醋酸放置15分钟后，用蒸馏水将固定的细胞洗涤4次。再用0.3N氢氧化钠溶液溶解细胞，用液体闪烁计数仪测定溶解液中的放射活性。有关检测能使神经介肽U与TGR-1结合发生改变的化合物带来的影响，主要通过只给药神经介肽U，并比较掺入的胸腺嘧啶脱氧核苷使放射活性增大，这时由于给药神经介肽U而使放射活性增大，但是所述化合物抑制了这种放射活性的增加，进而可以选择该化合物作为具有能使神经介肽U与TGR-1结合发生改变的增补物质。另一方面，只投药待测化合物其效果与投药于神经介肽U相同，并观察到放射活性的增加，由此可以进行激动剂的筛选。
(9)若添加神经介肽U于TGR-1表达细胞，K离子通道被激活，细胞内的K离子被释放到细胞外。K离子和同族元素的Rb离子通过与K离子无区别的K离子通道释放到细胞外，因此加入标记的Rb(86Rb)使细胞吸收，然后通过神经介肽U刺激测定释放出来的(86Rb)，由此可以检测神经介肽U的作用。利用(86Rb)释放活性来筛选能使神经介肽U与TGR-1结合发生改变的化合物，具体筛选过程如下播种于24孔平板上将培养2天的TGR-1表达细胞于含有1mCi/ml的86RbCl培养基中保温2小时。充分洗涤培养基，完全清除细胞外溶液中的86RbCl，添加神经介肽U或者神经介肽U及待测化合物，30分钟后回收细胞外溶液，用γ计数器测定放射活性。有关检测能使神经介肽U与TGR-1结合发生改变的化合物带来的影响，主要通过只给药神经介肽U，并比较由于[86Rb]的释放使放射活性增强，这时由于给药神经介肽U而使放射活性增大，但是所述化合物抑制了这种放射活性的增加，进而可以选择该化合物作为具有能使神经介肽U与TGR-1结合发生改变的增补物质。另一方面，只投药待测化合物其效果与投药于神经介肽U相同，并观察到放射活性的增加，由此可以进行激动剂的筛选。
(10)利用位点传感器(Molecular device)测定由于TGR-1表达细胞与神经介肽U反应而引起细胞外pH(acidification rate)的变化，由此可以测定神经介肽U的活性。用位点传感器测定细胞外pH的变化可以筛选能使神经介肽U与TGR-1结合发生改变的化合物，具体筛选过程如下
在位点传感器内的胶囊中过夜培养TGR-1表达细胞，其容器中待细胞外pH稳定以后，灌注含有0.1％BSA的RPMI1640培养基(Molecular device)约2个小时。待pH稳定后，将含有神经介肽U或者神经介肽U及待测化合物的培养基灌注于细胞之上，由此测定培养基的pH变化。有关检测能使神经介肽U与TGR-1结合发生改变的化合物带来的影响，主要通过只给药神经介肽U，并比较由于TGR-1表达细胞的细胞外pH变化，这时由于给药神经介肽U而使细胞外pH变化，但是所述化合物抑制了这种变化，进而可以选择该化合物作为具有能使神经介肽U与TGR-1结合发生改变的增补物质。另一方面，只投药待测化合物其效果与投药于神经介肽U相同，并观察细胞外pH变化，由此可以进行激动剂的筛选。
(11)酵母(Saccharomyces cerevisiae)的单倍体交配型(hapoidα-matingType)(MATα)的性信息素受体STe2与G蛋白Gpal结合，应答于性信息素α-交配因子(mating factor)并激活MAP激酶，以下，Farl(细胞周期停滞、cellcycle arrest)以及转录活化因子Ste12被激活。Ste12诱导各种蛋白质的表达，其蛋白质含有与接合有关的FUSl。另一方面，调节因子Sst2具有抑制以上过程的功能。在这个抑制系统中，形成转导受体基因的酵母，根据受体激动剂的刺激，激活酵母细胞内信号传导系，可以尝试构建受体激动剂与受体之间的反应测定体系，这个体系中利用了刺激结果而产生的增殖等指标[Pausch，M.H.，Tredns in Biotechnology，vol.15，pp.487-494(1997)]。利用如此构建的转导受体基因酵母的体系，可以进行筛选能使神经介肽U与TGR-1之间结合特性发生变化的化合物。
除去编码MATα酵母的Ste2以及Gpal的基因，取而代之的是导入TGR-1基因以及编码Gpal-Gai2融合蛋白的基因。除去编码Far基因以不使细胞周期停滞(cell-cycle arrest)，再除去编码Sst的基因，由此可以使应答于神经介肽U的敏感性增强。将合成组氨酸的基因HIS3与FUS1连接而转导FUS1-HIS3基因。这些基因重组的操作过程依照例如，Price等[Price，L.A.等.Molecurlar and Cellular Biology，vol.15，PP.6188-6195(1995)]所述的方法，通过将生长释放抑制激素受体2型(SSTR2)基因置换为TGR-1基因，进而可以简便地进行基因重组。这样所构建的转化体酵母对TGR-1的配体即神经介肽U敏感度很高，其结果是，激活MAP激酶产生合成组氨酸的酶，在缺乏组氨酸的培养基中可以生长发育。根据这个酵母在缺乏组氨酸的培养基中发育的一个指标，可以观察到对神经介肽U而产生应答的TGR-1表达酵母。下面，阐述筛选能使神经介肽U与TGR-1之间结合特性发生改变的化合物。
如上所述，将转化形成的酵母过夜培养于完全为合成的培养基中即，液体培养基，加入已不含组氨酸的溶解琼脂培养基，其浓度为2×104cell/ml，并播种于9×9cm的角形平板上。琼脂固化后，将浸透有神经介肽U或者神经介肽U以及待测化合物的灭菌滤纸覆盖于琼脂表面之上，30℃下培养3天。有关检测能使神经介肽U与TGR-1结合发生改变的化合物而带来的影响，主要通过只给药神经介肽U，并比较由于滤纸周围酵母的生长发育，这时由于给药神经介肽U而使酵母的生长发育受到抑制，但是所述化合物抑制了这种生长发育，进而可以选择该化合物作为具有能使神经介肽U与TGR-1结合发生改变的增补物质。另一方面，只投药待测化合物其效果与投药于神经介肽U相同，并观察酵母的生长发育，由此可以进行激动剂的筛选。还有，事先添加神经介肽U于琼脂培养基中，仅使灭菌的滤纸浸透有待测化合物并进行培养，在整个平板上观察到滤纸周围受到酵母发育的影响，由此也可以研究使神经介肽U与TGR-1结合发生改变的化合物而带来的影响。
(12)将TGR-1的RNA注入到非洲爪蟾卵母细胞中，若用神经介肽U刺激，细胞内Ca离子浓度增大，产生氯化钙活化流(Calcium-activated chloridecurrent)。进而可以形成膜电位的变化(与K离子浓度梯度变化相同)。根据在由神经介肽U而转导TGR-1非洲爪蟾的卵母细胞中观察到这种反应，由此可以筛选使神经介肽U与TGR-1之间结合给予变化的化合物。
因冷冻而不能活动的雌性非洲爪蟾，从中取出卵母细胞块，将卵块溶于MBS(88mM NaCl，1mM KCl，0.41mM CaCl2，0.33mM Ca(NO3)2，0.82mMMgSO4，2.4mM NaHCO3，10mM HEPES，pH7.4)，其中含有胶原酶(0.5mg/ml)待卵块溶化后，于19℃，用150rpm处理1-6个小时。把细胞外溶液换成MBS液，再洗涤3次，用显微操作器将TGR-1 mRNA(50ng/50nl)进行显微注射。TGR-1 mRNA或者取自于组织和细胞、或者在体外由质粒转录形成。将TGR-1 mRNA于MBS溶液中20℃下培养3天。将它放入voltage clamp装置的凹处，用林格溶液(Ringer液)冲洗，再将用于固定电位的玻璃微电极、用于测定电位的玻璃微电极插入细胞内，负极置于细胞外。待电位平稳后，用含有神经介肽U或者神经介肽U及待测化合物的林格溶液(Ringer液)冲洗，记录电位变化。有关检测能使神经介肽U与TGR-1结合发生改变的化合物而带来的影响，主要通过只给药神经介肽U，并比较转导TGR-1非洲爪蟾卵母细胞，这时由于给药神经介肽U而引起卵细胞膜电位的变化，但是所述化合物抑制了这种细胞膜电位的变化，进而可以选择该化合物作为具有能使神经介肽U与TGR-1结合发生改变的增补物质。另一方面，只投药待测化合物其效果与投药于神经介肽U相同，并观察到细胞膜电位的变化，由此可以进行激动剂的筛选。
在这个体系中，也可以导入各种G蛋白基因的poly(A)+RNA，以增大变化量使反应更容易进行测定。如水母发光蛋白在Ca2+存在的情况下，进行共同注射带有发光性质蛋白基因的poly(A)+RNA，由此可以观察到没有膜电位变化的发光现象也可以测定该反应。
筛选能使神经介肽U与TGR-1之间的结合特性发生改变的化合物或其盐的试剂盒包括，TGR-1、或含有TGR-1的细胞、或者含有TGR-1的细胞膜级分、以及神经介肽U。
本发明筛选试剂盒包括如1.用于筛选的试剂(1)用于分析和冲洗的缓冲液加有0.05％牛血清白蛋白(Sigma)的Hank’s平衡盐溶液(Gibco)。
溶液用0.45μm孔径滤膜过滤灭菌并在4℃贮存。或可以在临用时配制。
(2)TGR-1标样将表达TGR-1的CHO细胞在12孔板上传代培养，每孔5×105细胞，37℃，5％CO2和95％空气培养两天。
(3)标记的配体用[3H]、[125I]、[14C]或[35S]标记本发明的神经介肽U。
溶于适当的溶剂或缓冲液中，并将其保存在4℃或-20℃。溶液在使用时用分析缓冲液稀释到1μM。
(4)配体标准液将神经介肽U溶解于含有0.1％牛血清白蛋白(Sigma)的PBS使之浓度为1mM，-20℃保存。
2测定方法(1)用于表达TGR-1的细胞在12孔板上进行培养。在用1ml的用于分析的缓冲液洗涤2次后，每孔加入490μl该缓冲液。
(2)加5μl的10-3M-10-10M的待测化合物溶液，向所述系统中加5μl的标记神经介肽U，得到的混合液在室温反应1小时。为了测定非特异结合，在所述系统中先加5μl的10-3M的神经介肽U而不是待测化合物。
(3)除去孔中的反应混合液，将培养孔洗涤3遍，每次均用1ml的洗涤缓冲液。用0.2N NaOH-1％SDS溶解与细胞结合的标记配体神经介肽U，然后与4ml的液闪剂A(和光纯药)混合。
(4)用液体闪烁计数仪(Beckman)测定放射性。其最大结合量用下式求得PMB＝[(B-NSB)/(B0-NSB)]×100PMB最大结合百分率B 加样时的值NSB非特异结合量B0最大结合量利用本发明的筛选方法或筛选试剂盒得到的化合物或其盐是一种能使神经介肽U与TGR-1之间的结合改变(抑制或促进结合)的化合物，具体地说，它们是一种介导TGR-1刺激细胞活性(所谓的TGR-1激动剂)、或者不具有刺激细胞活性(所谓的TGR-1拮抗剂)的化合物。所述这种化合物为肽、蛋白、非肽化合物、合成化合物、发酵产物等，这些化合物有新的或已知的。
评价上面所述的化合物是激动剂还是拮抗剂，其具体方法如(i)或(ii)。
(i)用上面所述(1)-(3)的筛选方法实施的结合测定，得到能使神经介肽U与TGR-1之间的结合特性改变(特别是抑制结合)的化合物，然后测定该化合物是否具有介导的TGR-1刺激细胞的活性。若具有细胞刺激活性的化合物或其盐则为TGR-1激动剂，若该化合物不具有细胞刺激活性的化合物或其盐则为TGR-1拮抗剂。
(ii)(a)让待测化合物与含有TGR-1的细胞接触，测定介导上述TGR-1的细胞刺激活性，若有活性的化合物或其盐，则为TGR-1激动剂。(b)让能激活TGR-1的化合物(例如，本发明的神经介肽U或TGR-1激动剂等)与含有TGR-1的细胞接触，同时让能激活TGR-1的化合物以及待测化合物与含有TGR-1的细胞接触，来测定并比较介导TGR-1的细胞刺激活性。能够使由激活TGR-1的化合物而引起细胞刺激活性的改变，若降低细胞刺激活性的化合物或其盐则为TGR-1拮抗剂。
该TGR-1激动剂同神经介肽U一样对TGR-1具有生理活性作用，因此，TGR-1激动剂同神经介肽U一样，安全低毒适用作药物。
相反，TGR-1拮抗剂可以抑制神经介肽U对TGR-1产生的生理活性，因此，TGR-1拮抗剂可作为抑制该受体活性的一种药物，这种药物既安全又低毒。
神经介肽U或其盐有增进平滑肌收缩、血压上升作用以及调节肠管中的离子转运，皮下给药后的ACTH和其后的皮质酮增高等，可利用它预防或治疗低血压病和用作局部血管收缩剂，用所述筛选方法或筛选试剂盒得到该化合物，其中TGR-1激动剂除了可利用它预防或治疗低血压病和用作局部血管收缩剂外，还可作为促进子宫收缩药物，以及用作如下病症的治疗或预防药物等，如微弱阵痛、弛缓性出血、胎盘娩出前后、子宫复旧不全、人工流产、引产、停止分娩、子宫颈管机能不全、子宫内翻、不孕症、母体多胎妊娠的护理、胎盘滞留以及卵膜滞留、分娩后出血、女性生殖器肿瘤、胎位异常、月经困难、流产、子宫内膜症、子宫内膜异位症、慢性子宫炎症性疾病、子宫肌瘤、子宫畸形、子宫腺肌症、子宫颈部裂伤、外伤后紧张性综合征等，也可用于改善、预防和治疗有关子宫收缩不全的各种疾病。另外TGR-1拮抗剂除了可利用它预防或治疗高血压病、心肌梗塞、急性肾功不全、紧张性疾病(例如①心血管疾患(狭窄性心脏病、心肌梗塞、心率不齐等)②呼吸系统疾病(支气管哮喘、呼吸过度综合征等)③肌肉骨骼系统疾病(慢性类风湿性关节炎、腰痛、偏头痛、紧张性头痛等)④其他(糖尿病、更年期疾病、慢性疼痛、免疫力低下等)、消化系统疾病(胃溃疡、溃疡性大肠炎等)的预防或治疗药物外，作为子宫收缩的抑制剂，还可用作如下病症等的治疗或预防药物，如激烈阵痛、假性阵痛、延长妊娠、强直性子宫收缩、胎儿窒息、子宫破裂、颈管裂伤、早产、子宫肌瘤、子宫畸形、子宫腺肌症、娩出力异常、慢性子宫炎症性疾病、母体多胎妊娠的护理、胎位异常、普-威综合征、月经困难等与子宫收缩过多有关的疾病。
另外，神经介肽U或其盐还具有调节食欲的作用，基于食欲调节作用，在上述的筛选方法或应用筛选试剂盒所得的化合物中，FM-3激动剂可用来作为食物抑制剂、抗肥胖药、助消化的治疗药和食量过大的治疗药等，另外，FM-3拮抗剂也可用作食欲促进剂等。
用上述筛选方法或筛选试剂盒得到的化合物之盐可以使用药学上可接受的盐。例如有无机碱形成的盐、有机碱形成的盐、无机酸形成的盐、有机酸形成的盐、碱性或酸性氨基酸形成的盐。
与无机碱形成合适的盐有例如，碱金属盐如钠盐、钾盐等；碱土类金属盐如钙盐、锰盐等；还有铝盐、铵盐等。
与有机碱形成合适的盐有例如，与三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、2，6-二甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、环己胺、二环己胺、N，N-二苄基乙二胺等形成的盐等。
与无机酸形成合适的盐有例如，与盐酸、磷酸、氢溴酸、硫酸等形成的盐。
与有机酸形成合适的盐有例如，乙酸、甲酸、丙酸、延胡索酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苹果酸、草酸、苯甲酸、甲磺酸、苯磺酸形成的盐等。
与碱性氨基酸形成合适的盐有例如，精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等形成的盐，与酸性氨基酸形成合适的盐有例如，天冬氨酸、谷氨酸等形成的盐等。
用本发明筛选方法或筛选试剂盒得到的化合物或其盐用作上述医药产品时，可遵照如下所述内容使用。
将本发明通过筛选方法或筛选试剂盒得到的化合物或其盐用作所述医药产品使用时，可以按照常规方法实施。例如，必要时加糖衣或肠溶性糖衣制成片剂、胶囊、酏剂、微胶囊等剂型口服，或以可注射型制剂如无菌溶液或悬浮在水或其它可药用液体中的悬浮液形式经非胃肠道给药。例如，该化合物或其盐与生理学上可接受的已知载体、调味剂、赋形剂、载色剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂等制成药剂规则所要求的常用药剂的单位剂型。控制制剂中的活性成分使得在给定范围内获得合适剂量。
可与片剂、胶囊等混合的添加剂包括，粘和剂如明胶、玉米淀粉、西黄耆胶和金合欢胶；赋形剂如结晶纤维素；膨胀剂如玉米淀粉、明胶和藻酸；润滑剂如硬脂酸镁；甜味剂如蔗糖、乳糖和糖精；加味剂如薄荷、akamono oil和樱桃。当制剂单位剂型为胶囊形式时，可进一步将液体载体如油和脂肪同上述添加剂一起使用。可根据常规制药方法制备注射用无菌组合物，例如将活性成分与天然植物油如芝麻油和椰子油等溶解或悬浮在载体，如注射用的水溶液来制备药物。
用于注射的液体介质之例包括，生理盐水、包含葡萄糖和其它辅助制剂(如D-山梨醇、D-甘露醇和氯化钠等)的等渗溶液，并可以进一步同合适的助溶剂如醇(如乙醇等)、聚醇(如丙二醇和聚乙二醇等)、非离子表面活性剂(如聚山梨酸酯80TM和HCO-50等)等结合使用。油性介质有芝麻油和豆油，它们可与助溶剂如苯甲酸苄酯和苯甲醇结合使用。
此外，也可进一步与缓冲液(例如磷酸盐缓冲液和乙酸钠缓冲液等)、镇静剂(例如苯扎氯胺和盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(如人血清白蛋白、聚乙二醇等)、防腐剂(例如苯甲醇、酚等)、防氧化剂等结合使用。由此制备的注射液体一般装在合适的无菌安瓿中。
如此所获制剂安全、低毒，因此可投药于温血动物(例如，人、小鼠、大鼠、豚鼠、绵羊、猪、牛、猫、狗、猴、家鸡等)，两栖类(如青蛙等)及鱼类等。
本发明用筛选方法或筛选试剂盒得到化合物(特别指拮抗剂)或其盐的给药剂量视病症情况而定，当口服给药时，一般成年人(体重60kg)的高血压患者，一天正常剂量为，大约0.1-1000mg，优选大约1.0-300mg，更优选3.0-50mg。当非胃肠道给药时，其一次投药量视给药对象、症状、投药方法等情况而定，例如以针剂给药时，一般成年人(体重60kg)高血压患者，一天的剂量为大约0.01-30mg，优选大约0.1-20mg，更优选大约0.1-10mg，优选静脉注射给药。对于其它动物种类，可以按每60kg体重换算相应的给药剂量。
本发明进一步涉及针对TGR-1的抗体。TGR-1的抗体只要能识别TGR-1其多克隆抗体或单克隆抗体均可。
针对本发明TGR-1的抗体可使用本发明TGR-1作为抗原，根据本领域公知的抗体或抗血清的生产法制备。
(a)产生单克隆抗体细胞的制备将本发明的TGR-1，单独或与载体或稀释剂一起给药于哺乳动物体内能产生抗体的部位。为了增加给药后抗体的产量，可给予福氏完全或不完全佐剂。有效给药通常约为每2-6周一次，一共2-10次。使用的温血动物包括猴子、兔子、狗、豚鼠、大鼠、小鼠、绵羊、山羊，优选大鼠和小鼠。
在制备产生单克隆抗体细胞时，从抗原免疫的温血动物如小鼠中选择抗体滴度比较明显的动物，在最后一次免疫的2-5天后取脾脏或淋巴结，使其中产生抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合，获得产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。抗血清中抗体滴度的测定可以通过使抗血清与随后所述的标记的TGR-1反应，然后测定标记试剂同抗体的结合活性。可以根据Koehler和Milstein(自然，256，495，1975)的方法进行融合。融合加速剂的例子为聚乙二醇(PEG)、仙台病毒等，优选PEG。
骨髓瘤细胞的例子包括NS-1、P3U1、SP2/0，优选P3U1。所用抗体产生细胞(脾脏细胞)同骨髓瘤细胞的比例优选约为1∶1到20∶1，加入浓度约为10％-80％的PEG(优选PEG 1000-6000)。然后在20-40℃保温。为了有效实施细胞融合，优选30-37℃保温约1-10分钟。
可以用各种方法筛选产生单克隆抗体的杂交瘤。这些方法有将作为抗原的TGR-1直接或与载体一起吸附至一种固相(如微量反应板)，将杂交瘤上清加入到该固相中，然后加入标记的放射性物质或酶的抗免疫球蛋白抗体(如果用小鼠细胞作融合，则用抗小鼠的免疫球蛋白抗体)或蛋白A，检测结合到固相上的单克隆抗体；另一方法为，将杂交瘤培养上清加入到吸附有抗免疫球蛋白抗体或蛋白A的固相中，加入标记的放射性物质或酶的TGR-1，检测结合到固相上的单克隆抗体。
单克隆抗体的筛选可以根据本领域公知的方法或其改进方法进行。一般地，在含有HAT(次黄嘌呤、氨甲喋呤和胸腺嘧啶)的动物细胞培养基中进行筛选。可以使用任何筛选和生长培养基，只要杂交瘤可以在其中生长。例如，可以使用含有1％-20％，优选10-20％牛胎血清的RPMI 1640培养基、含有1％-10％牛胎血清的GIT培养基(和光纯药工业株式会社)、无血清的杂交瘤培养基(SFM-101，日水制药株式会社)作为筛选或生长培养基。通常在含5％CO2的条件下于20-40℃(优选37℃)培养约5天-3周(优选1-2周)。杂交瘤培养上清液中抗体滴度的测定同上述抗血清中抗体滴度测定方法相同。
(b)单克隆抗体的纯化单克隆抗体的分离和纯化同通常的多克隆抗体的分离纯化法一样，例如免疫球蛋白的分离和纯化方法(如盐析、乙醇沉淀、等电点沉淀、电泳、离子交换剂(如DEAE)吸附和去吸附、超离心、凝胶过滤、或一种特异性纯化方法，其包括仅收集与结合了抗原的固相、蛋白A或蛋白G等已活化吸附剂相结合的抗体并使之分离以获得该抗体)。
本发明多克隆抗体的制备用本领域公知的方法或其改进方法进行。例如，用与上述生产单克隆抗体相似的方法生产免疫原(TGR-1抗原)与载体蛋白形成的复合物并用其免疫温血动物。从已免疫的动物收集产物，其中含有本发明TGR-1的抗体，分离和纯化该抗体。
在由免疫原和载体蛋白组成的用于免疫哺乳动物的复合物中，对载体蛋白的类型和载体同半抗原的混合比率无限定，只要能针对与载体一起免疫的半抗原有效产生抗体。例如，牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或匙孔血蓝蛋白与半抗原以载体比半抗原重量比约0.1-20(优选约1-5)的比率偶联。
不同的缩合剂可用于偶联载体和半抗原。戊二醛、碳二亚胺、马来酰亚胺活化的酯和含有巯基或二硫代吡啶基的活化的酯试剂可用于偶联。
将缩合产物单独或与载体或与稀释剂一起给药于温血动物体内能产生抗体的部位。为了增加给药后抗体的产量，可给予福氏完全或不完全佐剂。大约每2-6周给药一次，共3-10次。
多克隆抗体从用上述方法免疫的哺乳动物的血液、腹水等(优选血液)中收集。
抗血清中多克隆抗体滴度的测定同上述测定血清抗体滴度的方法相同。可以根据上述用于分离和纯化单克隆抗体的免疫球蛋白分离纯化方法来分离和纯化多克隆抗体。
针对本发明的抗体能特异地识别本发明的TGR-1，因此可用于定量测试样品溶液中的本发明TGR-1，尤其是通过夹心免疫分析进行定量。也就是说，本发明提供了下述的定量方法(i)一种定量待测样品液中本发明TGR-1的方法，其包括，使本发明的抗体与待测样品液以及标记的本发明TGR-1进行竞争反应，测定与该抗体结合的本发明标记性TGR-1的比率；和，(ii)一种定量待测样品液中本发明TGR-1的方法，其包括，同时或先后使所述待测样品液与固定在固相载体上的本发明抗体以及标记的本发明其它抗体反应，测定固相载体上标记试剂的活性。
在上述方法(ii)中，优选一种抗体能识别本发明TGR-1的N-末端，而另一抗体能识别本发明TGR-1的C-末端。
针对本发明TGR-1的单克隆抗体(下文，通常称作本发明单克隆抗体)可用于测定本发明TGR-1。此外，也可通过组织染色来检测本发明TGR-1。为此，可用抗体分子本身或使用抗体分子的F(ab’)2、Fab’或Fab片段。
对使用本发明TGR-1的抗体进行的测定方法没有特别的限制；可以使用任何方法，只要它涉及以下方法，即根据待测样品液中相应抗原含量(例如TGR-1的量)，用化学或物理方法检测抗体、抗原或抗体-抗原复合物的量，然后根据含已知量抗原的标准溶液制备的标准曲线来计算。优选的方法为，例如比浊法、竞争法、免疫测定法和夹心法；就敏感性和特异性而言，特别优选后面将要描述的夹心法。
用于分析方法的标记试剂的例子为放射性同位素、酶、荧光物质和化学发光物质等。同位素的例子包括[125I]、[131I]、[3H]、[14C]等。优选酶的例子为稳定、具有高比活的酶，包括β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸酶、过氧化物酶和苹果酸脱氢酶。荧光物质的例子包括荧光胺、异硫氰酸荧光素等。化学发光物质的例子包括鲁米诺、鲁米诺衍生物、萤光素、光泽精等。此外，也可使用生物素-链霉素系统来对抗原或抗体标记。
在固定抗原或抗体时，可以使用物理吸附。作为替代方法，也使用传统上来固定蛋白质或酶的化学结合。载体的例子包括，固相多糖如琼脂糖、葡聚糖和纤维素；合成树脂如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、硅；或玻璃等。
在夹心法中，待测样品溶液与本发明的固定化单克隆抗体反应(第一反应)，然后与本发明的标记的其它单克隆抗体反应(第二反应)，测定固相载体上的标记试剂活性，由此可以测定待测样品中本发明TGR-1的量。第一和第二反应可以以相反次序进行，或同时或有间隔的先后进行。标记试剂和固定的方法同上述的相同。
在夹心法免疫分析中，用于标记的抗体和用于固相的抗体未必是一种类型或一个种类的抗体，也可使用两种或多种抗体的混合物来改善测定的灵敏度等。
在根据本发明的夹心方法测定本发明TGR-1时，优选用于第一和第二反应的单克隆抗体与本发明TGR-1的结合位点彼此不同。也就是说，在第一和第二反应用的抗体为，当第二反应的抗体识别本发明TGR-1的C端时，优选在第一反应中使用能识别除C端以外的位点，如N端。
本发明的单克隆抗体可用于除夹心法以外的其它分析方法，例如竞争法、免疫测定法和比浊法。在竞争法中，待测溶液中的抗原和标记抗原竞争与抗体反应，然后将未反应的标记抗原(F)及结合于抗体的标记抗原(B)分离(即B/F分离)，测定B或F的标记量，从而可以测定待测溶液中的抗原量。在此类方法的反应中，有一种液相方法和一种固相方法，前者使用可溶性抗体，即加入针对第一抗体的第二抗体后，用聚乙二醇来有效分离B/F；后者可用固定的抗体作为第一抗体，或用可溶性抗体作为第一抗体但第二抗体为固相抗体。
在免疫测定法中，待测溶液中的抗原和固相抗原竞争性地与一定量的标记抗体反应，然后使液相与固相分离；或待测溶液中的抗原与过量标记抗体反应，然后加入固相抗原，使未反应的标记抗体与该固相结合，然后使液相与固相分离。随后，测定两相的标记量，来测定待测溶液中的抗原量。
在比浊法中，测定抗原-抗体在凝胶或溶液中反应产生的不溶的沉淀量。即使待测溶液中抗原量很少且仅获得小量的沉淀，利用激光散射的激光比浊法也可以测定。
本发明应用这些免疫分析方法中任何一个进行分析时，不需要任何特殊条件和操作。除了每种方法的常规条件和操作外，本领域技术人员可构建测定本发明TGR-1的分析系统。所述常规技术的细节，参见如入江宽(编)“放射免疫分析”(1974，讲谈社，日本)；入江宽(编)“放射免疫分析，续编”(1979，讲谈社，日本)；石川荣治等(编)“酶免疫分析”(医学书院，1978)；石川荣治等(编)“酶免疫分析，第二版”(医学书院，1982)；石川荣治等(编)“酶免疫分析，第三版”(医学书院，1987)；“酶学方法”卷70(免疫化学技术(A))；同上，卷73(免疫化学技术(B))；同上，卷74(免疫化学技术(C))；同上，卷84(免疫化学技术(D选择性免疫分析))；同上，卷92(免疫化学技术(E单克隆抗体及普通免疫分析方法))；同上，卷121(免疫化学技术(I杂交瘤技术及单克隆抗体))(Academic Press出版)等)。
如上所述，使用本发明的抗体可高度敏感地定量本发明TGR-1。
此外，使用本发明的抗体可定量机体内的TGR-1浓度，可诊断有关TGR-1功能不全的各种疾病。
另外，本发明抗体可用于检出体液或者组织等待检标本液中存在的本发明TGR-1。又可用于抗体柱的制作，该抗体柱可用于纯化本发明TGR-1；检出各纯化组分中的本发明TGR-1；对受检细胞内本发明TGR-1的行踪进行分析等。
在说明书和附图中，碱基和氨基酸的代码使用IUPAC-IUB生化命名委员会规定的或本领域通用的代码，如下例所示。对于有光学异构体的氨基酸，除非特别说明，均指L形式。
DNA 脱氧核糖核酸cDNA 补的脱氧核糖核酸A 腺嘌呤T 胸腺嘧啶G 鸟嘌呤C 胞嘧啶Y 胸腺嘧啶或胞嘧啶N 胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤R 腺嘌呤或鸟嘌呤M 胞嘧啶或腺嘌呤W 胸腺嘧啶或腺嘌呤S 胞嘧啶或鸟嘌呤RNA 核糖核酸mRNA 信使核糖核酸dATP 脱氧腺苷三磷酸dTTP 脱氧胸腺嘧啶三磷酸dGTP 脱氧鸟苷三磷酸dCTP 脱氧胞嘧啶三磷酸ATP 腺苷三磷酸EDTA 乙二胺四乙酸SDS 十二烷基硫酸钠TFA 三氟乙酸EIA 酶免疫测定Gly或G甘氨酸Ala或A丙氨酸Val或V缬氨酸
Leu或L亮氨酸Ile或I异亮氨酸Ser或S丝氨酸Thr或T苏氨酸Cys或C半胱氨酸Met或M蛋氨酸Glu或E谷氨酸Asp或D天冬氨酸Lys或K赖氨酸Arg或R精氨酸His或H组氨酸Phe或F苯丙氨酸Tyr或Y酪氨酸Trp或W色氨酸Pro或P脯氨酸Asn或N天冬酰胺Gln或Q谷氨酰胺pGlu 焦谷氨酸Me甲基Et乙基Bu丁基Ph苯基TC四氢噻唑-4(R)-羧基酰胺基Bom 苄氧甲基NMP N-甲基-2-吡咯烷酮PAM 苯乙酰胺甲基用下列符号表示本说明书中多次使用的取代基、保护基以及试剂Tos 对甲苯磺酰基HONB N-羟基-5-降冰片烯基-2，3-二羧基亚胺Bzl 苄基
Z 苄氧羰基Br-Z 2-溴苄氧羰基Cl-Z 2-氯苄氧羰基Boc 叔丁氧基羰基HOBt 1-羟基苯并三唑DCC N，N′-二环己基碳二亚胺TFA 三氟乙酸Fmoc N-9-芴基甲氧基羰基DNP 二硝基苯酚Bum 叔丁氧基甲基Trt 三苯甲基BSA 牛血清白蛋白CHAPS 3-[(3-胆胺丙基)二甲基氨]-1-丙烷磺酸酯PMSF 苯甲基磺酰氟E64 (L-3-反-羧基环氧乙烷-2-羰基)L-亮氨酰-胍基丁胺GDP 鸟苷-5′-二磷酸MEMα 极限必需培养基Fura-2AM1-[6-氨基-2-(5-羧基-2-恶唑)-5-苯并呋喃]-2-(2-氨基-5-甲苯氧基)-乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸戊乙酰氧基甲酯HBSS Hank′s平衡盐溶液Fluo-3AM1-[2-氨基-5-(2，7-二氯-6-羟基-3-氧基-9-占吨基)苯氧基]-2-(2-氨基-5-甲苯氧基)-乙烷-N，N，N′，N′-四乙酸戊乙酰氧基甲酯HEPES 2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪]乙烷磺酸MeBzl 4-甲基苄基NMPN-甲基-2-吡咯烷酮本说明书的序列表中的序列编号分别表示如下。
表示实施例1中的TGR-1的氨基酸序列。
表示编码TGR-1的DNA碱基序列，其中TGR-1含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
表示实施例1所述的引物1的碱基序列。
表示实施例1所述的引物2的碱基序列。
表示猪型神经介肽U-8的氨基酸序列。
表示狗型神经介肽U-8的氨基酸序列。
表示家鸡型神经介肽U-9的氨基酸序列。
表示豚鼠型神经介肽U-9的氨基酸序列。
表示大鼠型神经介肽U-23的氨基酸序列。
表示青蛙型神经介肽U-23的氨基酸序列。
表示人型神经介肽U-25的氨基酸序列。
表示猪型神经介肽U-25的氨基酸序列。
表示狗型神经介肽U-25的氨基酸序列。
表示家鸡型神经介肽U-25的氨基酸序列。
表示青蛙型神经介肽U-25的氨基酸序列。
表示神经介肽U-25的部分肽的氨基酸序列。表示在SEQ ID NO5所示的氨基酸序列中第4位至第8位的氨基酸序列。

表示基本上与人TGR-1相同的氨基酸序列(在WO99/55732中记载的)。
表示DNA碱基序列(在WO99/55732中记载的)，其中DNA含有由SEQID NO23所示的氨基酸序列。
表示实施例3中所用的RTGRF2引物的碱基序列。
表示实施例3中所用的RTGRR1引物的碱基序列。
表示在实施例3中得到的编码大鼠型TGR-1的氨基酸序列。
表示编码大鼠型TGR-1的DNA碱基序列。
在后面将要叙述的实施例1中得到的编码SEQ ID NO1所示的TGR-1的cDNA，由包含该cDNA的转化体Escherichia coliTOP10/pCR2.1TOPO-TGR1于1999年12月6日保藏于茨城市筑波市东1-1-3的通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)，其保藏编号为FERM BP-6964，并于1999年11月12日保藏于大阪府大阪市淀川区十三本町2-17-85的财团法人发酵研究所(IFO)，其保藏编号为16336。
在后面将要叙述的实施例3中得到的编码SEQ ID NO21所示的TGR-1的cDNA，由包含该cDNA的转化体Escherichia coli JM109/prTGR1于2000年11月9日保藏于茨城市筑波市东1-1-3的通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NIBH)，其保藏编号为FERM BP-7355，并于2000年10月24日保藏于大阪府大阪市淀川区十三本町2-17-85的财团法人发酵研究所(IFO)，其保藏编号为16488。
实施例用以下实施例，详细说明本发明，但并不限定于本发明范围。
实施例1 编码TGR-1的cDNA的克隆和碱基序列的确定以人的睾丸cDNA(Marathon-ReadyTMcDNA；Clontech)为模板，使用2种引物，即为引物1(SEQ ID NO3)和引物2(SEQ ID NO4)进行PCR反应。在PCR反应中使用Advantage 2 Polymerase Mixture(Clontech)，进行①95℃1分钟之后，②95℃30秒，68℃2分钟循环5次，③95℃30秒，64℃30秒，68℃2分钟循环5次，④95℃30秒，62℃30秒，68℃2分钟循环30次之后，再进行⑤68℃7分钟的延长反应。反应后按照TA克隆试剂盒(Invitrogen)的操作说明将反应产物克隆到pCR2.1TOPO质粒载体上。并将其导入至大肠杆菌TOP10中，在含有氨苄青霉素的LB琼脂培养基中筛选带有质粒的克隆。分析每个克隆的序列得到编码TGR-1(SEQ ID NO1)的cDNA的碱基序列(SEQ ID NO2)。
实施例2用位点传感器来比较神经介肽U-8对TGR-1表达的CHO细胞以及mock细胞的反应性将实施例1制作得到的编码TGR-1的cDNA，按照本领域公知的方法制作的TGR-1表达的CHO细胞以及mock细胞，以每孔为2.7×105个细胞密度播种于位点传感器上的胶囊内，过夜培养。将装有细胞的胶囊放入位点传感器上，一边灌流含有0.1％牛血清白蛋白的低缓冲RPMI1640培养基，一边顺应细胞。以位点传感器泵的开关(开80秒，关40秒)作为1个周期，反复进行，当泵停止时把细胞外pH值的变化值作为酸化率定时地进行测定。用同样的培养基溶解猪型神经介肽U-8(BACHEM，H-5505，SEQ ID NO5)，将具有稀释梯度的神经介肽U-8通过在位点传感器上的循环系统暴露在细胞中，时间为7分2秒。关于反应的峰值将暴露于细胞中的前3个周期的平均值作为100％，经过换算和比较发现了TGR-1表达的CHO细胞特异地并且依不同浓度地与神经介肽U反应(图1)。
实施例3获取编码大鼠型TGR-1的cDNA为了获取编码cDNA全长的片断而合成以下2种DNA，该cDNA编码大鼠型TGR-1RTGRF25′CTGATGCTATCCTTTCACTCTCTCAGACC-3′(SEQ IDNO9)RTGRR15′TCCTTGCAGTTTTGGCACACTAGATGGA-3′(SEQ IDNO20)用上述合成的DNA，RTGRF2以及RTGRR1作为引物，再以从大鼠的子宫poly(A)+RNA合成的cDNA为模板进行PCR反应，从而扩增了编码全长的片断。PCR反应液的总量为25μl，该总量由如下几种化合物得来cDNA2μl(8ng来自poly(A)+RNA)，1μl dNTPs(10mM)，0.5μl Advantage2 DNApolymerase(Clontech)，添加有Advantage2 DNA polymerase的2.5μl 10×缓冲液，18μl蒸馏水，进一步分别添加合成NDARTGRF和RTGRR1(各为10μM)的0.5μl。该反应液在94℃2分钟时变性之后，反复进行31个98℃10秒和68℃90秒的循环周期进行PCR反应。经过电泳确定的大约1.4kb的PCR产物通过使用QIA quicl Gel Extraction Kit(Quiagen)纯化，按照TAcloning kit(Invitrogen)的操作说明，插入到pCR2.1TOPO克隆载体上，经过导入大肠杆菌JM109而获得了E.coli JM109/prTGR-1转化体。被插入到该prTGR-1质粒的碱基序列(SEQ ID NO22)被确定，由其编码的大鼠型TGR-1所预测的氨基酸序列显示于SEQ ID NO21。
另外，图2显示了与实施例1的人型序列(SEQ ID NO1)的比较。
工业利用使神经介肽U和TGR-1之间的结合特性改变的化合物或其盐的筛选方法，其特征为，该筛选方法使用本发明神经介肽U及TGR-1，所述筛选法适用于筛选治疗或预防肥胖症、高血压病、紧张性疾病等的药物。TGR-1激动剂适于用作预防和治疗肥胖症等药物，而TGR-1拮抗剂适于用作预防和治疗高血压病、紧张性疾病等药物。
序列表<110>武田药品工业株式会社(Takeda Chemical Industries，Ltd.)<120>筛选方法<130>2690WOOP<150>JP 2000-032773<151>2000-02-04<150>JP 2000-052252<151>2000-02-24<150>JP 2000-097896<151>2000-03-30<150>JP 2000-187536<151>2000-06-19<160>22<210>1<211>415<212>PRT<213>人<400>1Met Ser Gly Met Glu Lys Leu Gln Asn Ala Ser Trp Ile Tyr Gln Gln1 5 10 15Lys Leu Glu Asp Pro Phe Gln Lys His Leu Asn Ser Thr Glu Glu Tyr20 25 30Leu Ala Phe Leu Cys Gly Pro Arg Arg Ser His Phe Phe Leu Pro Val35 40 45Ser Val Val Tyr Val Pro Ile Phe Val Val Gly Val Ile Gly Asn Val50 55 60Leu Val Cys Leu Val Ile Leu Gln His Gln Ala Met Lys Thr Pro Thr65 70 75 80Asn Tyr Tyr Leu Phe Ser Leu Ala Val Ser Asp Leu Leu Val Leu Leu85 90 95Leu Gly Met Pro Leu Glu Val Tyr Glu Met Trp Arg Asn Tyr Pro Phe100 105 110Leu Phe Gly Pro Val Gly Cys Tyr Phe Lys Thr Ala Leu Phe Glu Thr115 120 125Val Cys Phe Ala Ser Ile Leu Ser Ile Thr Thr Val Ser Val Glu Arg
130 135 140Tyr Val Ala Ile Leu His Pro Phe Arg Ala Lys Leu Gln Ser Thr Arg145 150 155 160Arg Arg Ala Leu Arg Ile Leu Gly Ile Val Trp Gly Phe Ser Val Leu165 170 175Phe Ser Leu Pro Asn Thr Ser Ile His Gly Ile Lys Phe His Tyr Phe180 185 190Pro Asn Gly Ser Leu Val Pro Gly Ser Ala Thr Cys Thr Val Ile Lys195 200 205Pro Met Trp Ile Tyr Asn Phe Ile Ile Gln Val Thr Ser Phe Leu Phe210 215 220Tyr Leu Leu Pro Met Thr Val Ile Ser Val Leu Tyr Tyr Leu Met Ala225 230 235 240Leu Arg Leu Lys Lys Asp Lys Ser Leu Glu Ala Asp Glu Gly Asn Ala245 250 255Asn Ile Gln Arg Pro Cys Arg Lys Ser Val Asn Lys Met Leu Phe Val260 265 270Leu Val Leu Val Phe Ala Ile Cys Trp Ala Pro Phe His Ile Asp Arg275 280 285Leu Phe Phe Ser Phe Val Glu Glu Trp Ser Glu Ser Leu Ala Ala Val290 295 300Phe Asn Leu Val His Val Val Ser Gly Val Phe Phe Tyr Leu Ser Ser305 310 315 320Ala Val Asn Pro Ile Ile Tyr Asn Leu Leu Ser Arg Arg Phe Gln Ala325 330 335Ala Phe Gln Asn Val Ile Ser Ser Phe His Lys Gln Trp His Ser Gln340 345 350His Asp Pro Gln Leu Pro Pro Ala Gln Arg Asn Ile Phe Leu Thr Glu355 360 365Cys His Phe Val Glu Leu Thr Glu Asp Ile Gly Pro Gln Phe Pro Cys370 375 380Gln Ser Ser Met His Asn Ser His Leu Pro Thr Ala Leu Ser Ser Glu385 390 395 400Gln Met Ser Arg Thr Asn Tyr Gln Ser Phe His Phe Asn Lys Thr405 410 415<210>2<211>1245<212>DNA<213>人<400>2atgtcaggga tggaaaaact tcagaatgct tcctggatct accagcagaa actagaagat60ccattccaga aacacctgaa cagcaccgag gagtatctgg ccttcctctg cggacctcgg 120cgcagccact tcttcctccc cgtgtctgtg gtgtatgtgc caatttttgt ggtgggggtc 180attggcaatg tcctggtgtg cctggtgatt ctgcagcacc aggctatgaa gacgcccacc 240aactactacc tcttcagcct ggcggtctct gacctcctgg tcctgctcct tggaatgccc 300ctggaggtct atgagatgtg gcgcaactac cctttcttgt tcgggcccgt gggctgctac 360ttcaagacgg ccctctttga gaccgtgtgc ttcgcctcca tcctcagcat caccaccgtc 420agcgtggagc gctacgtggc catcctacac ccgttccgcg ccaaactgca gagcacccgg 480cgccgggccc tcaggatcct cggcatcgtc tggggcttct ccgtgctctt ctccctgccc 540aacaccagca tccatggcat caagttccac tacttcccca atgggtccct ggtcccaggt 600tcggccacct gtacggtcat caagcccatg tggatctaca atttcatcat ccaggtcacc 660tccttcctat tctacctcct ccccatgact gtcatcagtg tcctctacta cctcatggca 720ctcagactaa agaaagacaa atctcttgag gcagatgaag ggaatgcaaa tattcaaaga 780ccctgcagaa aatcagtcaa caagatgctg tttgtcttgg tcttagtgtt tgctatctgt 840tgggccccgt tccacattga ccgactcttc ttcagctttg tggaggagtg gagtgaatcc 900ctggctgctg tgttcaacct cgtccatgtg gtgtcaggtg tcttcttcta cctgagctca 960gctgtcaacc ccattatcta taacctactg tctcgccgct tccaggcagc attccagaat 1020gtgatctctt ctttccacaa acagtggcac tcccagcatg acccacagtt gccacctgcc 1080cagcggaaca tcttcctgac agaatgccac tttgtggagc tgaccgaaga tataggtccc 1140caattcccat gtcagtcatc catgcacaac tctcacctcc caacagccct ctctagtgaa 1200cagatgtcaa gaacaaacta tcaaagcttc cactttaaca aaacc 1245<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>3gtcgacttaa tgtcagggat ggaaaaactt30<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>4actagttcag gttttgttaa agtggaagct 30<210>5<211>8<212>PRT<213>猪<400>5Tyr Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn1 5 8<210>6<211>8<212>PRT<213>狗<400>6Glu Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn1 5 8<210>7<211>9<212>PRT<213>鸡<400>7G1y Tyr Phe Phe Phe Arg Pro Arg Asn1 5 9<210>8<211>9<212>PRT<213>豚鼠<400>8Gly Tyr Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn1 5 9<210>9<211>23<212>PRT<213>大鼠<400>9Tyr Lys Val Asn Glu Tyr Gln Gly Pro Val Ala Pro Ser Gly Gly Phe1 5 10 15Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn20 23<210>10<211>23<212>PRT<213>蛙<400>10Ser Asp Glu Glu Val Gln Val Pro Gly Gly Val Ile Ser Asn Gly Tyr1 5 10 15Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn20 23<210>11<211>25<212>PRT<213>人<400>11Phe Arg Val Asp Glu Glu Phe Gln Ser Pro Phe Ala Ser Gln Ser Arg1 5 10 15Gly Tyr Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn20 25<210>12<211>25<212>PRT<213>猪<400>12Phe Leu Val Asp Glu Glu Phe Gln Gly Pro Ile Val Ser Gln Asn Arg1 5 10 15Arg Tyr Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn20 25<210>13<211>25<212>PRT<213>狗<400>13Phe Arg Leu Asp Glu Glu Phe Gln Gly Pro Ile Ala Ser Gln Val Arg1 5 10 15Arg Gln Phe Leu Phe Arg Pro Arg Asn20 25<210>14<211>25<212>PRT<213>鸡<400>14Tyr Lys Val Asp Glu Asp Leu Gln Gly Ala Gly Gly Ile Gln Ser Arg1 5 10 15Gly Tyr Phe Phe Phe Arg Pro Arg Asn20 25<210>15<211>25<212>PRT<213>蛙<400>15Leu Lys Pro Asp Glu Glu Leu Gln Gly Pro Gly Gly Val Leu Ser Arg1 5 10 15Gly Tyr Phe Val Phe Arg Pro Arg Asn20 25<210>16<211>5<212>PRT<213>人<400>16Phe Arg Pro Arg Asn15<210>17<211>415<212>PRT<213>人<400>17Met Ser Gly Met Glu Lys Leu Gln Asn Ala Ser Trp Ile Tyr Gln Gln1 5 10 15Lys Leu Glu Asp Pro Phe Gln Lys His Leu Asn Ser Thr Glu Glu Tyr20 25 30Leu Ala Phe Leu Cys Gly Pro Arg Arg Ser His Phe Phe Leu Pro Val35 40 45Ser Val Val Tyr Val Pro Ile Phe Val Val Gly Val Ile Gly Asn Val50 55 60Leu Val Cys Leu Val Ile Leu Gln His Gln Ala Met Lys Thr Pro Thr65 70 75 80Asn Tyr Tyr Leu Phe Ser Leu Ala Val Ser Asp Leu Leu Val Leu Leu
85 90 95Leu Gly Met Pro Leu Glu Val Tyr Glu Met Trp Arg Asn Tyr Pro Phe100 105 110Leu Phe Gly Pro Val Gly Cys Tyr Phe Lys Thr Ala Leu Phe Glu Thr115 120 125Val Cys Phe Ala Ser Ile Leu Ser Ile Thr Thr Val Ser Val Glu Arg130 135 140Tyr Val Ala Ile Leu His Pro Phe Arg Ala Lys Leu Gln Ser Thr Arg145 150 155 160Arg Arg Ala Leu Arg Ile Leu Gly Ile Val Trp Gly Phe Ser Val Leu165 170 175Phe Ser Leu Pro Asn Thr Ser Ile His Gly Ile Lys Phe His Tyr Phe180 185 190Pro Asn Gly Ser Leu Val Pro Gly Ser Ala Thr Cys Thr Val Ile Lys195 200 205Pro Met Trp Ile Tyr Asn Phe Ile Ile Gln Val Thr Ser Phe Leu Phe210 215 220Tyr Leu Leu Pro Met Thr Val Ile Ser Val Leu Tyr Tyr Leu Met Ala225 230 235 240Leu Arg Leu Lys Lys Asp Lys Ser Leu Glu Ala Asp Glu Gly Asn Ala245 250 255Asn Ile Gln Arg Pro Cys Arg Lys Ser Val Asn Lys Met Leu Leu Val260 265 270Leu Val Leu Val Phe Ala Ile Cys Trp Ala Pro Phe His Ile Asp Arg275 280 285Leu Phe Phe Ser Phe Val Glu Glu Trp Thr Glu Ser Leu Ala Ala Val290 295 300Phe Asn Leu Val His Val Val Ser Gly Val Leu Phe Tyr Leu Ser Ser305 310 315 320Ala Val Asn Pro Ile Ile Tyr Asn Leu Leu Ser Arg Arg Phe Gln Ala325 330 335Ala Phe Gln Asn Val Ile Ser Ser Phe His Lys Gln Trp His Ser Gln340 345 350His Asp Pro Gln Leu Pro Pro Ala Gln Arg Asn Ile Phe Leu Thr Glu355 360 365Cys His Phe Val Glu Leu Thr Glu Asp Ile Gly Pro Gln Phe Pro Cys370 375 380Gln Ser Ser Val His Asn Ser His Leu Pro Thr Ala Leu Ser Ser Glu385 390 395 400Gln Met Ser Arg Thr Asn Tyr Gln Ser Phe His Phe Asn Lys Thr405 410 415<210>18<211>1245<212>DNA<213>人<400>18atgtcaggga tggaaaaact tcagaatgct tcctggatct accagcagaa actagaagat 60ccattccaga aacacctgaa cagcaccgag gagtatctgg ccttcctctg cggacctcgg 120cgcagccact tcttcctccc cgtgtctgtg gtgtatgtgc caatttttgt ggtgggggtc 180attggcaatg tcctggtgtg cctggtgatt ctgcagcacc aggctatgaa gacgcccacc 240aactactacc tcttcagcct ggcggtctct gacctcctgg tcctgctcct tggaatgccc 300ctggaggtct atgagatgtg gcgcaactac cctttcttgt tcgggcccgt gggctgctac 360ttcaagacgg ccctctttga gaccgtgtgc ttcgcctcca tcctcagcat caccaccgtc 420agcgtggagc gctacgtggc catcctacac ccgttccgcg ccaaactgca gagcacccgg 480cgccgggccc tcaggatcct cggcatcgtc tggggcttct ccgtgctctt ctccctgccc 540aacaccagca tccatggcat caagttccac tacttcccca atgggtccct ggtcccaggt 600tcggccacct gtacggtcat caagcccatg tggatctaca atttcatcat ccaggtcacc 660tccttcctat tctacctcct ccccatgact gtcatcagtg tcctctacta cctcatggca 720ctcagactaa agaaagacaa atctcttgag gcagatgaag ggaatgcaaa tattcaaaga 780ccctgcagaa aatcagtcaa caagatgctg cttgtcttgg tcttagtgtt tgctatctgt 840tgggccccgt tccacattga ccgactcttc ttcagctttg tggaggagtg gactgaatcc 900ctggctgctg tgttcaacct cgtccatgtg gtgtcaggtg tcttattcta cctgagctca 960gctgtcaacc ccattatcta taacctactg tctcgccgct tccaggcagc attccagaat 1020gtgatctctt ctttccacaa acagtggcac tcccagcatg acccacagtt gccacctgcc 1080cagcggaaca tcttcctgac agaatgccac tttgtggagc tgaccgaaga tataggtccc 1140caattcccat gtcagtcatc cgtgcacaac tctcacctcc caacagccct ctctagtgaa 1200cagatgtcaa gaacaaacta tcaaagcttc cactttaaca aaacc 1245<210>19<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>19ctgatgctat cctttcactc tctcagacc 29<210>20<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>20tccttgcagt tttggcacat agatgga 27<210>21<211>395<212>PRT<213>大鼠<400>21Met Gly Lys Leu Glu Asn Ala Ser Trp Ile His Asp Pro Leu Met Lys1 5 10 15Tyr Leu Asn Ser Thr Glu Glu Tyr Leu Ala His Leu Cys Gly Pro Lys20 25 30Arg Ser Asp Leu Ser Leu Pro Val Ser Val Ala Tyr Ala Leu Ile Phe35 40 45Leu Val Gly Val Met Gly Asn Leu Leu Val Cys Met Val Ile Val Arg50 55 60His Gln Thr Leu Lys Thr Pro Thr Asn Tyr Tyr Leu Phe Ser Leu Ala65 70 75 80Val Ser Asp Leu Leu Val Leu Leu Leu Gly Met Pro Leu Glu Ile Tyr85 90 95Glu Met Trp His Asn Tyr Pro Phe Leu Phe Gly Pro Val Gly Cys Tyr100 105 110Phe Lys Thr Ala Leu Phe Glu Thr Val Cys Phe Ala Ser Ile Leu Ser115 120 125Val Thr Thr Val Ser Val Glu Arg Tyr Val Ala Ile Val His Pro Phe130 135 140Arg Ala Lys Leu Glu Ser Thr Arg Arg Arg Ala Leu Arg Ile Leu Ser145 150 155 160Leu Val Trp Ser Phe Ser Val Val Phe Ser Leu Pro Asn Thr Ser Ile165 170 175His Gly Ile Lys Phe Gln His Phe Pro Asn Gly Ser Ser Val Pro Gly180 185 190Ser Ala Thr Cys Thr Val Thr Lys Pro Met Trp Val Tyr Asn Leu Ile195 200 205Ile Gln Ala Thr Ser Phe Leu Phe Tyr Ile Leu Pro Met Thr Leu Ile210 215 220Ser Val Leu Tyr Tyr Leu Met Gly Leu Arg Leu Lys Arg Asp Glu Ser225 230 235 240Leu Glu Ala Asn Lys Val Ala Val Asn Ile His Arg Pro Ser Arg Lys245 250 255Ser Val Thr Lys Met Leu Phe Val Leu Val Leu Val Phe Ala Ile Cys260 265 270Trp Thr Pro Phe His Val Asp Arg Leu Phe Phe Ser Phe Val Glu Glu275 280 285Trp Thr Glu Ser Leu Ala Ala Val Phe Asn Leu Ile His Val Val Ser
290 295 300Gly Val Phe Phe Tyr Leu Ser Ser Ala Val Asn Pro Ile Ile Tyr Asn305 310 315 320Leu Leu Ser Arg Arg Phe Arg Ala Ala Phe Arg Asn Val Val Ser Pro325 330 335Thr Cys Lys Trp Cys His Pro Arg His Gln Pro Gln Gly Pro Pro Ala340 345 350Gln Lys Ile Ile Phe Leu Thr Glu Cys His Leu Met Glu Leu Thr Glu355 360 365Asp Ala Gly Pro Gln Phe Pro Gly Gln Ser Ser Ile His Asn Thr Asn370 375 380Leu Thr Met Ala Pro Cys Ala Gly Glu Val Pro385 390 395<210>22<211>1185<212>DNA<213>大鼠<400>22atgggaaaac ttgaaaatgc ttcctggatc cacgatccac tcatgaagta cttgaacagc 60acagaggagt acttggccca cctgtgtgga cccaagcgca gtgacctatc ccttccggtg 120tctgtggcct atgcgctgat cttcctggtg ggggtaatgg gcaatcttct ggtgtgcatg 180gtgattgtcc gacatcagac tttgaagaca cccaccaact actatctctt cagcttggca 240gtctcagatc tgctggtcct gctcttgggg atgcctctgg aaatctacga gatgtggcac 300aattaccctt tcctgttcgg gcctgtggga tgctacttca agacagccct cttcgagact 360gtgtgctttg cctccattct cagtgtcacc acggttagcg tagagcgcta tgtggccatt 420gtccaccctt tccgagccaa gctggagagc acgcggcgac gggccctcag gatcctcagc 480ctagtctgga gcttctctgt ggtcttttct ttgcccaata ccagcatcca tggcatcaag 540ttccagcact ttcccaacgg gtcctccgta cctggctcag ccacctgcac agtcaccaaa 600cccatgtggg tgtataactt gatcatccaa gctaccagct tcctcttcta catcctccca 660atgaccctca tcagcgtcct ctactacctc atggggctca ggctgaagag agatgaatcc 720cttgaggcga acaaagtggc tgtgaatatt cacagaccct ctagaaagtc agtcaccaag 780atgctgtttg tcttggtcct cgtgtttgcc atctgctgga cccccttcca tgtggaccgg 840ctcttcttca gctttgtgga agagtggaca gagtccctgg ctgctgtgtt caacctcatc 900catgtggtat caggtgtctt cttttatctg agctccgcgg tcaaccccat tatctataac 960ctcctgtctc ggcgcttccg ggcggccttt cgaaatgttg tctcccctac ctgcaaatgg 1020tgccatcccc ggcatcagcc acagggacct ccagcccaga agatcatctt cttgacagaa 1080tgtcacctca tggagctgac agaggatgca ggcccccagt tccctggtca gtcatccatc 1140cacaacacca accttaccat ggccccctgt gcgggagagg tacca 118权利要求
1.一种化合物或其盐的筛选方法，该化合物或其盐能使神经介肽U或其盐，与含有相同或基本相同于SEQ ID NO1或21的氨基酸序列的蛋白质或其盐之间的结合特性发生改变，其特征包括应用神经介肽U或其衍生物或其盐，以及含有与SEQ ID NO1或21所示氨基酸序列相同或基本相同的的序列的蛋白质或其盐。
2.一种用于筛选化合物或其盐的试剂盒，该化合物或其盐能使神经介肽U，与含有相同或基本相同于SEQ ID NO1或21的氨基酸序列的蛋白质或其盐之间的结合特性发生改变，其特征为，该试剂盒包含神经介肽U或其衍生物或其盐，以及含有与SEQ ID NO1或21所示氨基酸序列相同或基本相同的序列的蛋白质或其盐。
3.一种化合物或其盐，其能使神经介肽U或其盐，与含有相同或基本相同于SEQ ID NO1或21的氨基酸序列的蛋白质或其盐之间的结合特性发生改变，所述化合物或其盐可通过使用权利要求1所述筛选方法或权利要求2所述筛选试剂盒获得。
4.一种包含权利要求3所述化合物或其盐的药物组合物。
5.权利要求4所述的药物组合物，其是用于治疗和预防肥胖症、高血压病或紧张性疾病的药物。
6.权利要求1所述的筛选方法或权利要求2所述的筛选试剂盒，其中，所述神经介肽U是含有与SEQ ID NO11所示氨基酸序列相同或基本相同的序列的肽。
7.一种蛋白质或其盐，具有与SEQ ID NO1或21所示氨基酸序列相同或基本相同的序列。
8.一种DNA，其包含编码权利要求7所述蛋白质的DNA。
9.权利要求8所述的DNA，其具有SEQ ID NO2或22所示的碱基序列。
10.一种重组载体，其包含权利要求8所述的DNA。
11.一种转化体，其通过权利要求10所述的重组载体转化而成。
12.一种生产权利要求7所述的蛋白质或其盐的方法，其特征在于，培养权利要求11所述的转化体，使之产生权利要求7所述的蛋白质。
13.一种针对权利要求7所述的蛋白质或其盐的抗体。
全文摘要
本发明提供一种化合物或其盐的筛选方法，所述化合物或其盐能使神经介肽U或其盐和TGR－1或其盐之间的结合特性发生改变，其特征包括应用神经介肽U或其衍生物或其盐和TGR－1或其盐。该方法有利于筛选预防和治疗高血压病、紧张性疾病等的药物等。TGR－1拮抗剂可用作预防和治疗高血压病、紧张性疾病等的药物。
文档编号G01N33/94GK1397019SQ01804336
公开日2003年2月12日 申请日期2001年2月2日 优先权日2000年2月4日
发明者日沼州司, 新谷靖, 细谷昌树, 藤井亮, 守谷岳郎, 松井英起, 大久保尚一 申请人:武田药品工业株式会社