专利名称：还含有α-羟酸或β-二酮的溶液中葡萄糖的检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及可能还含有潜在干扰化合物如α-羟酸或β-二酮的样品中葡萄糖的检测。
2.背景技术包括葡萄糖在内的糖类与苯基硼酸的络合已知已久，且该相互作用的可逆性用作糖的色谱分离的基础。具体而言，在1959年，Lorand和Edwards报道苯基硼酸与许多不饱和多元醇的水缔合的缔合常数；结合相互作用的范围从极弱(例如乙二醇，Kd＝360mM)至中等强度(例如葡萄糖，Kd＝9.1mM)。参见J.Yoon等人，Bioorganic and MedicinalChemistry 1(4)267-71(1993)。据信结合机理是通过葡萄糖上的相邻羟基与硼酸根部分的羟基的结合而发生。
美国专利5,503,770(James等人)描述了一种含有硼酸的荧光化合物，该化合物与糖类，包括葡萄糖结合即发射高强度荧光。该荧光化合物的分子结构包括荧光团，至少一个苯基硼酸部分和至少一个提供氨的氮原子，其中该氮原子位于苯基硼酸部分的邻位，从而与硼酸发生分子内相互作用。因此这种相互作用导致化合物与糖结合即发射荧光。参见T.James等人，J.Am.Chem.Soc.117(35)8982-87(1995)。
此外，使用含蒽基硼酸的化合物检测血糖的荧光传感器在本领域中已知。例如，J.Yoon等人，J.Am.Chem.Soc.1145874-5875(1992)描述蒽基硼酸可以用作糖类结合，包括葡萄糖和果糖结合的信号的荧光化学传感器。
不幸的是，以上述方式与葡萄糖相互作用的化合物还有与其它具有羟基的化合物相互作用的趋势，从而降低了葡萄糖分析的特异性，特别是在分析可能含有干扰量的乳酸盐、乙酰乙酸盐等的生理样品的时候。例如，某些糖尿病患者还产生乳酸酸中毒，其中血液乳酸盐水平高于5mmol/升。因此，非常需要对可能的干扰羟基化合物，如乳酸盐相对不敏感的葡萄糖分析。
发明内容
一方面，本发明涉及一种用于检测可能还含有α-羟酸或β-二酮的样品中葡萄糖的存在或浓度的方法，所述方法包括a)使样品与具有至少两个葡萄糖的识别成分的化合物接触，该识别成分的取向使该化合物与葡萄糖之间的相互作用比该化合物与α-羟酸或β-二酮之间的相互作用更为稳定，所述化合物还含有具有可检测性质的可检测部分，该性质在所述化合物与所述样品中的葡萄糖接触时以浓度依赖性方式变化；和b)测量所述可检测性质的任何变化，以测定所述样品中葡萄糖的存在或浓度，其中α-羟酸或β-二酮的存在基本上不干扰所述测定。
另一方面，本发明涉及具有以下结构的化合物
其中-R1和R2相同或不同，并选自以下i)氢，ii)改变R8部分的pKa和水解稳定性的取代基，iii)可检测部分，或iv)能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分；-R3为氢或能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分；-R4和R5相同或不同，并选自以下i)氢，ii)改变R8部分的pKa和水解稳定性的取代基，iii)可检测部分，或iv)能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分；-每个Z独立地为碳或氮；-R6和R7相同或不同，并且为i)具有0～10个相邻或分枝的碳和/或杂原子的连接基团，或ii)能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分；-R选自以下i)含有1～10个相邻的选自碳、氧、氮、硫和磷的原子的脂肪和/或芳香间隔基，ii)可检测部分，或iii)能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分；-每个R8相同或不同，且是于未保护时能够与葡萄糖中存在的连位二醇基团相互作用的任选地被保护的部分；和
-R9和R10相同或不同，并且是i)氢，ii)可检测部分，iii)以下基团a)能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分，和/或b)包括能够改变该化合物的物理性质的官能团的基团；附带条件是该指示剂化合物含有至少一个与其缔合的可检测部分，所述部分与该指示剂化合物直接缔合或者作为固体载体或聚合物基质的一部分与该化合物缔合。
另一方面，本发明涉及包含上述化合物的检测系统。
图1例示实施例1所述的指示剂的归一化荧光发射(I/I0，在420nm下)。
图2例示实施例2所述的指示剂的归一化荧光发射(I/I0，在428nm下)。
图3例示实施例3所述的指示剂的归一化荧光发射(I/I0，在428nm下)。
图4例示实施例4所述的指示剂的归一化荧光发射(I/I0，在427nm下)。
图5例示实施例5所述的指示剂的归一化荧光发射(I/I0，在540nm下)。
图6例示实施例6所述的指示剂的吸收光谱。
图7～8例示实施例6所述的指示剂的吸光比(450nm/530nm)。
图9例示实施例6所述的指示剂的归一化荧光发射(I/I0，在550nm下)。
图10例示在不存在葡萄糖和存在100mM葡萄糖的情况下，实施例6所述的指示剂的荧光光谱。
图11例示在存在葡萄糖和乳酸盐的情况下，实施例6所述的指示剂的归一化荧光发射(I/I0，在550nm下)。
图12例示实施例10所述的与葡萄糖接触的指示剂的归一化荧光发射(I/I0，在525nm下)。
图13例示实施例10所述的与乳酸盐接触的指示剂的归一化荧光发射(I/I0，在530nm下)发明详述一方面，本发明提供一种检测可能还含有干扰化合物，如α-羟酸或β-二酮的样品中葡萄糖的存在或浓度的方法。这种可能的干扰化合物包括乳酸盐、乙酰乙酸盐，β-羟基丁酸等。
使用能够识别样品中的葡萄糖但对样品中干扰化合物的识别可能性较小的指示剂化合物完成本发明。该指示剂化合物具有至少两个葡萄糖识别成分，该识别成分的取向使该指示剂化合物与葡萄糖之间的相互作用比该指示剂化合物与干扰化合物之间的相互作用更为稳定。
适宜的识别成分包括能够优选与葡萄糖，特别是葡萄糖中存在的二醇基团发生可逆相互作用的部分。已知几种这样的识别成分，优选包括硼酸、硼酸根离子、亚砷酸、亚砷酸根离子、碲酸、碲酸根离子、锗酸、锗酸根离子等。最优选含硼识别成分。可以理解，在使用前可以用保护基封闭识别成分。这些基团是已知的，其包括新戊二醇、频那醇等。在某些实施方案中，在该化合物将要使用的介质中将封闭的识别成分去封闭(参加，例如实施例5)。
优选识别成分在指示剂化合物上彼此间隔适宜的距离以使至少两种识别成分与葡萄糖分子相互作用，导致特异性增大。一般而言，识别成分之间可以具有达约30个原子的间隔基。优选该识别成分的取向使它们在与葡萄糖相互作用时能够相隔大约6_。
本发明的指示剂化合物具有可检测性质，该性质在该化合物与含有葡萄糖的样品接触时以浓度依赖性方式变化。许多这种性质是已知的，并可以用于本发明。例如，该指示剂化合物可以包括发光(荧光或磷光)或化学发光部分、吸光基础部分等等。该指示剂化合物可以包括能量供体部分和能量受体部分，每个部分间隔使该指示剂化合物与葡萄糖相互作用时发生可检测的变化。该指示剂化合物可以包括荧光团和猝灭剂，可以将荧光团和猝灭剂构型为使该荧光团在不存在葡萄糖的情况下被该猝灭剂猝灭。在这种情况下，当存在葡萄糖时，指示剂经历构型变化，该构型变化导致猝灭剂移动离荧光团充分远的距离，从而发射荧光。相反，可以将荧光团和猝灭剂构型为使它们在不存在葡萄糖的情况下充分分离并使荧光团发射荧光；在与葡萄糖相互作用时，荧光团和猝灭剂移动至足够接近以导致猝灭。在我们于2001年1月5日提交的，提为“Detection of Analytes(分析物的检测)”的共同在审申请09/754,219中更为详细地描述了构型变化概念，本文引用该申请作为参考。
或者，该指示剂可以包括能够与识别成分或相对于该识别成分空间放置的另一部分相互作用诸如荧光团的部分，使得荧光团在不存在葡萄糖的情况下发射荧光。在加入葡萄糖时，葡萄糖竞争荧光团和识别成分之间的相互作用，或荧光团和相对于识别成分空间放置的另一部分之间的相互作用，导致荧光减少。实施例6例示了这个概念的一个实例。还将认识到可以选择指示剂，以在不存在葡萄糖的情况下，当荧光团与识别成分或相对于识别成分空间放置的另一部分相互作用时，该荧光团不发射荧光，或者发射相对低水平的荧光。在加入葡萄糖时，葡萄糖竞争荧光团和识别成分之间的相互作用，或荧光团和相对于识别成分空间放置的另一部分之间的相互作用，导致荧光增加。
其它可检测部分包括通过光致电子转移或诱导效应而使葡萄糖相互作用影响其荧光的部分。这些包括在本文引用作为参考的1999年3月11日提交的共同在审美国申请09/265,979(在1999年12月16日公开为PCT国际申请WO 99/46600)中公开的镧系元素螯合物、聚芳烃和它们的衍生物、香豆素、BoDiPy、丹磺酰、儿茶酚等。另一类部分包括在该指示剂化合物与葡萄糖相互作用时其吸收光谱发生变化的部分，包括茜素红等。另一类部分包括其荧光受邻近效应调节的部分，例如能量供体/受体对如丹磺酰/dabsyl等。
优选该可检测性质为可检测的光谱变化，如吸收特征(例如吸光系数和/或光谱移动)、荧光衰减时间(通过时域或频域测定而确定)、荧光强度、荧光各向异性或偏振的变化；发射光谱的光谱移动；时间分辩各向异性衰减的(通过时域或频域测定而确定)变化等。
本发明的指示剂化合物如果是可溶的话，如果需要可以直接用于溶液中。另一方面，如果期望的应用这样要求，该指示剂化合物可以固定(如通过机械夹带或共价或离子结合)到不溶性表面或基质如玻璃、塑料、聚合材料等上或其内部。当在例如另一种聚合物中夹带该指示剂化合物时，该夹带材料优选应该对葡萄糖具有充分的渗透性，以使葡萄糖和该指示剂化合物之间发生适宜的相互作用。
如果该指示剂化合物在水中的溶解不足或不溶，但仍期望进行含水介质中的检测，则该指示剂化合物可以与亲水性单体共聚形成亲水性大分子，如在2000年8月4日提交的共同在审美国申请09/632,624中所述，本文引用该申请的内容作为参考。
优选的指示剂化合物具有以下结构 其中-R1和R2相同或不同，并选自以下i)氢，ii)改变R8部分的pKa和水解稳定性的取代基，iii)可检测部分，或iv)能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分；-R3为氢或能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分；-R4和R5相同或不同，并选自以下i)氢，ii)改变R8部分的pKa和水解稳定性的取代基，iii)可检测部分，或iv)能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分；-每个Z独立地为碳或氮；-R6和R7相同或不同，并且为i)具有0～10个相邻或分枝的碳和/或杂原子的连接基团，或ii)能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分；-R选自以下i)含有1～10个相邻的选自碳、氧、氮、硫和磷的原子的脂肪和/或芳香间隔基，ii)可检测部分，或iii)能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分；-每个R8相同或不同，且是于未保护时能够与葡萄糖中存在的连位二醇基团相互作用的任选地被保护的部分；和-R9和R10相同或不同，并且是i)氢，ii)可检测部分，iii)以下基团a)能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分，和/或b)包括能够改变该化合物的物理性质的官能团的基团；附带条件是该指示剂化合物含有至少一个与其缔合的可检测部分，所述部分与该指示剂化合物直接缔合或者作为固体载体或聚合物基质的一部分与该化合物缔合。
用于改变R8部分的pKa和水解稳定性的适宜的基团对本领域技术人员来说是显而易见的，且包括基团如卤素、硝基、氨基、卤素取代的烷基、任选地取代的羧基、酰基、酮、腈、酰胺、酯、烷氧基等。
任何取代基的适宜的连接基团可以包括约1至约20个相邻原子的基团，所述基团可以是分枝或被取代的，且其可以包括一个或多个杂原子，其终止于能够与聚合物或载体进一步反应或结合的官能团。适宜的连接基团的实例包括烷基、芳基、酰基、聚酰胺、聚醚，及它们的组合，所有这些基团任选地被取代。
R9和R10还可以包括能够改变该化合物的物理性质，如溶解度、pKa等的官能团。例如，这些官能团包括任选地取代的羧化物、氨基、季铵基、磺酸酯、PEG等。
可以理解，当任何取代基是可检测部分时，它还可以包括适宜的连接可检测部分与该指示剂化合物的其余部分的连接基团。适宜的连接基团包括上述的连接基团。适宜的可检测部分包括上述的可检测部分。
R8优选选自硼酸、硼酸根离子、亚砷酸、亚砷酸根离子、碲酸、碲酸根离子、锗酸、锗酸根离子及它们的组合。
还可以由以上定义理解，本发明的化合物和检测系统可以是聚合物形式。因此，完整化合物(含有识别成分和可检测部分)可以与现有聚合物连接，或者单体形式的完整化合物可以聚合或与另一种适宜的单体共聚，形成聚合物。或者，两种单独的单体组分(例如一种含有识别成分，而一种含有可检测部分)可以共聚，从而使所得的聚合物含有所有必需的系统成分(参见实施例6)。
本发明的指示剂化合物有多种用途，包括用作能源、医学和农业领域的指示剂。例如，该指示剂化合物可以用于检测生理缓冲液或液体如血液、血浆、血清、间隙液、脑脊髓液、尿液、唾液、眼内液、淋巴液、泪液或汗液中的亚水平或超水平的葡萄糖，从而提供用于诊断或监测诸如糖尿病和肾上腺功能不全的疾病的有价值的信息。
用于人治疗应用的葡萄糖的医学/药物生产需要监测和控制。
本发明在农业中的用途包括检测大豆和其它农产品中葡萄糖的水平。对于高价值产品如葡萄酒葡萄而言，在重要的收割决定中必须小心地监测葡萄糖。由于葡萄糖是发酵方法中最昂贵的碳原和原料，用于最佳反应器进料速度控制的葡萄糖监测在动力醇生产中是重要的。反应器混合和控制葡萄糖浓度对软饮料和发酵饮料的生产过程中的质量控制也是重要的，所述生产在国际上消耗最大量的葡萄糖和可发酵的(连位二醇)糖。
当该指示剂化合物引入荧光指示剂取代基时，各种检测技术在本领域中也是已知的。例如，本发明的化合物可以用于荧光传感装置(例如美国专利5,517,313)或者可以与聚合物材料如试纸结合用于目测。例如，后一技术允许类似于用石蕊试纸条测定pH的方式测定葡萄糖。本文所述的化合物还可以作为简单的试剂与标准台式(benchtop)分析装置如由Shimadzu、Hitachi、Jasco、Beckman等制造的分光荧光光度计或临床分析仪一起使用。这些分子还提供用于由Ocean Optics(Dunedin，Florida)或Oriel Optics制造的基于光纤的传感器和分析荧光计的分析物特异性化学/光学信号转导。
美国专利5,517,313，其内容被本文引用作为参考，描述了一种荧光传感装置，其中本发明的化合物可以用于测定液体介质中葡萄糖的存在或浓度。该传感装置包括含荧光指示剂分子的基质(下文称为“荧光基质”)，高通透的滤光器和光检测器的分层排列。在此装置中，光源，优选为发光二极管(“LED”)，至少部分位于该指示剂材料内或该指示剂基质所处的波导管内，从而使来自光源的入射光导致该指示剂分子发荧光。高通透滤光器允许发射的光到达光检测器，同时滤掉来自光源的散射入射光。在美国专利5,517,313所述的装置中采用的指示剂分子的荧光由局部存在的葡萄糖调节，例如削弱或增强。
在美国专利5,517,313所述的传感器中，含有指示剂分子的材料对分析物而言是可渗透的。因此，分析物可以从周围试验介质中扩散到该材料中，从而影响由指示剂化合物发射的荧光。光源、含指示剂化合物的材料、高通透滤光器和光检测器的结构使至少一部分由指示剂化合物发射的荧光影响光检测器，产生代表周围介质中葡萄糖浓度的电信号。
根据使用本发明的指示剂化合物的其它可能的实施方案，传感器还在美国专利5,910,661、5,917,605和5,894,351中描述，本文引用这些文献作为参考。
本发明的化合物还可以用于可植入的装置，例如用于连续体内监测血糖水平。例如，适宜的装置在于1999年8月26日提交的共同在审美国专利申请09/383,148和美国专利5,833,603、6,002,954和6,011,984中描述，本文引用这些文献作为参考。
本发明的化合物可以由本领域技术人员在不用进行过度量实验的情况下，使用已知的反应机理和试剂，例如包括与下述的一般过程一致的反应机理制备。
实施例1蒽衍生物和MAPTAC的水溶性共聚物I.在水溶性聚合物中共聚的单硼酸盐-蒽指示剂的合成A.9-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙胺基]甲基蒽0℃下，在20分钟内，向在250mL CHCl3中的N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐(11.82g，66.0mmol，3.0当量)和DBMP(10mg，作为抑制剂)的悬浮液中滴加DIEA(18.5g，25.0mL，144mmol，6.5当量)。将混合物暖至25℃，然后再冷却至0℃。在1小时内，向该冷却的混合物中滴加在CHCl3(100mL)中的9-氯甲基蒽(5.0g，22mmol)的溶液。然后在25℃下将混合物搅拌1小时，在50℃下搅拌12小时，然后在70℃下搅拌2小时。此时，用4×60mL部分水洗涤该混合物，用CH2Cl2萃取合并的水层。用无水Na2SO4干燥合并的有机萃取物，倾析并真空浓缩。用硅胶色谱法(闪蒸硅胶，2～5％CH3OH/CH2Cl2)纯化粗产物，得到2.44g(33％)固体产物。
TLCMerck硅胶60板，Rf0.39，使用90/10 CH2Cl2/CH3OH，用UV(254/366)，茚三酮染色观察。
B.9-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷(borinan)-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙胺基]甲基蒽在0℃下，在10分钟内，向在200mL CHCl3中的9-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙胺基]-甲基蒽(2.44g，7.34mmol)和DBMP(10mg，作为抑制剂)的溶液中分批加入DIEA(2.85g，3.84mL，22.0mmol，3.0当量)，然后在30分钟内滴加(2-溴甲基苯基)硼酸新戊酯(2.49g，8.81mmol，1.2当量)的溶液。随后在25℃下将该混合物搅拌20小时。此时，用水洗涤该混合物，并用CH2Cl2萃取合并的水层。用无水Na2SO4干燥合并的有机萃取物，倾析并真空浓缩。用硅胶色谱法(闪蒸硅胶，2～5％CH3OH/CH2Cl2)纯化粗产物，得到2.50g(76％)浅黄色结晶固体。
Mp72～73℃。
TLCMerck硅胶60板，Rf0.36，使用90/10 CH2Cl2/CH3OH，用UV(254/366)，茚三酮染色观察。
C.9-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙胺基]甲基蒽和MAPTAC(1∶20摩尔比)的水溶性共聚物向在1.5mL乙二醇中的9-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙胺基]甲基蒽(0.0490g，0.105mmol)和[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基]三甲基氯化铵(MAPTAC，50wt％水溶液，0.48g，0.90mL，2.1mmol，20当量)的溶液中加入4，4′-偶氮双(氰基戊酸)(0.008g，0.03mmol，1.4摩尔％总单体)。用氩气将溶液净化5分钟，然后于暗处加热到60℃，持续18小时。此时，将粘性溶液冷却至25℃，用5mL水稀释，并通过醋酸纤维素膜(MWCO 3500)对3×4L水进行透析。将透析物浓缩至干，得到0.339g(68％)黄色玻璃状固体。
II.用葡萄糖和乳酸盐调节荧光测定葡萄糖和乳酸盐对此实施例中制备的共聚物(它含有单一识别成分)的荧光的调节。图1显示在含有a)0～20mM葡萄糖；b)0～20mM乳酸盐的PBS中的0.5mg/mL共聚物(1∶20摩尔比)的溶液的归一化荧光发射(I/I0，420nm)。用Shimadzu RF-5301分光荧光光度计记录光谱，其中在365nm激发，激发狭缝为1.5nm，发射狭缝为5nm，室温。误差棒为每个数据点的两个平行值的标准偏差。该共聚物的荧光受葡萄和乳酸盐存在的影响。
实施例2通过葡萄糖和可能的生理性干扰物调节与水溶性聚合物共价连接的双硼酸盐指示剂I.双硼酸盐蒽指示剂的单甲基丙烯酸酯单体的合成 A.9，10-双[[2-(2-羟基乙氧基)乙胺基]甲基]蒽在23℃下，向在40mL CHCl3中的2-(2-氨基乙氧基)乙醇(31.4g，30.0mL，299mmol，20.9当量)的溶液中加入9，10-双(氯甲基)蒽(3.94g，14.3mmol)。将溶液于暗处搅拌67小时。此时，加入100mL CH2Cl2，并用1×50mL和2×100mL部分NaHCO3(饱和水溶液)洗涤。用无水Na2SO4干燥有机萃取物，过滤并浓缩，得到4.67g(79％)黄色粉末。产物(RP-HPLC纯度为～85％)不进一步处理而使用。
HPLC条件HP 1100 HPLC色谱，Vydac 201TP 10×250mm柱，0.100mL注射，2mL/min，370nm检测，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B 2分钟，18分钟内10～80％B，2分钟内80～100％B，100％B 2分钟，保留时间15.6分钟。
B.9，10-双[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-羟基乙氧基)乙胺基]甲基]蒽将23℃的在125mL CHCl3中的9，10-双[[2-(2-羟基乙氧基)乙胺基]甲基]蒽(4.02g，9.75mmol)、DIEA(12.6g，17.0mL，97.5mmol，10.0当量)和(2-溴甲基苯基)硼酸新戊酯(13.7g，48mmol，4.9当量)的溶液于暗处搅拌46小时。此时，首先通过旋转蒸发浓缩反应混合物，然后用真空泵除去DIEA。用氧化铝柱色谱法(150g活化的中性氧化铝，0～3％CH3OH/CH2Cl2)纯化残余物，得到5.67g(70％)粘性油，此油在静置时固化。产物(RP-HPLC纯度为～85％)不经进一步纯化而使用。
TLCMerck碱性氧化铝板，Rf0.33，用95/5 CH2Cl2/CH3OH，用UV(254/366)观察。
HPLC条件HP 1100 HPLC色谱，Vydac 201TP 10×250mm柱，0.100mL注射，2mL/min，370nm检测，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B 2分钟，18分钟内10～80％B，2分钟内80～100％B，100％B 2分钟，保留时间18.8分钟。
C.9-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧乙氧基)乙胺基]甲基]-10-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-羟基乙氧基)乙胺基]甲基]蒽(单甲基丙烯酸酯单体)将23℃的在15mL CH2Cl2中的9，10-双[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-羟基乙氧基)乙胺基]甲基]蒽(0.298g，0.359mmol)、甲基丙烯酸(0.304g，0.300mL，3.53mmol，9.84当量)、DCC(0.965g，4.68mmol，13.0当量)和N，N-二甲基氨基吡啶(0.020g，0.16mmol，0.46当量)的溶液于暗处搅拌4小时。此时，将反应混合物过滤并通过旋转蒸发浓缩。用氧化铝柱色谱法(50g活化的中性氧化铝，0～4％CH3OH/CH2Cl2)纯化残余物，得到0.150g(47％)黄色固体。
FAB MSC52H66B2N2O9计算值[M]+885；实测值[M+1]+886。
TLCMerck碱性氧化铝板，Rf0.45，用95/5 CH2Cl2/CH3OH，用UV(254/366)观察。
HPLCHP 1100 HPLC色谱，Vydac 201TP 10×250mm柱，0.100mL注射，2mL/min，370nm检测，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B 2分钟，18分钟内10～80％B，2分钟内80～100％B，100％B 2分钟，保留时间21分钟。
D.9-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧乙氧基)乙胺基]甲基]-10-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-羟基乙氧基)乙胺基]甲基]蒽和TMAMA(1∶50摩尔比)的水溶性共聚物向在0.600mL水中的[2-(甲基丙烯氧基)乙基]三甲基氯化铵(TMAMA，70wt％水溶液，0.344g单体，1.66mmol，50当量)的溶液中加入在3.00mL MeOH中的9-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧乙氧基)乙胺基]甲基]-10-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-羟基乙氧基)乙胺基]甲基]蒽(0.0024g，0.0033mmol)的溶液。向此混合物加入4，4′-偶氮双(4-氰基戊酸)(0.0075g，0.027mmol，1.6摩尔％总单体)。用0.45μ膜滤器过滤该溶液，用氮气净化，然后于暗处在55℃下加热16小时。此时，将粘性溶液冷却至25℃并真空浓缩。用20mL水稀释残余物，并用0.2μ膜滤器过滤。将聚合物溶液通过醋酸纤维素膜(MWCO 3500)对2×4L水透析。由透析得到38.5mL聚合物溶液。将此溶液的一部分浓缩至干，表明0.0075g聚合物/1.0mL溶液。总共得到0.289g(77％)聚合物。
II.用葡萄糖、乳酸盐和乙酰乙酸盐调节荧光测定葡萄糖、乳酸盐和乙酰乙酸盐对此实施例中制备的共聚物(它含有两种识别成分)的荧光的调节。图2显示在含有a)0～20mM葡萄糖；b)0～20mM乳酸盐；c)0～20mM乙酰乙酸锂的PBS中的1.5mg/mL蒽双硼酸盐-TMAMA(1∶50摩尔比)共聚物的溶液的归一化荧光发射(I/I0，428nm)。用Shimadzu RF-5301分光荧光光度计记录光谱，其中在365nm激发，激发狭缝为1.5nm，发射狭缝为1.5nm，室温。共聚物的荧光受葡萄糖的存在影响，但不受乳酸盐或乙酰乙酸盐的存在影响。
实施例3溶液中的乳酸盐对葡萄糖对双硼酸盐蒽指示剂的荧光的剂量反应影响的影响 A.9，10-双[[2-(叔丁氧羰基)乙胺基]甲基]蒽将23℃的在75mL CHCl3中的β-丙胺酸叔丁酯盐酸盐(3.06g，16.8mmol，5.09当量)、DIEA(4.27g，5.75mL，33.0mmol，10.00当量)和9，10-双(氯甲基)蒽(0.910g，3.31mmol)的溶液于暗处搅拌93小时。此时，过滤溶液，并用1×40mL和2×60mL部分的NaHCO3(饱和水溶液)洗涤。用无水Na2SO4干燥有机萃取物，过滤并浓缩，得到粗黄色固体。用硅胶柱色谱法(30g重力级凝胶，0～3％CH3OH/CH2Cl2)纯化残余物，得到1.06g(65％)粘性黄-橙色产物。产物不经进一步纯化而使用。
TLCMerck硅胶60板，Rf0.33，用95/5 CH2Cl2/CH3OH，用UV(254/366)观察。
B.9，10-双[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(叔丁氧羰基)乙胺基]甲基]蒽将23℃的在30mL CHCl3中的9，10-双[[2-(叔丁氧羰基)乙胺基]甲基]蒽(1.60g，3.25mmol)、DIEA(4.45g，6.00mL，34.4mmol，10.6当量)和(2-溴甲基苯基)硼酸新戊酯(4.80g，17.0mmol，5.22当量)的溶液于暗处搅拌4.5天。此时，将45mL CHCl3加入该混合物中，并用2×25mL部分NaHCO3(饱和水溶液)洗涤该混合物。用无水Na2SO4干燥有机萃取物，过滤并浓缩，得到粗微红色油。用氧化铝柱色谱法(100g活化的中性氧化铝，0～3％CH3OH/CH2Cl2)纯化残余物，得到～3.5g橙色固体。将产物溶解，然后形成白色沉淀(DIEA-HBr盐)。过滤溶液，并浓缩滤液，得到2.72g(93％)橙色固体。产物(RP-HPLC纯度为＞80％)不经进一步纯化而使用。
TLCMerck碱性氧化铝板，Rf0.66，使用95/5 CH2Cl2/CH3OH，用UV(254/366)观察。
HPLC条件HP 1100 HPLC色谱，Vydac 201TP 10×250mm柱，0.100mL注射，2mL/min，370nm检测，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B 2分钟，18分钟内10～80％B，2分钟内80～100％B，100％B 2分钟，保留时间23.9分钟。
C.9，10-双[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[3-(丙酰基)氨基]甲基]蒽将23℃的在5mL 20％TFA/CH2Cl2中的9，10-双[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(叔丁氧羰基)乙胺基]甲基]蒽(0.556g，0.620mmol)的溶液于暗处搅拌25小时。此时，在N2气流下浓缩该反应混合物。用3×10mL部分乙醚研磨残余物。真空干燥残余的固体，得到0.351g(87％)绒毛状黄色粉末。
FAB MS甘油基质；C42H46B2N2O10(双甘油加合物)计算值[M]+760；实测值[M]+760。
HPLCHP 1100 HPLC色谱，Waters 5×100mm NovaPak HR C18柱，0.025mL注射，0.75mL/min，1.5mL注射环，360nm检测，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B 2分钟，18分钟内10～80％B，2分钟内80～100％B，100％B 2分钟，保留时间16.7分钟。
D.用葡萄糖和乳酸盐调节荧光测定葡萄糖和乳酸盐对此实施例中制备的指示剂化合物(它含有两种识别成分)的荧光的调节。图3显示在含有a)0～10mM葡萄糖、0mM乳酸盐；b)0～10mM葡萄糖、2mM乳酸盐；c)0～10mM葡萄糖、5mM乳酸盐的PBS中的75μM双羧酸酯双硼酸盐蒽指示剂的溶液的荧光(428nm下)。用Shimadzu RF-5301分光荧光光度计记录光谱，其中在365nm激发，激发狭缝为1.5nm，发射狭缝为1.5nm，室温。所有点平行三份测量，包括±1SD误差棒。乳酸盐的存在基本上不影响葡萄糖对指示剂的荧光调节。
实施例4当指示剂共价固定在水凝胶中时，双硼酸盐葡萄糖指示剂对葡萄糖和乳酸盐与乙酰乙酸盐的选择性I.双甲基丙烯酰胺单体的制备 A.9，10-双[3-(甲基丙烯酰胺基)丙胺基]甲基蒽在40℃下，将23℃的在200mL CHCl3中的9，10-双(氯甲基)蒽(1.5g，5.45mmol)、DIEA(28.17g，38.00mL，218mmol，40当量)、N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐(9.76g，54.5mmol，10.0当量)和～5mgBHT的悬浮液于暗处搅拌4天。此时，将温度升高至4.5℃，并将混合物再搅拌3天。此时，已形成沉淀。过滤混合物，并将固体产物溶解在最小量的CH2Cl2。过夜形成黄色结晶固体，目的产物的双盐酸盐(3.15g，定量)。
TLCMerck碱性氧化铝板，Rf0.31，用90/10 CH2Cl2/CH3OH，用UV(254/366)观察。
HPLCHP 1100 HPLC色谱，Waters 5×100mm NovaPak HR C18柱，0.100mL注射，0.75mL/min，360nm检测，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B 2分钟，18分钟内10～80％B，2分钟内80～100％B，100％B 2分钟，保留时间15.0分钟。
B.9，10-双[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙胺基]甲基蒽(双甲基丙烯酰胺单体)将23℃的在20mL CHCl3中的9，10-双[3-(甲基丙烯酰胺基)丙胺基]甲基蒽(0.0.650g，1.34mmol游离胺)、DIEA(0.612g，0.825mL，4.74mmol，3.55当量)、(2-溴甲基苯基)硼酸新戊酯(1.34g，4.74mmol，3.55当量)和BHT(5mg，作为抑制剂)的溶液于暗处搅拌5天。此时，真空浓缩反应混合物，并用氧化铝色谱法(200g活化的中性氧化铝，0～2％CH3OH/CH2Cl2)纯化残余物，得到0.465g(39％)非常粘的黄色油。
TLCMerck碱性氧化铝板，Rf0.59，用90/10 CH2Cl2/CH3OH，用UV(254/366)观察。
HPLCHP 1100 HPLC色谱，Waters 5×100mm NovaPak HR C18柱，0.050mL注射，0.75mL/min，360nm检测，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B 2分钟，18分钟内10～80％B，2分钟内80～100％B，100％B 2分钟，保留时间16.9分钟。
C.具有葡萄糖指示剂的N，N-二甲基丙烯酰胺水凝胶的制备制备在乙二醇中的N，N-二甲基丙烯酰胺(40％wt.)和N，N’-亚甲基双丙烯酰胺(0.8％wt.)的溶液。将9，10-双[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙胺基]甲基蒽(17.8mg，2×10-5mol)和40μL过硫酸铵水溶液(5％wt)与1mL乙二醇单体溶液合并。将所得的溶液置于用氮净化的手套箱内。将N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(80μL，5％wt.)的水溶液加入单体配方中以加速聚合。将所得的配方倾入由显微镜载玻片和100微米不锈钢间隔物构成的模中。在氮气氛下保持8小时后，将模置于磷酸盐缓冲盐水(PBS)(10mM PBS，pH＝7.4)中，分离显微镜载玻片，并移出水凝胶。用100mL含有1mM月桂基硫酸钠盐和1mM EDTA钠盐的PBS将水凝胶洗涤3天，溶液每天发生变化，然后用DMF/PBS(10/90体积，3×100mL)洗涤，最后用PBS(pH＝7.4，3×100mL)洗涤。将所得的水凝胶聚合物贮存在含有0.2％wt叠氮化钠和1mM EDTA钠盐的PBS(10mM PBS，pH＝7.4)中。
II.用葡萄糖、乳酸盐和乙酰乙酸盐调节荧光测定葡萄糖、乳酸盐和乙酰乙酸盐对此实施例中制备的指示剂化合物(它含有两种识别成分)的荧光的调节。图4显示在10mM pH7.4的PBS中的含有此实施例的葡萄糖识别分子的水凝胶的归一化荧光发射(I/I0，427nm)，所述PBS含有0.2％NaN3和1mM EDTA，并含有不同量的L-乳酸钠、乙酰乙酸锂或α-D-葡萄糖。在37℃和低灵敏度下，使用温控样品固定器，用Shimadzu RF-5301分光荧光光度计记录数据，其中在365nm激发(狭缝＝3nm)，在427nm发射(狭缝＝3nm)。测量前，在37℃下将含有3mL目的溶液的比色皿平衡15分钟。每份水凝胶样品以平行四份样品进行测量。误差棒为每个数据点的四个值的标准偏差。如前所述制备含有葡萄糖识别分子的水凝胶。将水凝胶装到玻璃载玻片上，并用在入射光45°处的PMMA比色皿中的聚酯筛覆盖。在含有0.2％NaN3和1mM EDTA的10mM pH7.4的PBS中制备1、5、10和20mM L-乳酸钠[Aldrich]，5、10和20mM乙酰乙酸锂[Aldrich]，和1、2、4、5、10和20mMα-D-葡萄糖的溶液。共聚物的荧光受葡萄糖的存在影响，但不受乳酸盐或乙酰乙酸盐影响。
实施例5用双硼酸盐识别和相邻邻近猝灭终号产生而导致的葡萄糖对乳酸盐的选择性A.N-(2，2-二乙氧基乙基)-4-溴-1，8-萘二甲酰亚胺在45℃下，将在45mL EtOH中的4-溴-1，8-萘二甲酸酐(10.0g，36.1mmol)和氨基乙醛二乙缩醛(4.81g，5.26mL，36.1mmol，1当量)的悬浮液搅拌3天。此时，过滤所得的悬浮液，用EtOH洗涤，并干燥残余物，得到13.3g(94％)浅褐色固体产物。
TLCMerck硅胶60板板，Rf0.17，用98/2 CH2Cl2/CH3OH，用UV(254/366)观察。
HPLCHP 1100 HPLC色谱，Waters 5×100mm NovaPak HR C18柱，0.050mL注射，0.75mL/min，1.5mL注射环，360nm检测，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B 2分钟，18分钟内10～80％B，2分钟内80～100％B，100％B 2分钟，保留时间24.2分钟。
B.N-(2，2-二乙氧基乙基)-4-丁胺基-1，8-萘二甲酰亚胺在45℃下，将在8mL NMP中的N-(2，2-二乙氧基乙基)-4-溴-1，8-萘二甲酰亚胺(0.797g，2.03mmol)和正丁胺(1.48g，2.00mL，20.2mmol，9.96当量)的溶液加热66小时。此时，将所得的悬浮液冷却至25℃，然后过滤。用50mL乙醚溶解残余物，并用3×50mL水萃取。用无水Na2SO4干燥有机萃取物，过滤并浓缩，得到粗黄色粉末。用硅胶色谱法(25g重力级凝胶，0～1％CH3OH/CH2Cl2)纯化粗产物，得到0.639g(82％)黄色粉末。
TLCMerck硅胶60板，Rf0.71，用95/5 CH2Cl2/CH3OH，用UV(254/366)观察。
HPLCHP 1100 HPLC色谱，Waters 5×100mm NovaPak HR C18柱，0.050mL注射，0.75mL/min，1.5mL注射环，450nm检测，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B 2分钟，18分钟内10～80％B，2分钟内80～100％B，100％B 2分钟，保留时间23.5分钟。
C.N-(2-氧乙基)-4-丁胺基-1，8-萘二甲酰亚胺在25℃下，将在25mL丙酮中的N-(2，2-二乙氧基乙基)-4-丁胺基-1，8-萘二甲酰亚胺(0.622g，1.62mmol)和对甲苯磺酸一水合物(0.010g，0.053mmol，0.032当量)的溶液搅拌18小时。此时，浓缩溶液，并用硅胶色谱法(25g重力级凝胶，0～1％CH3OH/CH2Cl2)纯化残余物，得到0.470g(94％)橙色固体。
TLCMerck硅胶60板，Rf0.61，用95/5 CH2Cl2/CH3OH，用UV(254/366)观察。
1H NMR(400MHZ，CDCl3)δ1.03(t，3H，J＝7.3Hz)，1.53(m，2H)，1.78(m，2H)，3.38(t，2H，J＝7.2Hz)，5.02(s，2H)，6.64(d，1H，J＝8.6Hz)，7.52(dd，1H，J＝7.4，8.3Hz)，8.08(dd，1H，J＝1Hz，8.5Hz)，8.38(d，1H，J＝8.3Hz)，8.46(dd，1H，J＝1.0，7.3Hz)，9.75(s，1H)。
HPLCHP 1100 HPLC色谱，Waters 5×100mm NovaPak HR C18柱，0.050mL注射，0.75mL/min，1.5mL注射环，450nm检测，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B 2分钟，18分钟内10～80％B，2分钟内80～100％B，100％B 2分钟，保留时间19.6分钟。
D.N-(4-二甲基氨基苄基)-1，6-二氨基己烷在25℃和氮气氛下，将在20mL无水EtOH中的4-二甲基氨基苯甲醛(1.00g，6.70mmol)、Na2SO4(6.70g，47.2mmol，7.04当量)和1，6-二氨基己烷(3.89g，33.5mmol，5.00当量)的悬浮液于暗处搅拌18小时。此时，过滤溶液，并将NaBH4(1.73g，45.8mmol，6.84当量)加入滤液中。在25℃下将悬浮液搅拌5小时。此时，浓缩反应混合物，将残余物溶解在50mL水中，并用3×50mL乙醚萃取。用2×50mL水洗涤合并的有机萃取物。用2×50mL乙醚萃取合并的水萃取物。用Na2SO4干燥合并的有机萃取物，过滤并浓缩，得到1.35g(81％)粘性油。
TLCMerck硅胶60板，Rf0.58，用80/15/5 CH2Cl2/CH3OH/iPrNH2，用茚三酮染色、UV(254/366)观察。
HPLCHP 1100 HPLC色谱，Waters 5×100mm NovaPak HR C18柱，0.050mL注射，0.75mL/min，1.5mL注射环，280nm检测，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B 2分钟，18分钟内10～80％B，2分钟内80～100％B，100％B 2分钟，保留时间13.3分钟。
E.N-2-[5-(N-4-二甲基氨基苄基)氨基己基]氨基乙基)-4-丁胺基-1，8-萘二甲酰亚胺向在25mL无水MeOH中的N-(2-氧乙基)-4-丁胺基-1，8-萘二甲酰亚胺(0.346g，1.11mmol)的悬浮液中加入在20mL无水MeOH中的N-(4-二甲基氨基苄基)-1，6-二氨基己烷(0.554g，2.22mmol，2.00当量)和乙酸(0.067g，1.1mmol，1.0当量)的溶液。向此混合物中加入在5mL无水MeOH中的NaCNBH3(0.070g，1.1mmol，1.0当量)的溶液。将反应混合物在25℃下搅拌15小时。此时，通过旋转蒸发除去MeOH，并将残余物溶解在30mL水中。用1N HCl将溶液调节至pH2，然后在25℃下搅拌1小时。此时，用1N NaOH将溶液调节至pH12，然后用3×50mL CH2Cl2萃取。用3×50mL水洗涤合并的有机萃取物，用无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩，得到粗褐色油。用硅胶色谱法(35g闪蒸级凝胶，0～50％CH3OH/CH2Cl2，然后45/50/5CH3OH/CH2Cl2/iPrNH2)纯化粗产物，得到0.190g(32％)二胺产物。
FAB MSC33H45N5O2计算值[M]+544；实测值[M]+544。
TLCMerck硅胶60板，Rf0.42，用80/20 CH2Cl2/CH3OH，用茚三酮染色和UV(254/366)观察。
HPLCHP 1100 HPLC色谱，Waters 5×100mm NovaPak HR C18柱，0.050mL注射，0.75mL/min，1.5mL注射环，450nm检测，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B 2分钟，18分钟内10～80％B，2分钟内80～100％B，100％B 2分钟，保留时间17.6分钟。
F.N-2-[5-(N-4-二甲基氨基苄基)-5-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]氨基己基]-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]氨基乙基-4-丁胺基-1，8-萘二甲酰亚胺向在5mL CHCl3中的N-2-[5-(N-4-二甲基氨基苄基)氨基己基]氨基乙基)-4-丁胺基-1，8-萘二甲酰亚胺(0.150g，0.276mmol)和DIEA(0.355g，0.478mL，2.81mmol，10.0当量)的溶液中加入在2mL CHCl3中的(2-溴甲基苯基)硼酸新戊酯(0.390g，1.38mmol，5.00当量)的溶液。然后在25℃下将溶液搅拌27小时。此时，浓缩混合物，并用氧化铝柱色谱法(100g活化的中性氧化铝，0～5％CH3OH/CH2Cl2)纯化残余物，得到0.024g(19％)粘性褐色油。
FAB MS(甘油基质)C53H67B2N5O8计算值[M]+924(双甘油加合物代替硼酸的双新戊酯)；实测值[M]+924。
TLCMerck中性氧化铝板，Rf0.62，用80/20 CH2Cl2/CH3OH，用UV(254/366)观察。
HPLCHP 1100 HPLC色谱，Waters 5×100mm NovaPak HR C18柱，0.050mL注射，0.75mL/min，1.5mL注射环，450nm检测，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B 2分钟，18分钟内10～80％B，2分钟内80～100％B，100％B 2分钟，保留时间20.7分钟。
G.N-2-[5-(N-4-二甲基氨基苄基)-5-[2-(二羟硼基)苄基]氨基己基]-[2-(二羟硼基)苄基]氨基乙基-4-丁胺基-1，8-萘二甲酰亚胺(nBuF-hexa-Q双硼酸盐)用于葡萄糖研究的游离双硼酸产物是将N-2-[5-(N-4-二甲基氨基苄基)-5-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]氨基己基]-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]氨基乙基-4-丁胺基-1，8-萘二甲酰亚胺溶解在MeOH/PBS缓冲系统中而得到的。
H.用葡萄糖和乳酸盐调节荧光测定葡萄糖和乳酸盐对此实施例中制备的指示剂化合物(它含有两种识别成分)的荧光的调节。图5显示在含有a)0～20mM葡萄糖；b)0～20mM乳酸盐的70/30 MeOH/PBS中的0.015mM的指示剂化合物溶液的归一化荧光发射(I/I0，535nm)。用Shimadzu RF-5301分光荧光光度计记录光谱，其中在450nm激发；激发狭缝为1.5nm；发射狭缝为1.5nm；室温。误差棒为每个数据点的三个平行值的标准偏差。指示剂的荧光受葡萄糖存在影响，但基本上不受乳酸盐存在影响。
实施例6葡萄糖或乳酸盐对含有N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基]-3，4-二羟基-9，10-二氧-2-蒽磺酰胺(茜素红S单体)和α，α′-双[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙胺基]-1，4-二甲苯(双硼酸单体)的丙烯酰胺凝胶的作用A.3，4-二羟基-9，10-二氧-2-蒽磺酰氯将3，4-二羟基-9，10-二氧-2-蒽磺酸钠盐(1.4g，3.9mmol)与30mL氯磺酸合并，并加热至90℃，持续5小时，然后将溶液冷却至0℃，并将其倾入100g冰中。在冰熔解后，用CH2Cl2(3×100mL)萃取溶液，合并二氯甲烷萃取物，用Na2SO4干燥并蒸发，产生0.87g固体(收率66％).
B.N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基]-3，4-二羟基-9，10-二氧-2-蒽磺酰胺将3，4-二羟基-9，10-二氧-2-蒽磺酰氯(96mg，0.28mmol)和N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐(108mg，0.6mmol)与20mL CH2Cl2合并。向此悬浮液加入Et3N(303mg，3mmol)。室温下将混合物搅拌24小时，过滤，并蒸发溶剂。将所得固体进行SiO2(10g)柱色谱处理，用CH2Cl2/MeOH(90/10)作为洗脱剂。所得产物为红色固体(80mg，64％收率)。
FAB MSC21H20N2O7S计算值M+445；实测值M+445。
HPLCHP 1100 HPLC色谱，Waters 5×100mm NovaPak HR C18柱，0.100mL注射，0.75mL/min，2mL注射环，370nm检测，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B 2分钟，18分钟内10～80％B，2分钟内80～100％B，100％B 2分钟，保留时间17.67分钟。
C.α，α′-双[3-(甲基丙烯酰胺基)丙胺基]-1，4-二甲苯在25℃下将在75mL无水MeOH中的N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐(3.00g，16.8mmol，2.21当量)、DIEA(6.5g，8.8mL，50mmol，6.6当量)、对苯二甲醛(1.02g，7.60mmol)和Na2SO4(10.7g，75.3mmol，9.91当量)的溶液于暗处搅拌18小时。此时，再加入Na2SO4(10.7g，75.3mmol，9.91当量)，并再持续搅拌6小时。此时，过滤溶液，并将NaBH4(1.73g，45.7mmol，6.01当量)分批加入滤液中，然后在25℃下搅拌21小时。用C盐过滤悬浮液，并浓缩滤液。将残余物溶解在100mL CH2Cl2并用1×25mL饱和NaHCO3水溶液洗涤。用无水Na2SO4干燥有机萃取物，过滤并浓缩，得到粘性油。产物不经进一步处理而使用。
HPLCHP 1100 HPLC色谱，Vydac 201TP 10×250mm柱，0.100mL注射，2.00mL/min，260nm检测，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B 2分钟，18分钟内10～80％B，2分钟内80～100％B，100％B 2分钟，保留时间15.8分钟。
D.α，α’-双[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙胺基]-1，4-二甲苯在25℃下将在75mL CH2Cl2中的α，α’-双[3-(甲基丙烯酰胺基)丙胺基]-1，4-二甲苯(2.94g，7.61mmol)、DIEA(2.97g，4.00mL，23.0mmols，3.02当量)、(2-溴甲基苯基)硼酸新戊酯(6.50g，23.0mmol，3.02当量)和BHT(5mg，作为抑制剂)的溶液于暗处搅拌28小时。此时，用1×25mL饱和NaHCO3水溶液洗涤混合物。用无水Na2SO4干燥有机萃取物，过滤并浓缩。向残余物中加入200mL乙醚，并将悬浮液搅拌18小时。过滤悬浮液，并将残余物溶解在CH2Cl2中，过滤并浓缩滤液。向固体残余物中加入150mL乙醚，并将悬浮液搅拌18小时。此时，过滤悬浮液，得到1.98g(33％)绒毛状粉红色粉末。
FAB MSC46H64B2N4O6计算值[M]+790；实测值[M+1]+791。
HPLCHP 1100 HPLC色谱，Waters 5×100mm NovaPak HR C18柱，0.050mL注射，0.75mL/min，280nm检测，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B 2分钟，18分钟内10～80％B，2分钟内80～100％B，100％B 2分钟，保留时间13.4分钟。
E.含有N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基]-3，4-二羟基-9，10-二氧-2-蒽磺酰胺(茜素红S单体)和α，α’-双[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙胺基]-1，4-二甲苯的丙烯酰胺凝胶的制备制备含有30％wt.丙烯酰胺和0.8％wt.N，N’-亚甲基双丙烯酰胺的乙二醇溶液。将N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基]-3，4-二羟基-9，10-二氧-2-蒽磺酰胺(1.5mg，3.38×10-6mol)和α，α’-双[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙胺基]-1，4-二甲苯(28mg，3.54×10-5mol)与800μL乙二醇单体溶液和40μL 5％wt.过硫酸铵水溶液合并。将所得的配方置于用氮净化的具有由玻璃显微镜载玻片和100微米不锈钢间隔物构成的模的手套箱。向此单体溶液中加入N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(40μL，5％wt.)的水溶液以加速聚合，并将最终配方倾入玻璃模中。将模在氮气氛下静置16小时，然后将其浸于PBS(pH＝7.4)中，并分离玻璃载玻片，得到薄膜形式的水凝胶聚合物。用100mL含有月桂基硫酸钠盐的磷酸盐缓冲盐水将所得水凝胶薄膜洗涤3天，溶液每天发生变化，然后用MeOH/PBS(20/80体积，3×100mL)洗涤，最后用PBS(pH＝7.4，3×100mL)洗涤。将水凝胶聚合物贮存在含有0.2％wt.叠氮化钠和1mM EDTA钠盐的PBS(10mM PBS，pH＝7.4)中。
F.用葡萄糖和乳酸盐调节吸光度测定葡萄糖和乳酸盐对在此实施例中制备的指示剂水凝胶(它含有两种识别成分)的吸光度的调节。以与实施例4所述相同的方式将丙烯酰胺凝胶装入PMMA室。在水浴中将含有期望量的葡萄糖或乳酸钠的pH＝7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)加热至37℃，并将其置于含有凝胶的PMMA室中，然后在37℃下将PMMA室平衡15分钟。每个葡萄糖或乳酸盐浓度的吸光度测量进行平行三次。对于每次测量，将650nm处的吸光度用作空白，从所有A(450nm)和A(530nm)的值中扣除A(650nm)。
图6显示含有或不含葡萄糖的含有4mM茜素红S单体和44mM双硼酸单体的丙烯酰胺凝胶(30％)的吸收光谱。图7显示葡萄糖对含有4mM茜素红S单体和44mM双硼酸单体的丙烯酰胺凝胶(30％)的吸光度的作用。图8显示乳酸钠对含有4mM茜素红S单体和44mM双硼酸单体的丙烯酰胺凝胶(30％)的吸光度的作用。指示剂的吸光度受葡萄糖存在影响，但基本上不受乳酸盐存在影响。
G.用葡萄糖和乳酸盐调节荧光测定基本上按照此实施例6合成(除了使用1.9mgN-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙基]-3，4-二羟基-9，10-二氧-2-蒽磺酰胺和35mgα，α’-双[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙胺基]-1，4-二甲苯])的丙烯酰胺凝胶的荧光的调节。
在装有可变温度附件的Shimadzu RF-5301 PC分光荧光光度计(在470nm激发，狭缝为3/10nm，高灵敏度)中进行实验。将丙烯酰胺凝胶附在一片玻璃载玻片上，所述载玻片以45°角粘合在PMMA荧光室内。用2.5ml PBS(pH＝7.4)填充该室，并加热至37℃。制备在PBS(pH＝7.4)中的葡萄糖储备溶液(100mM和500mM)，并在水浴中将其加热至37℃。定时将热的葡萄糖储备溶液的等分试样加入PMMA室中，同时在550nm处监测作为时间的函数的荧光强度(每2分钟1次测量)。用YSI Model 2300 STAT和葡萄糖分析仪测定PMMA室中的葡萄糖浓度。图9显示的结果表明，葡萄糖的加入降低指示剂水凝胶的荧光强度。在图10中观察到相同的作用，它表明葡萄糖对相同类型的凝胶的荧光光谱的作用。
据信此作用发生缘于以下考虑。茜素红S(报道分子)的甲基丙烯酰胺单体含有连位二醇官能团和单体官能团(见以下结构)。在水溶液和有机溶剂中，茜素红S和双硼酸盐识别成分单体(见以下结构)能够彼此可逆地反应形成硼酸酯。在此可逆反应中形成的硼酸酯分子是荧光分子，而茜素红S单体本身在水溶液和有机溶剂如MeOH中基本上不发射荧光。因此在与葡萄糖识别成分结合时，茜素红S改变其光学性质，如吸光度和荧光量子产率。
可以具含有单体官能团的茜素红S和具有单体官能团的葡萄糖识别成分的溶液与水凝胶单体和交联剂一起制备。此混合物的共聚产生可扩散至各种小或中等尺寸的分子的水凝胶物质；从而能够进行分析物检测和定量。分析物，如葡萄糖，将在水凝胶基质中扩散，并取代先前与识别成分结合的报道分子。该事件导致水凝胶膜的光学性质改变，因为现在它含有更多未与识别成分结合的报道分子。
还测定了葡萄糖和乳酸盐对在此实施例中制备的指示剂化合物(它含有两种识别成分)的荧光的调节。在装有可变温度附件的Shimadzu RF-5301 PC分光荧光光度计(在470nm激发，狭缝为5/10nm，低灵敏度)中进行实验。将丙烯酰胺凝胶附在一片玻璃载玻片上，所述载玻片以45°角粘合在PMMA荧光室内。用2.5ml PBS(pH＝7.4)填充该室，并在水浴中加热至37℃。制备在PBS(pH＝7.4)中的乳酸钠储备溶液(100mM)，并在水浴中将其加热至37℃。制备在PBS(pH＝7.4)中的葡萄糖储备溶液(100mM和500mM)，并在水浴中将其加热至37℃。定时地将热乳酸盐储备溶液的等分试样加入PMMA室中，同时在550nm处监测作为时间的函数的荧光强度(每2分钟1次测量)，直至乳酸盐浓度达到8mM。然后，定时地将热葡萄糖储备溶液的等分试样加入PMMA室中，同时在550mm处监测作为时间的函数的荧光强度(每2分钟1次测量)。用YSI Model 2300 STAT和葡萄糖分析仪测定PMMA室内的葡萄糖浓度。图11显示的结果表明，乳酸盐的加入对指示剂水凝胶的荧光强度没有显著作用，而随后加入的葡萄糖降低指示剂水凝胶的荧光强度。
实施例7双硼酸盐蒽的单甲基丙烯酰胺单体 A.9-氯甲基-10-[[2-(2-羟基乙氧基)乙胺基]甲基]蒽盐酸盐向在200mL NMP中的9，10-双(氯甲基)蒽(5.18g，18.8mmol，3.99当量)的悬浮液中加入2-(2-氨基乙氧基)乙醇(0.495g，0.475mL，4.71mmol)。将混合物于暗处搅拌17小时。此时，在真空和50℃下将反应混合物浓缩到～50mL。用硅胶色谱法(150g重力级硅胶，0～10％CH3OH/CH2Cl2)纯化残余物，得到0.425g(24％)黄色/橙色固体。
TLCMerck硅胶60板，Rf0.72，使用70/30 CH2Cl2/CH3OH，用UV(254/366)，茚三酮染色观察。
HPLCHP 1100 HPLC色谱，Vydac 201TP 10×250mm柱，0.100mL注射，2mL/min，370nm检测，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B 2分钟，18分钟内10～80％B，2分钟内80～100％B，100％B 2分钟，保留时间16.1分钟。
B.9-[[2-(2-羟基乙氧基)乙胺基]甲基]-10-[[(3-甲基丙烯酰胺基)丙胺基]甲基]蒽向23℃的在125mL CHCl3中的N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺盐酸盐(3.08g，17.2mmol，4.2当量)、DIEA(5.19g，7.00mL，40.1mmol，9.8当量)和～3mg BHT的悬浮液滴加到在25mL CHCl3中的9-氯甲基-10-[[2-(2-羟基乙氧基)乙胺基]甲基]蒽盐酸盐(1.56g，4.10mmol)的溶液中。然后将混合物于暗处搅拌92小时。此时，过滤反应混合物，并用2×40mL NaHCO3(饱和水溶液)洗涤。用无水Na2SO4干燥有机萃取物，过滤并浓缩，得到绒毛状橙色固体，用氧化铝色谱法(50g活化的中性氧化铝，0～5％CH3OH/CH2Cl2)纯化该固体，得到0.364g(20％)橙色固体。
TLCMerck硅胶60板，Rf0.16，用70/30 CH2Cl2/CH3OH，用UV(254/366)，茚三酮染色观察。
HPLCHP 1100 HPLC色谱，Vydac 201TP 10×250mm柱，0.100mL注射，2mL/min，370nm检测，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B 2分钟，18分钟内10～80％B，2分钟内80～100％B，100％B 2分钟，保留时间16.85分钟。
C.9-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙胺基]甲基]-10-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-羟基乙氧基)乙胺基]甲基]蒽(单甲基丙烯酰胺单体)将23℃的在20mL CHCl3中的9-[[2-(2-羟基乙氧基)乙胺基]甲基]-10-[[(3-甲基丙烯酰胺基)丙胺基]甲基]蒽(0.343g，0.763mmol)、DIEA(0.965g，1.30mL，9.8当量)和(2-溴甲基苯基)硼酸新戊酯(1.09g，3.85mmol，5.0当量)的溶液于暗处搅拌25小时。此时，首先通过旋转蒸发将反应混合物浓缩，然后用真空泵除去DIEA。用氧化铝柱色谱法(40g活化的中性氧化铝，0～10％CH3OH/CH2Cl2)纯化残余物，得到0.299g(46％)黄橙色固体。此化合物可以与上述适宜的单体共聚、脱保护并用于检测葡萄糖。
FAB MSC51H65B2N3O7计算值[M]+854；实测值[M+1]+855。
TLCMerck碱性氧化铝板，Rf0.35，用95/5 CH2Cl2/CH3OH，用UV(254/366)观察。
HPLCHP 1100 HPLC色谱，Vydac 201TP 10×250mm柱，0.100mL注射，2mL/min，370nm检测，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B 2分钟，18分钟内10～80％B，2分钟内80～100％B，100％B 2分钟，保留时间19.7分钟。
实施例8双硼酸盐蒽的双甲基丙烯酸酯单体 A.9，10-双[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧乙氧基)乙胺基]甲基]蒽在0℃下，将在5mL CH2Cl2中的9，10-双[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-羟基乙氧基)乙胺基]甲基]蒽(0.100g，0.120mmol；见实施例2)、甲基丙烯酸(0.112g，0.110mL，1.30mmol，10.8当量)、DCC(0.316g，1.53mmol，12.8当量)和N，N-二甲基氨基吡啶(0.014g，0.11mmol，0.92当量)的溶液搅拌1小时，然后在23℃下搅拌22小时。此时，过滤反应混合物，并通过旋转蒸发浓缩。用氧化铝柱色谱法(30g活化的中性氧化铝，0～2％CH3OH/CH2Cl2)纯化残余物，得到0.030g(26％)黄色固体。此化合物可以与前述的适宜单体共聚、脱保护并用于检测葡萄糖。
FAB MSC56H70B2N2O10计算值[M]+953；实测值[M]+951(弱分子离子峰)。
TLCMerck碱性氧化铝板，Rf0.67，用95/5 CH2Cl2/CH3OH，用UV(254/366)观察。
HPLCHP 1100 HPLC色谱，Waters 5×100mm NovaPak HR C18柱，0.100mL注射，0.75mL/min，2mL注射环，370nm检测，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B 2分钟，18分钟内10～80％B，2分钟内80～100％B，100％B 2分钟，保留时间19.6分钟。
实施例9双5-氨基戊基双硼酸盐蒽 A.9，10-双[[5-(t-BOC)-氨基戊胺基]甲基]蒽在45℃下，将9，10-双(氯甲基)蒽(0.28g，1mmol)、DIEA(7.0mL，40mmol)、单叔丁氧羰基1，5-二氨基戊烷(3.75g，10mmol)和50mlCHCl3的悬浮液于暗处搅拌2天。用饱和H2O/NaHCO3洗涤溶液，干燥(Na2SO4)有机相，并蒸发溶剂。用氧化铝色谱法(40g活化的中性氧化铝，95/5％vol.CH2Cl2/MeOH)纯化残余物，得到0.55g粘性油。将此物质不经进一步纯化而用于下一步骤。
B.9，10-双[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[5-(t-BOC)-氨基戊胺基]甲基]蒽在25℃下，将在20mL CH2Cl2中的9，10-双[[5-(t-BOC)-氨基戊胺基]甲基]蒽(0.3g，0.49mmol)、DIEA(0.35mL，2mmol)和(2-溴甲基苯基)硼酸新戊酯(0.566g，2.0mmol)的溶液于暗处搅拌2天。此时，真空浓缩反应混合物，并用氧化铝色谱法(60g活化的中性氧化铝，98/2％vol.CH2Cl2/MeOH)纯化残余物，得到0.401g黄色油。将此物质不经进一步纯化而用于下一步骤。
C.9，10-双[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[5-氨基戊胺基]甲基]蒽三氟乙酸盐将9，10-双[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[5-(t-BOC)-氨基戊胺基]甲基]蒽(0.4g，0.39mmol)溶解在20ml CH2Cl2/TFA(80/20％vol.)中。将溶液搅拌12小时，并将溶剂蒸发，用10ml乙醚洗涤残余物。得到总共373mg固体(72％收率)。产物的RP-HPLC纯度为～80％。此化合物可以与前述的适宜单体共聚、脱保护并用于检测葡萄糖。
HPLCHP 1100 HPLC色谱，Waters 5×100mm NovaPak HR C18柱，0.050mL注射，0.75mL/min，360nm检测，A＝水(0.1％HFBA)和B＝MeCN(0.1％HFBA)，梯度10％B 2分钟，18分钟内10～80％B，2分钟内80～100％B，100％B 2分钟，保留时间16.0分钟。
实施例10 A.N-2-(叔丁氧羰基)氨基乙基-4-溴萘-1，8-二甲酰亚胺将N-t-Boc-乙二胺(Fluka，1.6g，10mmol)和4-溴-1，8-萘二甲酸酐(Aldrich，2.77g，10mmol)与60ml无水乙醇合并，在60℃下将悬浮液搅拌20小时，冷却至室温，并过滤。用30ml冷EtOH洗涤所得的固体，并真空干燥。得到3.84g(91％)。NMR(CDCl3)δ1.28(9H，s)；3.52(2H，t)；4.35(2H，t)；4.92(1H，s)；7.84(1H，t)；8.04(1H，d)；8.42(1H，d)；8.58(1H，d)；8.67(1H，d)。
B.N-2-(叔丁氧羰基)氨基乙基-4-(N’-甲基氨基乙胺基)萘-1，8-二甲酰亚胺将N-甲基乙二胺(1.48g，20mmol)与2ml 1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)合并，然后加入N-2-(叔丁氧羰基)氨基乙基-4-溴萘-1，8-二甲酰亚胺(0.35g，0.845mmol)。在45℃下，将所得的溶液搅拌40小时，然后真空蒸发NMP和N-甲基乙二胺。将所得的残余物进行柱色谱处理(20g硅胶，最初用CH2Cl2/MeOH(90/10)，然后用CH2Cl2/MeOH/Et3N(75/20/5))。得到黄色固体(0.311g，89％收率)。用RP-HPLC检查纯度。
C.N-氨基乙基-4-(N’-氨基亚乙基-N”-[2-(二羟硼基)苄基]甲基氨基)萘-1，8-二甲酰亚胺三氟乙酸盐合并N-2-(叔丁氧羰基)氨基乙基-4-(N’-甲基氨基乙胺基)萘-1，8-二甲酰亚胺(0.3g，0.73mmol)、2-溴甲基苯基硼酸、频那醇酯(0.6g，2mmol)、N，N-二异丙基-N-乙胺(1.3ml，8mmol)和10ml CH2Cl2。将溶液搅拌20小时，然后加入2g PS-Trisamine树脂(ArgonautTechnologies，3.38mmol/g)。将反应混合物和树脂搅拌10小时，然后过滤移出树脂，并用CH2Cl2(2×20ml)洗涤。蒸发合并的CH2Cl2溶液并真空干燥。将含有20％vol.TFA和5％vol.三异丙基甲硅烷的二氯甲烷溶液加入所得的橙色残余物中。室温下将所得的溶液搅拌10小时，然后蒸发溶剂，并用乙醚研磨残余物，得到黄色固体。过滤固体，并真空干燥(得到580mg)。通过RP-HPLC检查该物质的纯度。将固体不经进一步纯化而用于下一步骤。
D.N-(3-二羟硼基-5-硝基苯甲酰胺基)乙基-4-(N’-氨基亚乙基-N”-[2-(二羟硼基)苄基]甲基氨基)萘-1，8-二甲酰亚胺合并N-氨基乙基-4-(N’-氨基亚乙基-N”-[2-(二羟硼基)苄基]甲基氨基)萘-1，8-二甲酰亚胺三氟乙酸盐(0.225g，0.4mmol)、3-羧基-5-硝基苯基硼酸(0.085g，0.4mmol)、二苯基磷酰基叠氮化物(0.13ml，0.6mmol)和2ml无水DMF。加入N，N-二异丙基-N-乙胺(0.7ml，4mmol)并将溶液搅拌20小时。将乙醚(10ml)加入反应混合物中，分离不溶残余物，并用5ml CH2Cl2超声处理，得到橙色固体，将其过滤并在真空下干燥(38mg，15％收率)。通过RP-HPLC检测固体的纯度。NMR(DMSO-d6/D2O，90/10)δ2.32(3H，s)；2.82(2H，t)；3.58(2H，t)；3.65(2H，t)，3.70(2H，s)；6.65(1H，d)；7.0-7.3(4H，m)；7.68(1H，t)；8.18(1H，d)；8.42(1H，d)；8.47(1H，d)；8.1-8.35(3H，m)。
E.通过荧光监测N-(3-二羟硼基-5-硝基苯甲酰胺基)乙基-4-(N’-氨基亚乙基-N”-[2-(二羟硼基)苄基]甲基氨基)萘-1，8-二甲酰亚胺与葡萄糖相互作用的试验此实验在MeOH/磷酸盐缓冲盐水(PBS，10mM，pH＝7.4)中进行。N-(3-二羟硼基-5-硝基苯甲酰胺基)乙基-4-(N’-氨基亚乙基-N”-[2-(二羟硼基)苄基]甲基氨基)萘-1，8-二甲酰亚胺在MeOH/PBS(50/50vol.％)中的浓度为15mM。葡萄糖浓度的范围为0mM～50mM，而L-乳酸钠的浓度范围为0mM～7mM。此实验在Shimadzu RF-5301 PC分光荧光光度计中进行激发波长设定在430nm，在480～650nm范围内监测发射，狭缝宽度3/1.5nm，PMT的高灵敏度。
结果如图12和13所示，它们表明此实施例中的指示剂的荧光受葡萄糖存在影响，但不受乳酸盐存在影响。
权利要求
1.一种用于检测可能还含有α-羟酸或β-二酮的样品中葡萄糖的存在或浓度的方法，所述方法包括a)使样品与具有至少两个葡萄糖的识别成分的化合物接触，该识别成分的取向使该化合物与葡萄糖之间的相互作用比该化合物与α-羟酸或β-二酮之间的相互作用更为稳定，所述化合物还含有具有可检测性质的可检测部分，该性质在所述化合物与所述样品中的葡萄糖接触时以浓度依赖性方式变化；和b)测量所述可检测性质的任何变化，以测定所述样品中葡萄糖的存在或浓度，其中α-羟酸或β-二酮的存在基本上不干扰所述测定。
2.权利要求1的方法，其中该化合物具有以下结构 其中-R1和R2相同或不同，并选自以下i)氢，ii)改变R8部分的pKa和水解稳定性的取代基，iii)可检测部分，或iv)能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分；-R3为氢或能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分；-R4和R5相同或不同，并选自以下i)氢，ii)改变R8部分的pKa和水解稳定性的取代基，iii)可检测部分，或iv)能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分；-每个Z独立地为碳或氮；-R6和R7相同或不同，并且为i)具有0～10个相邻或分枝的碳和/或杂原子的连接基团，或ii)能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分；-R选自以下i)含有1～10个相邻的选自碳、氧、氮、硫和磷的原子的脂肪和/或芳香间隔基，ii)可检测部分，或iii)能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分；-每个R8相同或不同，且是能够与葡萄糖中存在的连位二醇基团相互作用的部分；和-R9和R10相同或不同，并且是i)氢，ii)可检测部分，iii)以下基团a)能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分，和/或b)包括能够改变该化合物的物理性质的官能团的基团；附带条件是该指示剂化合物含有至少一个与其缔合的可检测部分。
3.权利要求2的方法，其中R8选自硼酸、硼酸根离子、亚砷酸、亚砷酸根离子、碲酸、碲酸根离子、锗酸、锗酸根离子及它们的组合。
4.权利要求3的方法，其中每个R8为硼酸基团。
5.权利要求2的方法，其中该化合物包含至少两个能够从一个向另一个进行能量转移的可检测部分，且其中所述能量转移受样品中葡萄糖的存在的调节。
6.权利要求2的方法，其中R、R1、R2、R4、R5、R9或R10中至少一个基团包含荧光团部分，且其中这些基团中至少一个包含猝灭部分，而且其中当所述化合物与样品中的葡萄糖相互作用时所述荧光团猝灭或去猝灭。
7.权利要求2的方法，其中该化合物包含荧光团，且所述荧光团的荧光受所述化合物与葡萄糖的相互作用的调节。
8.权利要求1的方法，其中该样品为生理液体。
9.权利要求8的方法，其中该生理液体选自血液、血浆、血清、间隙液、脑脊髓液、尿、唾液、眼内液、淋巴液、泪液、汗液和生理缓冲液。
10.权利要求1的方法，其中该化合物与溶液中的样品接触。
11.权利要求1的方法，其中该化合物固定在固体载体上或固体载体内。
12.权利要求11的方法，其中该固体载体为聚合物基质。
13.权利要求1的方法，其中该化合物与可植入器件缔合，且其中步骤a)在体内发生。
14.权利要求2的方法，其中R为蒽残基；R1、R2、R3、R4和R5为氢；R6和R7为二甲胺残基；每个R8为硼酸基团；R9和R10为脂族羧酸残基；且每个Z为碳。
15.权利要求14的方法，其中R9和R10为丙酸残基。
16.权利要求2的方法，其中R为六亚甲基残基；R1、R2、R3、R4和R5为氢；R6和R7为二甲胺残基；每个R8为硼酸基团；R9为萘二甲酰亚胺残基；R10为二甲氨基苄基残基；且每个Z为碳。
17.权利要求2的方法，其中R为蒽残基；R1、R2、R3、R4和R5为氢；R6和R7为二甲胺残基；每个R8为硼酸基团；R9和R10相同或不同，并选自甲基丙烯酰氨基烷基残基、甲基丙烯酰氧乙氧基烷基残基、羟基乙氧基烷基残基和氨基烷基残基；且每个Z为碳。
18.权利要求2的方法，其中该化合物选自9-[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧乙氧基)乙胺基]甲基]-10-[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[2-(2-羟基乙氧基)乙胺基]甲基]蒽；9，10-双[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[3-(丙酰基)氨基]甲基]蒽；9，10-双[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙胺基]甲基蒽；9-[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙胺基]甲基]-10-[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[2-(2-羟基乙氧基)乙胺基]甲基]蒽；9，10-双[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧乙氧基)乙胺基]甲基]蒽；和9，10-双[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[5-氨基戊胺基]甲基]蒽；和它们的盐。
19.一种具有以下结构的化合物 其中-R1和R2相同或不同，并选自以下i)氢；ii)改变R8部分的pKa和水解稳定性的取代基，iii)可检测部分，或iv)能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分；-R3为氢或能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分；-R4和R5相同或不同，并选自以下i)氢，ii)改变R8部分的pKa和水解稳定性的取代基，iii)可检测部分，或iv)能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分；-每个Z独立地为碳或氮；-R6和R7相同或不同，并且为i)具有0～10个相邻或分枝的碳和/或杂原子的连接基团，或ii)能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分；-R选自以下i)含有1～10个相邻的选自碳、氧、氮、硫和磷的原子的脂肪和/或芳香间隔基，ii)可检测部分，或iii)能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分；-每个R8相同或不同，且是在脱保护时能够与葡萄糖中存在的连位二醇基团相互作用的任选地被保护的部分；和-R9和R10相同或不同，并且是i)氢，ii)可检测部分，iii)以下基团a)能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分，和/或b)包括能够改变该化合物的物理性质的官能团的基团；附带条件是该指示剂化合物含有至少一个与其缔合的可检测部分。
20.权利要求19的化合物，其中R8选自硼酸、硼酸根离子、亚砷酸、亚砷酸根离子、碲酸、碲酸根离子、锗酸、锗酸根离子及它们的组合，所有基团任选地被保护。
21.权利要求20的化合物，其中每个R8为任选地被保护的硼酸基团。
22.权利要求19的化合物，其中该化合物包含荧光团，且所述荧光团的荧光受所述化合物与葡萄糖的相互作用的调节。
23.权利要求19的化合物，其中R为蒽残基；R1、R2、R3、R4和R5为氢；R6和R7为二甲胺残基；每个R8为任选地被保护的硼酸基团；R9和R10为脂族羧酸残基；且每个Z为碳。
24.权利要求23的化合物，其中R9和R10为丙酸残基。
25.权利要求1的化合物，其中R为蒽残基；R1、R2、R3、R4和R5为氢；R6和R7为二甲胺残基；每个R8为任选地被保护的硼酸基团；R9和R10相同或不同，并选自甲基丙烯酰胺基烷基残基、甲基丙烯酰氧乙氧基烷基残基、羟基乙氧基烷基残基和氨基烷基残基；且每个Z为碳。
26.权利要求19的化合物，其中该化合物选自9-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧乙氧基)乙胺基]甲基]-10-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-羟基乙氧基)乙胺基]甲基]蒽；9-[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧乙氧基)乙胺基]甲基]-10-[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[2-(2-羟基乙氧基)乙胺基]甲基]蒽；9，10-双[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[3-(丙酰基)氨基]甲基]蒽；9，10-双[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙胺基]甲基蒽；9，10-双[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙胺基]甲基蒽；9-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙胺基]甲基]-10-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-羟基乙氧基)乙胺基]甲基]蒽；9-[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙胺基]甲基]-10-[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[2-(2-羟基乙氧基)乙胺基]甲基]蒽；9，10-双[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧乙氧基)乙胺基]甲基]蒽；9，10-双[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧乙氧基)乙胺基]甲基]蒽；和9，10-双[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[5-氨基戊胺基]甲基]蒽；和它们的盐。
27.一种用于检测可能还含有α-羟酸或β-二酮的样品中葡萄糖的存在或浓度的检测系统，所述系统包括具有以下结构的化合物 其中-R1和R2相同或不同，并选自以下i)氢；ii)改变R8部分的pKa和水解稳定性的取代基，iii)可检测部分，或iv)能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分；-R3为氢或能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分；-R4和R5相同或不同，并选自以下i)氢，ii)改变R8部分的pKa和水解稳定性的取代基，iii)可检测部分，或iv)能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分；-每个Z独立地为碳或氮；-R6和R7相同或不同，并且为i)具有0～10个相邻或分枝的碳和/或杂原子的连接基团，或ii)能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分；-R选自以下i)含有1～10个相邻的选自碳、氧、氮、硫和磷的原子的脂肪和/或芳香间隔基，ii)可检测部分，或iii)能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分；-每个R8相同或不同，且是在脱保护时能够与葡萄糖中存在的连位二醇基团相互作用的任选地被保护的部分；和-R9和R10相同或不同，并且是i)氢，ii)可检测部分，iii)以下基团a)能够与固体载体或聚合物基质结合的连接基团，所述载体或基质任选地含有可检测部分，和/或b)包括能够改变该化合物的物理性质的官能团的基团；附带条件是该指示剂化合物含有至少一个与其缔合的可检测部分。
28.权利要求27的检测系统，其中R8选自硼酸、硼酸根离子、亚砷酸、亚砷酸根离子、碲酸、碲酸根离子、锗酸、锗酸根离子及它们的组合，所有基团任选地被保护。
29.权利要求28的检测系统，其中每个R8为任选地被保护的硼酸基团。
30.权利要求27的检测系统，其中该化合物包含荧光团，且所述荧光团的荧光受所述化合物与葡萄糖的相互作用的调节。
31.权利要求27的检测系统，其中R为蒽残基；R1、R2、R3、R4和R5为氢；R6和R7为二甲胺残基；每个R8为任选地被保护的硼酸基团；R9和R10为脂族羧酸残基；且每个Z为碳。
32.权利要求31的检测系统，其中R9和R10为丙酸残基。
33.权利要求27的检测系统，其中R为蒽残基；R1、R2、R3、R4和R5为氢；R6和R7为二甲胺残基；每个R8为硼酸基团；R9和R10相同或不同，并选自甲基丙烯酰胺基烷基残基、甲基丙烯酰氧乙氧基烷基残基、羟基乙氧基烷基残基和氨基烷基残基；且每个Z为碳。
34.权利要求27的检测系统，其中该化合物选自9-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧乙氧基)乙胺基]甲基]-10-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-羟基乙氧基)乙胺基]甲基]蒽；9-[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧乙氧基)乙胺基]甲基]-10-[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[2-(2-羟基乙氧基)乙胺基]甲基]蒽；9，10-双[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[3-(丙酰基)氨基]甲基]蒽；9，10-双[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙胺基]甲基蒽；9，10-双[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙胺基]甲基蒽；9-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙胺基]甲基]-10-[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-羟基乙氧基)乙胺基]甲基]蒽；9-[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[3-(甲基丙烯酰胺基)丙胺基]甲基]-10-[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[2-(2-羟基乙氧基)乙胺基]甲基]蒽；9，10-双[N-[2-(5，5-二甲基硼烷-2-基)苄基]-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧乙氧基)乙胺基]甲基]蒽；9，10-双[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[2-(2-甲基丙烯酰氧乙氧基)乙胺基]甲基]蒽；和9，10-双[N-(2-二羟硼基苄基)-N-[5-氨基戊胺基]甲基]蒽；和它们的盐。
全文摘要
本发明涉及用于测定可能还含有α－羟酸或β－二酮的样品中葡萄糖的存在或浓度的组合物和方法。该方法使用具有至少两个葡萄糖的识别成分的化合物，该识别成分的取向使该化合物与葡萄糖之间的相互作用比该化合物与α－羟酸或β－二酮之间的相互作用更为稳定，从而使α－羟酸或β－二酮的存在基本上不干扰所述的测定。
文档编号G01N33/533GK1513117SQ02806012
公开日2004年7月14日 申请日期2002年1月4日 优先权日2001年1月5日
发明者乔治·Y·丹尼洛夫, 亚里士多德·G·卡利佛兰特诺斯, 亚历山大·V·尼古拉奇克, 乔治 Y 丹尼洛夫, 多德 G 卡利佛兰特诺斯, 大 V 尼古拉奇克 申请人:医药及科学传感器公司