专利名称：将酶标结合物固化在微孔板上的酶免检测试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及临床医学和分子生物学检测技术领域，一种将酶标结合物固化在微孔板上的酶免检测试剂的制作方法现在ELISA试剂的生产方法为在微孔板中预包被抗原或抗体，封闭空位后做成预包被板；将酶标结合物用适当浓度配制成酶标结合物工作液，配以洗液、底物和终止液，组成酶免检测试剂。在检测时，加入待检测样品，然后加入酶标结合物工作液，孵育，使得目标物同包被于微孔板上的抗原或抗体以及酶标结合物形成夹心结合，结合物通过固化在微孔中的抗原或抗体连接在微孔板上，洗去游离的酶标结合物，加入底物后，反应一段时间，加入终止液终止反应，通过底物检测在样品中是否存在目标物。
酶标结合物为生物活性物质，保存于液体中时，通常需要在-20℃保存，才能保证其稳定活性；但现在的试剂通常做成试剂盒的形式，试剂盒中其他组分均为4-8℃贮存，这样，酶标结合物也不得不配制成工作液，保存在4-8℃，以便于运输、销售、保存和应用，所以保证酶标结合物的生物活性是试剂生产技术的最关键问题。现在的方法主要是通过调整缓冲液配方、增加工作液中的蛋白浓度以及添加蛋白稳定剂等，成本高，效果也不是太好，现在酶标结合物的稳定性是制约酶免试剂有效期的最大难题。
另外，在实际的操作过程中，由于各种试剂同时操作，同时检测多种项目，经常造成组分搭配混乱的现象，如甲试剂的酶标结合物加在乙试剂的微孔中，从而得不到实验结果，甚至得到相反的结果，给患者带来不必要的麻烦，有时甚至是灾难性的后果。
还有，作为试剂的生产厂家，酶标结合物占试剂成本中很大一部分，为了方便实际工作的使用，酶标工作液多采用滴瓶式容器，加入时采用从滴液瓶滴加的方式，滴液瓶滴头的大小很难控制，误差在50％左右；这种误差一方面会影响实验的结果，所以，卫生部一再强调不能用滴液瓶式滴加，而倡导用微量加样器，但由于工作量明显加大很多，实际工作中仍然是使用滴液瓶；由于这种误差的存在，试剂生产厂家为了保证酶标结合物的量，不得不给出最大的富裕量，这种浪费在45％以上，结合这种产业，每年的浪费是相当惊人的。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案所述的将酶标结合物固化在微孔板上的酶免检测试剂的制作方法，选择合格的微孔板。以合适的包被缓冲液调整包被抗原或抗体的浓度，配成包被工作液；用包被机或多道微量加液器，以每孔50μl-110μl的工作液量，将包被工作液均一的加入于微孔中，包被吸附足够时间，吸出或甩出包被液。用封闭液封闭空位；以合适的酶标缓冲液调整酶标结合物的浓度，配成酶标结合物工作液，用包被机或多道微量加液器将酶标结合物工作液均一的以每孔50μl的工作液量加入微孔中；采用冷冻真空干燥或烘干的方法，制成固化酶标结合物的检测板待用；配以洗液、底物、终止液，组成ELISA试剂。
由于采用了如上所述技术方案，本发明具有如下优越性传统的ELISA试剂，在微孔板中预包被抗原或抗体，封闭空位后做成预包被板；将酶标结合物用适当浓度配制成酶标结合物工作液，分装在塑料容器中(通常为滴瓶)；配以洗液、底物和终止液；其在操作上，将试剂内容物分别一一对应放置，加入待检标本，再用滴瓶滴加或用加样器加入相应的酶标结合物；孵育后，洗去游离的酶标结合物及待测标本；加入底物反应后终止，通过酶标仪读取结果；本发明由于将酶标结合物固相化，从而从根本上解决了酶标结合物的稳定性问题，使得试剂保存期大大延长；由于酶标结合物已固化在微孔板上，在操作上，简化了操作步骤，避免了不同的检测项目之间由于包被的微孔板与酶标结合物之间的搭配错误而造成的损失；酶标结合物固相化操作可以采用机械化操作，可以保证酶标结合物量的准确，减少滴瓶式滴加的误差，从而保证实验的精密性和准确性，也消除了目前的巨大的浪费；由于固相化酶标结合物，使得反应体积减少一半，这样，在包被抗原或抗体时，包被液也可由原来的50μl-110μl减少至50μl；由于将酶标结合物已固化在微孔中，在试剂组成中就减少了一个组分(酶结合物容器)从而在生产和运输中均比传统的经济实用。
具体实施例本发明的酶免检测试剂，以合适的酶标缓冲液调整酶标结合物的浓度，配成酶标结合物工作液，用包被机或多道微量加液器将酶标结合物工作液均一的以每孔50μl的工作液量加入微孔中；采用冷冻、真空干燥、烘干的方法，制成固化酶标结合物的检测板待用；配以洗液、底物、终止液，使其最大可能的保持酶标结合物的稳定性。
以乙型肝炎表面抗体(Anti-HBs)酶免诊断试剂的制作和使用方法为例说明如下1、材料1.1选用亲和纯化的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)作包被抗原；1.2酶标记乙型肝炎表面抗原(HRPO-HBsAg)；1.3包被缓冲液、封闭缓冲液、酶标稀释液、洗液、底物、终止液；2.步骤2.1首先选择合格的微孔板，以磷酸盐缓冲液(PBS)为包被缓冲液调整包被抗原的浓度，配成包被工作液；2.2用包被机或多道微量加液器，按每孔50μl将包被工作液均一的加入于微孔中，包被吸附足够时间，吸出或甩出包被液；2.3用封闭液封闭空位；2.4以合适的酶标缓冲液调整酶标结合物的浓度，配成酶标结合物工作液；2.5用包被机或多道微量加液器将酶标结合物工作液均一的加入微孔中；2.6采用真空干燥的方法，制成固化酶标结合物的检测板；
2.7搭配以洗液、底物、终止液，组成ELISA试剂；2.8将试剂于2-8℃冰箱中保存；3.使用方法3.1将上述ELISA试剂从2-8℃冰箱中取出，室温平衡；3.2将板条做好标记，安排每孔的加样顺序；3.3每孔50μl加入标准品或样品；3.4将酶标板于震荡器上混匀；3.5将酶标板于37℃恒温箱中孵育；3.6自恒温箱中取出酶标板，甩去反应物，每孔注满洗板液，放置10-15秒，甩去洗板液，每孔注满洗板液，如此洗五遍。或洗板机洗板，五次；3.7将酶标板与干净卫生纸上拍干，加入底物于37℃恒温箱中显色；3.8自恒温箱中取出酶标板，每孔加入50μl终止液终止反应；3.9用酶标仪于波长450nm/630nm判读结果；经试验结果证明新方法制备的乙型肝炎表面抗体(Anti-HBs)酶免诊断试剂同目前的乙型肝炎表面抗体(Anti-HBs)酶免诊断试剂相比较，在灵敏度和特异性方面两者完全吻合，符合试剂的质量标准。
权利要求
1.一种将酶标结合物固化在微孔板上的酶免检测试剂的制作方法，首先选择合格的微孔板，以合适的包被缓冲液调整包被抗原或抗体的浓度，配成包被工作液；用包被机或多道微量加液器，以每孔50μl-110μl的工作液量，将包被工作液均一的加入于微孔中，包被吸附足够时间，吸出或甩出包被液，用封闭液封闭空位，其特征在于所述的酶免检测试剂，以合适的酶标缓冲液调整酶标结合物的浓度，配成酶标结合物工作液，用包被机或多道微量加液器将酶标结合物工作液均一的每孔适量的工作液加入微孔中；采用冷冻、真空干燥、烘干的方法，制成固化酶标结合物的检测板待用；配以洗液、底物、终止液。
2.如权利要求1所述的将酶标结合物固化在微孔板上的酶免检测试剂，以乙型肝炎表面抗体(Anti-HBs)酶免诊断试剂为例，其制作和使用方法如下1、材料1.1选用亲和纯化的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)作包被抗原；1.2酶标记乙型肝炎表面抗原(HRPO-HBsAg)；1.3包被缓冲液、封闭缓冲液、酶标稀释液、洗液、底物、终止液；2.步骤2.1首先选择合格的微孔板，以磷酸盐缓冲液(PBS)为包被缓冲液调整包被抗原的浓度，配成包被工作液；2.2用包被机或多道微量加液器，按每孔50μl将包被工作液均一的加入于微孔中，包被吸附足够时间，吸出或甩出包被液；2.3用封闭液封闭空位；2.4以合适的酶标缓冲液调整酶标结合物的浓度，配成酶标结合物工作液；2.5用包被机或多道微量加液器将酶标结合物工作液均一的加入微孔中；2.6采用真空干燥的方法，制成固化酶标结合物的检测板；2.7搭配以洗液、底物、终止液，组成ELISA试剂；2.8将试剂于2-8℃冰箱中保存；
3.使用方法3.1将上述ELISA试剂从2-8℃冰箱中取出，室温平衡；3.2将板条做好标记，安排每孔的加样顺序3.3每孔50μl加入标准品或样品；3.4将酶标板于震荡器上混匀；3.5将酶标板于37℃恒温箱中孵育；3.6自恒温箱中取出酶标板，甩去反应物，每孔注满洗板液，放置10-15秒，甩去洗板液，每孔注满洗板液，如此洗五遍。或洗板机洗板，五次；3.7将酶标板与干净卫生纸上拍干，加入底物于37℃恒温箱中显色；3.8自恒温箱中取出酶标板，每孔加入50μl终止液终止反应；3.9用酶标仪于波长450nm/630nm判读结果。
全文摘要
一种将酶标结合物固化在微孔板上的酶免检测试剂的制作方法，首先选择合格的微孔板，用包被缓冲液调整包被抗原或抗体的浓度，配成包被工作液；用包被机或多道微量加液器，以每孔50μl－110μl的工作液量，将包被工作液加入于微孔中，包被吸附足够时间，吸出或甩出包被液，用封闭液封闭空位；以合适的酶标缓冲液调整酶标结合物的浓度，配成酶标结合物工作液，用包被机或多冲液调整酶标结合物的浓度，配成酶标结合物工作液，用包被机或多道微量加液器将酶标结合物以每孔适量的工作液均一的加入微孔中；采用冷冻、真空干燥、烘干的方法，制成固化酶标结合物的检测板待用；配以洗液、底物、终止液。
文档编号G01N33/543GK1420357SQ0215526
公开日2003年5月28日 申请日期2002年12月12日 优先权日2002年12月12日
发明者常立峻, 李振勇 申请人:华美生物工程公司