新的幽门螺杆菌受体及其用途的制作方法

专利名称：新的幽门螺杆菌受体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明描述了一种结合幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的物质或受体及其在例如治疗由幽门螺杆菌引起疾病的药用和营养组合物中的用途。本发明还涉及使用受体来诊断幽门螺杆菌。
背景技术：
幽门螺杆菌被认为与几种胃肠道疾病相关，包括慢性胃炎，非类固醇抗-炎症药物(NSAID)相关联的胃病、十二指肠溃疡和胃溃疡、胃麦芽淋巴瘤和胃腺癌(Axon，1993；Blaser，1992；DeCross和Marshall，1993；Dooley，1993；Dunn等，1997；Lin等，1993，Nomura和Stemmermann，1993；Parsonnet等，1994；Sung等，2000；Wotherspoon等，1993)。全部或部分非肠胃疾病包括婴儿猝死综合症(Kerr等，2000和US 6,083,756)，自体免疫疾病如自体免疫胃炎和恶性贫血(Appelmelk等，1998；Chmiela等，1998；Clayes等，1998；Jassel等，1999；Steininger等，1998)和某些皮肤疾病(Rebora等，1995)，胰腺疾病(Correa等，1990)，肝脏疾病包括腺癌(Nilsson等，2000；Avenaud等，2000)，和如动脉硬化症等心脏疾病(Farsak等，2000)。Pakodi等于2000年回顾了由幽门螺杆菌引起或相关的多种疾病。人们对于细菌定居和感染的主要兴趣点在于细菌粘附于胃粘膜上皮细胞表面的机理。
已有报道称基于脂质-和蛋白-的糖缀合物作为受体来与这种微生物结合，如唾液酸糖缀合物(sialylated glycolconjugates)(Evans等，1988)，硫苷脂和GM3(Saitoh等，1991)，Leb血型决定簇(Boren等，1993)，聚糖基神经酰胺(Miller-Podraza等，1996，1997a)，乳糖基酰基鞘氨醇(Angstrom等，1998)，和神经节四糖基酰基鞘氨醇(Lingwood等，1992；angstrm等，1998)。其它潜在的幽门螺杆菌受体包括多糖硫酸乙酰肝素(Ascensio等，1993)和磷脂酰乙醇胺(Lingwood等，1992)。
Zopf等的美国专利5,883,079(1999年3月)、5,753,630(1998年5月)和5,514,660(1996年5月)描述了作为幽门螺杆菌粘附素抑制剂的包含Neu5Acα3Gal的化合物。唾液酸乳糖分子抑制了幽门螺杆菌与人类肠胃细胞系的结合(Simon等，1999)，并且它在恒河猴感染的动物模型中也是有效的(Mysore等2000)。该化合物已用于临床试验。
美国专利5,446,681(Krivan等，1995年11月)描述了一种细菌受体抗生素共扼物，该共扼物由一个脱唾液酸神经节苷脂缀合一个青霉素抗生素构成。该专利还特别请求保护了用阿莫西林(amoxicillin)-脱唾液酸-GM1共扼物治疗幽门螺杆菌引起的疾病。本发明描述的寡糖序列/糖脂不属于神经节类的糖脂。
美国专利5,386,027(Krivan等，1995年1月)和5,217,715(1993年6月)描述了寡糖序列或糖脂抑制几种致病菌的用途，可是其中并没有涉及本发明所述的结合特异性，而且在其研究或要求的细菌中也没有包括幽门螺杆菌。
已有报道糖序列GIcNAcβ3Gal作为链球菌的受体(Andersson等，1986)。某些细菌可能具有重叠结合特异性，但是由此不可能预测出甚至非常接近相关细菌粘附素的结合物质。对于幽门螺杆菌来说，除了Lewis b结合蛋白外其他的糖结合分子还是未知的。
发明概述本发明涉及含有寡糖序列[Gal(A)q(NAc)r/Glc(A)q(NAc)rα3/β3]s[Galβ4GlcNAcβ3]tGalβ4Glc(NAc)u并能结合幽门螺杆菌的物质或受体的用途，其中q、r、s、t和u各自独立为0或1，所以当t＝0和u＝0时，寡糖序列与多价载体连接或以高浓度的游离寡糖存在，还涉及所述具有结合幽门螺杆菌活性的所述寡糖序列的类似物或衍生物在生产具有结合幽门螺杆菌的或抑制活性的组合物中的用途。
本发明的目的之一涉及本发明描述的作为介质的结合幽门螺杆菌的寡糖序列的用途，以及该物质在制备药物组合物中的用途，尤其是将之用来治疗由本发明所述幽门螺杆菌的存在引起的任何一种疾病。
本发明还涉及治疗由幽门螺杆菌存在引起的疾病的方法。本发明还涉及使用本发明描述的作为幽门螺杆菌的结合或抑制物质的受体来诊断幽门螺杆菌。
本发明的另一个目的是提供了含有结合幽门螺杆菌的寡糖序列的物质、药物组合物和营养添加剂或复合物。
本发明的另一个目的是上述结合幽门螺杆菌的物质在鉴定细菌粘附素、幽门螺杆菌分型和结合幽门螺杆菌检测中的用途。
本发明的另一个目的是上述结合幽门螺杆菌的物质在生产抗幽门螺杆菌疫苗中的用途。
发明详述

图1A和1B 由内生糖神经酰胺酶(endoglycoceramidase)消化六糖基神经酰胺(hexaglycosylceramide)获得的过甲基化(permethylated)寡糖的EI/MS，该寡糖的气相色谱图(上部)和峰A和B各自的EI/MS波谱图(底部)。
图2A和2B 六糖基神经酰胺(2A)和五糖基神经酰胺(2B)的阴离子FAB质谱图。
图3A和3B 显示了六糖糖脂(3A)和五糖糖脂(3B)端基异构体区域的质子NMR波谱图，过夜获得的较小1型(minor type 1)成分的波谱达到了良好的的信号-噪音比。
图4A、4B和4C兔胸腺糖鞘脂的酶降解结果。硅胶薄层板置于C/M/H20(体积比为60∶35∶8)中，其中图4A和4B为4-甲氧基苯甲醛显像板，图4C为涂覆35S-标记的幽门螺杆后获得的放射自显影照片。1、七糖基神经酰胺(结构1，表I)；2、脱唾液酸(desialylated)七糖基神经酰胺(经酸处理后获得)；3、用β4-半乳糖苷酶处理的脱唾液酸(desialylated)七糖基神经酰胺；4、用唾液酸酶和β4-半乳糖苷酶处理的七糖基神经酰胺；5、来自于人红血球的对照糖鞘脂(glycosphingolipids)(乳糖苷神经酰胺(lactosylceramide)，三己糖苷神经酰胺和红细胞糖苷脂)；6、用β4-半乳糖苷酶和β-己糖胺酶处理的脱唾液酸七糖基神经酰胺；7、用唾液酸酶、β4-半乳糖苷酶和β-己糖胺酶处理的七糖基神经酰胺。
图5A和5B兔胸腺七糖基神经酰胺(结构1，表I)的部分酸水解后获得产物的TLC。显影溶剂同图4A、4B和4C。5A，4-甲氧基苯甲醛-显影板；5B，涂覆35S-标记的幽门螺杆菌后获得的放射自显影照片。1、七糖基神经酰胺；2、脱唾液酸七糖基神经酰胺(酸处理)；3、五糖基神经酰胺；4、水解产物；5、对照糖鞘脂(同图4A、4B和4C)。
图6A和6B系列稀释的糖鞘脂。使用细菌覆盖技术在TLC板上鉴定结合活性。TLC显影溶剂同图4A、4B和4C。不同的糖脂以克分子数相等的量加到板上。基于己糖的量量化糖脂。6A、六和七糖基神经酰胺(结构2和3，表I)；6B、五和四糖基神经酰胺(结构4和5，表I)。糖脂数量(用pmols表示)如下所示1，1280(每一)；2，640；3，320；4，160；5，80；6，40；7，20pmol(每一)。
图7A和7B用4-甲氧基苯甲醛检测分离糖鞘脂的薄层色谱图(7A)和在结合放射标记的幽门螺杆菌032菌株后获得的放射自显影照片(7B)。采用体积比为60∶35∶8的氯仿/甲醇/水混合液作为溶剂体系在铝背景硅胶60HPTLC板(Merck)上分离糖鞘脂。结合测定按照“材料与方法”章节描述的进行。放射自显影72个小时，获得如下结果泳道1)Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(新乳四糖基神经酰胺)，4μg；泳道2)Galα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(B5糖鞘脂)，4μg；泳道3)Galα3Galβ4GlcNH2β3Galβ4Glcβ1Cer，4μg；泳道4)Galα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(2型B6糖鞘脂)，4μg；泳道5)GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer，4μg；泳道6)Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer，4μg；泳道7)GalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(X2糖鞘脂)，4μg；泳道8)NeuAcα3GalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(NeuAc-X2)，4μg；泳道9)Fucα2Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(2型H5糖鞘脂)，4ug，泳道10)NeuAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glcβ1Cer(唾液酸新乳四糖苷神经酰胺(sialylneolactotetraosylceramide))，4ug；糖鞘脂的来源同表2中给出的。
图8A、8B、8C和8D 计算出的以下三种能够结合幽门螺杆菌的糖鞘脂的最低能量构象GalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer(8A)，GalNAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer(8B)和Galα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer(8C)，还显示了非结合的Galα3Galβ4GlcNH2β3Galβ4GlcβCer结构(8D)。图中给出了每个计算出的最低能量结构中寡糖部分的顶视图。不管端基异构体中的差别及其在末端糖4-OH的轴向或纬向位置是否存在一个乙酰胺基团，事实表明末端α3-连接的化合物的环状平面凸起超出了β3-连接的相应平面，一个基本上地形学类似处存在于这些结构和来源于兔胸腺(图9A)的GIcNAcβ3-终止结构(terminated structure)之间，由此说明了它们对细菌粘附素具有相近的亲合力。与此相对照，内部的GIcNAcβ3的乙酰胺基对于结合是至关重要的(参照8C和8D)。
图9A、9B、9C和9D 计算出的结合活性的糖鞘脂的最低能量构象(conformer)，其中分别为糖鞘脂GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer(9A)和Galβ4GlcNAcβ3Galβ4-GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer(9B)，非结合类的糖鞘脂为NeuAcα3GalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer(9C)和Galα3(Fucα2)Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer(9D)。当前者(9B)被容许但导致亲合力减少时，后面两种延长形式丧失了其与幽门螺杆菌的结合(9C和9D)。同时发现B5内在GlcNAc的乙酰氨基部分的脱-N-酰化作用(图8A、8B、8C和8D)完全取消了结合，故由于处于末端的N-乙酰半乳糖胺的乙酰氨基不重要，所以组成结合表位的部分必须含有图8C所示的B5的末端三糖。
图10在相对各自旋转90度的两个方案中显示了七糖化合物NeuGcα3Galβ4GIcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer的最低能量构象。唾液酸糖基部分的末端碳原子和两个内在GlcNAc残基的乙酰氨基的甲基碳原子一样用黑色表示，这只不过是为了利于阅读的定位。可以任意选择Glcβcer联结的延长构型，但最合适的是最小结合序列GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3，因为它更好地暴露于不同于这里描述的一种GlcβCer构象中的邻近粘附素。
图11A、11B和11C显示了单克隆抗体TH2(11B)和E.cristagalli凝集素(11C)与通过薄层色谱分离的来自于人胃黏膜、人粒细胞和人红血球的上皮细胞的总非酸糖鞘脂级分(total non-acid glycolsphingolipidfractions)的结合。相同级分中的通过4-甲氧基苯甲醛染色显现出来(11A)。例子(11B)和(11C)中的放射自显影进行了12个小时。泳道1-6分别点样来自于五个不同血型A个体胃黏膜上皮细胞的总非酸级分80μg，但是泳道6是加了40ug来自于人粒细胞的总的非酸级分、泳道7是加了40ug来自于人红血球的总的非酸级分。按照“材料与方法”部分的描述进行涂覆测试。
发明详述本发明描述了结合幽门螺杆菌的特定寡糖序列家族。通过薄层涂覆测试对众多天然存在的糖鞘脂进行筛选(表2)。使用的糖鞘脂的结构由质子NMR和质谱试验确定。分子模型用来比较结合幽门螺杆菌物质的三维结构。
通过比较四个五糖糖脂来证明新的结合特异性，不管端基异构体中的差别以及在末端糖4-OH的轴向或横向位置是否存在一个乙酰氨基，发现GIcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer中非还原的末端糖由GalNAcβ3(简短名称x2 GSL)、GalNAcα3或Galα3(B5)交换后都会导致与幽门螺杆菌的结合。特异性还包括减弱结合幽门螺杆菌的结构一种简短形式的Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer和含有末端N-乙酰葡糖胺的β4-延长形式的糖脂如Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3GaIβ4GlcβCer和NeuGcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer。与先前已知的依赖于特异性的唾液酸相对照(Evans等，1988，Miller-Podraza等，1996；1997a)，最后提及糖鞘脂中的N-糖基神经氨酸可以被释放出来而不结合幽门螺杆菌。
虽然常规糖与幽门螺杆菌的结合会遭到细菌阶段变化的破坏，但对GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer的结合是完全可以重复的，在涂覆测试中低皮摩尔量的糖脂就明显表现出结合的高亲合力。
GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer、Galβ4GlcNβ3Galβ4GlcβCer和Galα3Galβ4GlcNβ3Galβ4GlcβCer(一种截短形式和N-脱乙酰基形式的活性类型)不与结合幽门螺杆菌的的试验指示了结合表位的长度。数据表明内在GlcNAc残基参与了结合但其单独存在并不能引起足够强的结合反应。结合表位被认为是上述讨论五糖表位中的末端三糖。当残基中仅有两个存在于如Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer中时，结合是微弱的，处于六糖糖脂Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer中时，末端Galβ4抑制了结合解释了微弱的活性。在较弱活性的六糖糖脂结构上有一个Galα3的七糖糖脂Galα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer具有较高的活性，这也表明末端三糖表位对于产生良好的结合活性是必需的。
通过分析异构体和活性类型的修饰构型来鉴定结合的特异性。含有末端修饰GalFucα2(缩写H5-2)、Fucα2和Gal/GalNAcα3(B6-2，A6-2)、Neu5Acα3或Neu5Acα6(唾液酸类红细胞糖苷脂)或Galα4(P1)的延长形式的Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer在结合幽门螺杆菌的检测中是没有活性的。结合还可以被含有β6-键合支链的内在半乳糖即Galβ4GlcNAcβ3(Galβ4GlcNAcβ6)Galβ4GlcβCer所示的结构破坏。支链改变了Galβ4GlcNAcβ3-表位的表达已经被证实，而二糖结合位点有可能受到了空间阻碍(Teneberg等，1994)。(然而结果表明被β3-键束缚的二糖或三糖结合表位的内在半乳糖残基也可以利于结合)。此外，Neu5Acα3GalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer(具有结合活性的x2-糖鞘脂的一种延长形式)或GalNAcβ3Galα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer(延长的B5 GSL)不表现出结合幽门螺杆菌的活性。
分子建模用于比较活性结合结构和非活性种类。四种五糖糖鞘脂(Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer加上GlcNAcβ3或GalNAcβ3或GalNAcα3或Galα3延长)适合的最低能量构象表明化合物的构象可以接近各自的模拟型。无活性糖脂的构象是不同的。尽管存在末端糖的端基异构键(两个α和两个β键)也不相同的事实，但分子建模显示最低能量结构在局部是非常近似的。末端结构的差别是Galα3缺乏一个存在于其它三个分子中的乙酰氨基，Gal和GaINAc在轴向有一个4-OH，在equiVatorial位置有GlcNAc，α-端基异构体的环状位面轻微升高至β-端基异构体相应的平面上。虽然Galβ4延长造成空间干扰，但GlcNAc的第四位允许末端延长也表明了4-OH对于结合是非常重要的。总的来说，由于所有的四种五糖糖脂对于幽门螺杆菌粘附素具有相近的亲合力，所以不管是4-OH的位置还是缺少/存在一个乙酰氨基或是末端单糖残基的端基异构结构均对于发生结合是至关重要的。
按照这些结合的原则，结合物质中的四种其它末端单糖也能提供三糖结合表位Galβ3Galβ4GlcNAc、GlcNAcα3Galβ4GlcNAc、Glcβ3Galβ4GlcNAc和Glcα3Galβ4GlcNAc。这些类似于研究序列的物质仅在端基异构、4-端基异构或C2 NAc/OH结构上存在差别。第一种物质存在于人类红血球的糖脂中，而迄今为止还不知道后三种是来自于人类的什么组织，但很有可能是天然受体的类似物。
已经表明结合表位包含活性五糖糖脂的末端三糖元件，并且至少含有大量的N-乙酰基乳糖胺，表位也可以存在于糖链中间。本发明人意识到结合表位可以以多种途径存在于天然或生物合成产生的糖缀合物和寡糖中，如糖蛋白和聚-N-乙酰基乳糖胺寡糖中以O-键或N-键连接的多糖，特别是在碳水化合物领域的化学和酶合成方法允许制备几乎是无限数量的衍生物和类似物。结合表位的大小可以有一些变化，例如末端单糖的C1、C2和C4的例子中，通过丢失非还原末端单糖或是从GIcNAcβ3Galβ4GlcNAc末端GlcNAc的C4位延长，如GIcNAcβ3的C4位可以通过糖苷键与寡糖链连接，当寡糖序列是GlcNAcβ3Galpβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc时，末端GlcNAcβ3的C4位可以通过糖苷结合方式与Galβ1-或寡糖链连接。尤其是三糖表位中的非还原末端单糖残基和表位中还原末端的C2和C4位可以用于制备具有结合幽门螺杆菌活性的衍生物和寡聚或多聚缀合物。单糖残基的C6位也可以用于生成衍生物和类似物，优选三糖序列的非还原末端残基和二糖和三糖结合物质的还原残基的C6位。
在本发明中，术语“类似物”和“衍生物”的定义如下。根据本发明有可能设计出结合幽门螺杆菌的寡糖序列的结构类似物和衍生物，因此，本发明还涉及本发明相关物质的结构类似物。相应于本发明的结构类似物包括幽门螺杆菌与寡糖序列结合的重要结构元件。为了设计有效的结构类似物，知道对于幽门螺杆菌和糖之间结合的重要结构元件是重要的。重要的结构元件优选没有进行修饰或对它们作了修饰但非常类似于重要结构元件。这些元件优选包括三糖和二糖表位中Galβ4残基的4-和6-羟基，而且环状结构之间的联结位置是一个重要的结构元件。为了达到高亲合力，结合乙酰氨基团或类乙酰氨基团优选位于相应于二或三糖表位还原末端GlcNAc中的乙酰氨基处。乙酰氨基类似基团可以是另一种酰胺，例如烷基胺，芳胺，仲胺，优选N-乙基或N-甲基，O-乙酰基，或O-烷基如O-乙基或O-甲基。为了高亲合力，优选结合具有的来自于末端糖醛酸羧酸基团的胺衍生物和其类似物。未修饰的糖醛酸的活性在低pH升高。
本发明的结构衍生物是根据本发明化学修饰的寡糖序列，这样会保持或提高与幽门螺杆菌的结合活性。根据本发明优选对寡糖序列的一或几种羟基或乙酰氨基进行衍生。本发明描述了当制备类似物或衍生物时几种可能被改变的分子位置。通过通式1的R-基团显示了可以容忍至少一定修饰的羟基或乙酰氨基。
至少当在Galβ4GlcNAc的C2、C3或C6-羟基位置或三糖表位的C3-羟基非还原末端单糖处连接时，大的或酸性取代的结构和其它结构如单糖残基是不能容忍的。生产结合凝集素的寡糖类似物的方法是已知的，例如，通过该方法已经生产出大量的唾液酸路易斯x寡糖类似物，这表明活性功能基团不同的支架结构，参见第12090页(Sears和Wong，1996)。肝磷脂寡糖的类似相似物已经由Sanofi公司生产，并且对于唾液酸酶的唾液酸模拟(mimicking)抑制剂如Zanamivir和Tamiflu(Relenza)也通过不同的团体制造出来。优选寡糖类似物建立在一种包含至少六或五元环结构的分子之上，更优选类似物含有至少两个由6或5个原子组成的环结构。寡糖的一种优选类似物类型包含与Galβ4GlcNAc-糖模拟结构连接的末端糖醛酸氨基化合物或其类似物。作为选择，末端糖醛酸氨基化合物是1-3-连接于Gal，然后与GlcNAc模拟结构连接。在模拟结构中，单糖环可以是取代环，诸如环己胺或环戊烷，包括苯环的芳香环，杂环结构可以包含边氧如氮和硫原子。为了保持活性环的构象，各种环结构可以通过耐受性连接基相互连接起来。典型的模拟结构还可以包含对于寡糖序列或其部分的缩氨酸类似物结构。
活性基团结合活性的效应是累积的，而且缺少的一个基团可以通过在分子对面增加一个活性残基来补偿。分子模型优选通过计算机构建并可以使用它来生产本发明所述的结合幽门螺杆菌的寡糖序列的类似物结构。通过实施例及其相同或相近的方法给出几种寡糖序列分子模型的结果，此外核磁共振和X-射线结晶学方法可以用来获得本发明所述的其它寡糖序列。寻找寡糖结构的类似物可以将研究集中于(docked)结合幽门螺杆菌的碳水化合物分子，最有可能的是细菌的凝集素，对另外可能存在的结合交互作用也可以进行研究。
通过本发明发现利用组合化学(combinatoryial chemistry)获得寡糖衍生物的方法可以将单价、低价或多价寡糖活化，使之对于凝集素具有较高的活性。当通过替换寡糖序列中一或几个残基构建文库时，该文库被认为是一个衍生物文库，或者文库可以由本发明所述的寡糖序列类似物组成，一个组合化学文库可以建立在本发明所述的寡糖或其前体或糖缀合物(glycoconjugate)之上，例如可以通过所谓糖化技术生产具有可变还原末端的寡糖。
组合化学文库的一个优选技术方案是使用与本发明描述的结合幽门螺杆菌的物质缀合的文库。在更优选的方案中文库包括至少6个不同的分子。优选的组合化学修饰是通过来自通式1中R8羧基的不同酰胺化合物来制备的。R8中修饰的基团还可以是一种醛或胺或另一种类型的反应基。根据本发明文库优选用于对与寡糖序列结合的微生物进行鉴定。氨基酸或有机氨组是通过商业途径可获得的，这些物质用于合成糖醛酸酰胺的组合文库。通过一种抑制检测，高亲合力的粘合剂可以从组合文库中鉴别出来，其中文库化合物用于抑制细菌与本发明所述糖脂或糖缀合物的结合。本发明优选的结构类似物和衍生物可以抑制本发明所述的能与结合幽门螺杆菌的的寡糖序列与幽门螺杆菌的结合。
在通用TLC-检测中，脂质部分或硅酸表面的近端引起的位阻可能限制了表位GlcNAcβ3Galβ4Glc的测定，在最近对艰难梭菌毒素的研究中使用该检测不能获得该序列的活性，该检测特异性识别了相同的四个针对这里所述幽门螺杆菌的三糖表位(Teneberg等，1996)。然而，其他人已经通过使用大聚合间隔区修饰的糖缀合物证实了Galα3Galβ4Glc与毒素A结合(Castagliuolo等，1996)。另外考虑到末端单糖对结合的作用表明Glc可以位于表位的还原末端，在非活性N-脱乙酰作用形式中，游离胺基的正电荷可能比存在羟基更具有破坏性。还原末端含有Glc的三糖表位被认为是以单价或优选多价形式存在的结合幽门螺杆菌物质的有效类似物。本发明的一个方案涉及在还原末端含有Glc的糖，该物质可以以高浓度的游离还原糖使用，浓度范围优选1-100g/l，更优选1-20g/l，可以意识到这些糖在浓度为0,1-1g/l时具有较低的活性。
以下结合幽门螺杆菌的序列是作为寡糖序列描述的。这里定义的寡糖序列可以是天然或合成糖缀合物、游离寡糖或游离寡糖的一部分。这种寡糖序列可以结合不同的单糖或低聚糖或涉及多糖链的多糖，例如假设该糖序列是作为细菌多糖的一部分表达。而且，众多单糖的天然修饰是已知的，例如O-乙酰基化或硫酸盐化的寡糖序列衍生物。结合幽门螺杆菌的物质在这里定义为含有寡糖序列的物质，该物质作为天然或合成糖缀合物的一部分或相应的游离寡糖或游离寡糖的一部分。结合幽门螺杆菌的物质还可以包含混合的结合幽门螺杆菌的寡糖序列。
在现在的检测中，几种受体寡糖序列的衍生物将结合减少至察觉限度以下，这说明了识别的特异性。结合数据显示如果所述寡糖序列具有GalNAcβ3连接到Galα3Galβ4GlcNAc上(替代序列GalNAcβ3Galα3Galβ4GlcNAc)或Neu5Acα3连接到GalNAcβ3Galβ4GlcNAc上(替代序列Neu5Acα3GalNAcβ3Galβ4GlcNAc)时，化合物是没有活性的。当所述寡糖序列是Galβ4GlcNAc时，它没有被α4-半乳糖基化(序列不是Galα4Galβ4GlcNAc)，α3-或α6-唾酸化(序列不是Neu5Acα3/6Galβ4GlcNAc)，α2-或α3-岩藻糖基化[所述寡糖序列不是Fucα2Galβ4GlcNAc或Galβ4(Fucα3)GlcNAc或Fucα2Galβ4(Fucα3)GlcNAc，提到的形成Lewisx的乳糖胺GIcNAc残基岩藻糖基化的α3-岩藻糖基化，Galβ4(Fucα3)GlcNAc]。具有Galβ3结合GIcNAcβ3结构(如Galβ3GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc/Glc)的糖与这里描述的结合幽门螺杆菌的物质相比具有不同的构象，已经对它们的结合特异性分别作了研究。结合幽门螺杆菌的物质可以是具有不同糖序列的糖链的一部分或一种糖缀合物或含有其它已知结合幽门螺杆菌的表位的糖缀合物混合物，例如Lewis b(Fucα2Galβ3(Fucα4)GlcNAc)或Neu5Acα3Galβ4Glc/GlcNAc。同时使用几种结合物质可以利于治疗。
结合幽门螺杆菌的寡糖序列可以通过糖基转移酶或糖苷酶转糖基化或转糖苷酶进行酶学合成(Ernst等，2000)，可以对这些酶的特异性和协同因子的使用进行人工改变。特定修饰的酶可以用于获得更有效的合成，例如糖基合成酶被修饰后只用来完成转糖基化作用。这里所述糖类或与它们的相似化合物的有机合成和缀合方法是已知的(Ernst等，2000)，糖原料可以从天然物质中分离和经由化学或酶学修饰成为幽门螺杆菌的结合化合物。天然寡糖可以从各种反刍动物、转基因生物如母牛或微生物产生的牛奶中分离，表达的糖基化酶可用于产生糖类。
通过现有技术中已知的方法可以获得本发明所述的糖醛酸单糖残基。例如，N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺的6-碳位的羟基可以被化学氧化成羧酸。氧化可以达到适当地保护寡糖或单糖。
在一个优选方案中，未-保护的聚合体或寡聚体包含己糖、N-乙酰己糖胺或己糖胺，其中单糖之间的键不处于6个碳原子之间，它们是1)氧化成相应的糖醛酸残基的聚合体或含有6-醛单糖单体的聚合体，2)任选自羧酸基或6-醛基衍生，优选衍生成一种酰胺或一种胺，和3)水解成糖醛酸单糖或糖醛酸衍生的单糖。
氧化单糖残基成为糖醛酸和化学或酶水解胺或糖醛酸聚合体的方法是本领域公知的，尤其优选使用纤维素、淀粉或具有1-2或1-3或1-4联接的其它葡聚糖、壳多糖(GIcNAc聚合体)或脱乙酰壳多糖(GlcN聚合体)低聚体或聚合体的方法，这些物质都是商业上广泛可获得的，或者N-乙酰半乳糖胺/半乳糖胺多糖(例如，已知来自于细菌的)被氧化成相应的1-4-联接糖。该方法还可以应用于半乳糖聚合体。糖醛酸衍生物还可以产自包含糖醛酸的天然聚合体如胶质或含有细菌多糖的葡糖醛酸包括N-乙酰肝磷脂、透明质酸和软骨素类型的细菌外源多糖。该方法包括1)多糖羧酸基的衍生，优选通过一个氨基化合物连接和，2)水解多糖为糖醛酸单糖或糖醛酸衍生单糖。
通过化学和酶学方法来氧化多糖碳6伯醇生成醛或羧酸也已经是公知的。醛可以被进一步衍生成如通过还原剂氨化作用产生的胺。优选末端Gal或GalNAc通过伯醇氧化酶如半乳糖酶氧化，然后进一步被胺等化合物衍生。
采用有机化学的常规方法可以使糖醛酸残基与二糖或寡糖缀合，或者通过葡糖醛酸基转移酶从UDP-GlcA上转移一个GlcA至末端Lac(NAc)上来连接GlcA。
模拟N-乙酰己糖胺(acetylhexosamine)的单糖衍生物可以产自含有己糖胺的聚合体或寡聚体或其它具有伯胺基的单糖，该方法包括1)胺基衍生成仲或叔胺或酰胺，2)水解聚合体成相应的单糖。
脱乙酰壳多糖和其寡糖是含有聚合体或寡聚体胺的实例。
通常，产生含有包含具有一或多个单糖的胺和/或酰胺的6-醛的羧酸的方法包括以下步骤1、在糖类聚合体中任选引入一个羧酸或6-醛基，其中伯羟基可用于修饰，2、衍生羧酸基或6-醛基或聚合体的伯胺基为仲或叔胺或酰胺，当步骤1进行了，步骤2是任选的，3、水解聚合体成相应的单糖。
还可以部分水解为单糖产生有用的二糖或寡糖来产生类似物。优选水解产生至少30％的单糖。生产化学制品步骤的方法是本领域熟知的，例如可以参照Muzzarelli等1999和2002描述的方法氧化多糖至相应的单糖。由于单糖没有采用保护或反应性还原末端，对于使用非保护的单糖这些方法是优选的。
在一个优选方案中，含有GIcAβ3Lac或GlcAβ3LacNAc的寡糖序列可以利用特异的葡糖醛酸酶如来自牛肝的葡糖醛酸酶通过转糖基作用可有效地合成。从中发现酶可以从β1-3键到Galβ4GlcNAc和Galβ4Glc进行位点特异性的转移，并且这种转糖基反应具有意想不到的高产量。通常这种选择性和近30％或更多的产量在转糖基反应中是不能获得的。
本发明的一个方案是含有寡糖序列[Gal(A)q(NAc)r/Glc(A)q(NAc)rα3/β3]s[Galβ4GlcNAcβ3]tGalβ4Glc(NAc)u并能够结合幽门螺杆菌的物质或受体，其中q、r、s、t和u分别独立为0或1，当t＝0和u＝0时，寡糖序列连接于一个多价的载体或以高浓度的游离寡糖存在，所述寡糖序列的类似物或衍生物具有结合幽门螺杆菌的活性，可以用来生产具有具有结合幽门螺杆菌活性的组合物。
上述的一个寡糖序列简要地说明了单糖残基的糖醛酸或单糖残基的碳6衍生物，最优选碳6衍生物是糖醛酸的酰胺。
本发明使用的结合幽门螺杆菌的物质优选下列寡糖序列Galβ4GlcNAc，
GalNAcα3Galβ4GlcNAc，GalNAcβ3Galβ4GlcNAc，GlcNAcα3Galβ4GlcNAc，GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc，Galα3Gaβ4GlcNAc，Galβ3Gaβ4GlcNAc，Glcα3Gaβ4GlcNAc，Glcβ3Gaβ4GlcNAc，Gaβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc，Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc，GalNAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc，GalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc，GlcNAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc，GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc，Galα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc，Galβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc，Glcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc，Glcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc，GalANAcβ3Galβ4GlcNAc，GalANAcα3Galβ4GlcNAc，GalAβ3Galβ4GlcNAc，GalAα3Galβ4GlcNAc，GalANAcβ3Galβ4Glc，GalANAcα3Galβ4Glc，GalAβ3Galβ4Glc，GalAα3Galβ4Glc，GlcANAcβ3Galβ4GlcNAc，GlcANAcα3Galβ4GlcNAc，GlcAβ3Galβ4GlcNAc，GlcAα3Galβ4GlcNAc，GlcANAcβ3Galβ4Glc，GlcANAcα3Galβ4Glc，GlcAβ3Galβ4Glc，GlcAα3Galβ4Glc，Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc，和其还原末端多价缀合物，以及GalNAc3Galβ4Glc，GalNAcβ3Galβ4Glc，GlcNAcα3Galβ4Glc，GlcNAcβ3Ga lβ4Glc，Galα3Galβ4Glc，Galβ3Galβ4Glc，Glcα3Galβ4Glc，和Glcβ3Galβ4Glc。
本发明的另一个方案如通式1所描述的 -A-糖 B-糖本发明和本发明的用途优选的结合幽门螺杆菌的物质或混合物是基于通式1的寡糖结构，其中整数l、m和n的值为m≥1，l和n各自为0或1，其中R1是H和R2是OH或R1是OH和R2是H或R1是H和R2是单糖基或寡糖基优选一个β糖苷连接的半乳糖基，R3独立地为-OH或乙酰氨基(-NHCOCH3)或一种乙酰氨基类似基团，R7是乙酰氨基(-NHCOCH3)或一种乙酰氨基类似基团。当l＝1，R4是-H且R5是氧连接于键R6上，形成到糖B的β端基异构配糖连接(anomericglycolsidic linkage)，或R5是-H且R4是氧连接于键R6上，形成到糖B的α端基异构配糖连接；当l＝0，R6是与B连接的-OH。X是单糖或寡糖残基，优选X是乳糖基、半乳糖基、聚-N-乙酰-乳糖胺，或O-聚糖或N-聚糖寡糖序列的一部分，Y是间隔基团或末端缀合物如神经酰胺脂质部分或到Z的键。Z是一种低价(oligovalent)或多价载体。结合物质还可以是根据通式1所述的具有结合幽门螺杆菌活性的物质的类似物或衍生物，例如B糖Cl位和糖残基X或间隔基团Y之间的氧键(-O-)可以由碳(-C-)、氮(-N-)或硫(-S-)键代替。
通式1中R8优选羧酸酰胺，例如甲基酰胺或ethyalamide、羟甲基(-CH2-OH)或羧酸基，或其酯如甲基或乙基酯。羧酸氨基可以包括与多价载体Z的一种选择性联接，其中载体包括胺如脱乙酰壳多糖或半乳糖胺多糖，或者Z包括含有间隔基团的初级胺，优选一种亲水的间隔基。R8中的结构还可以是上述本领域公知的模拟结构，例如可以使用仲或叔胺或酰胺化仲胺。
在通式1中R9优选羟甲基，但它可以如对R8描述的用于衍生物。R3是羟基、乙酰氨基或乙酰氨基模拟基，如C1-6烷基酰胺、芳基酰胺、仲胺，优选N-乙基或N-甲基、O-乙酰基或O-烷基如乙基或O-甲基。R7同R3，但更优选乙酰氨基或乙酰氨基模拟基。
R2还可以优选包含一个六元环结构模拟的Galβ4末端。
细菌结合物质优选以丛生形式出现，如通过细胞膜、微团、脂质体形式上的糖脂，或存在固相上如检测中使用的TCL-板。具有恰当间隔的丛生表达产生了高亲合力的结合。
依照本发明还涉及结合幽门螺杆菌的表位或针对幽门螺杆菌具有相近或更好结合活性的天然存在或合成产生的其类似物或衍生物的可能应用。依据本发明还涉及含有细菌结合物质如本发明所述的受体活性神经节苷脂或其类似物或其衍生物的物质的可能应用，该物质具有针对幽门螺杆菌相近或更好的结合活性。细菌结合物质可以是一种糖基连接的寡糖链末端表位。细菌结合表位还可以选择是寡糖链的支链，优选一种聚乳糖胺链。
可以将结合幽门螺杆菌的物质缀合至抗生素，优选青霉素类抗生素。结合幽门螺杆菌的物质将抗生素靶向在幽门螺杆菌上。这类缀合是有利于治疗的，因为由抗幽门螺杆菌的处理和治疗需要的抗生素量很少，这导致抗生素的副作用更低。缀合物的抗生素部分目标是杀灭或削弱细菌，但缀合物也可具有下述抗粘附作用。
优选低价或串形式中的细菌结合物质可以用于治疗由于幽门螺杆菌存在引起的疾病或症状，可以使用结合幽门螺杆菌的物质抗粘附，例如抑制幽门螺杆菌与靶细胞或组织受体的表位结合。当给予了结合幽门螺杆菌的物质或药用组合物时，它将在靶细胞上与受体糖缀合物竞争结合细菌。然后某些或全部细菌将结合结合幽门螺杆菌的物质而不是靶细胞或组织表面的受体。然后细菌附着于结合幽门螺杆菌的物质排出患者体外(例如通过体液在胃肠道的流动)导致细菌对患者健康的影响减弱。优选使用的物质是包括结合幽门螺杆菌的物质的可溶性组合物。也可以将物质附着于载体物质上，该物质优选不是蛋白。当使用载体分子时，可以将结合幽门螺杆菌的物质的几种分子附着于同一载体上，以此改进抑制效果。
靶细胞优选靶组织尤其是胃肠道的上皮细胞，其它潜在靶组织例如肝脏和胰腺，病原体的感染可以改变靶组织的糖基化(Karlsson等，2000)。靶细胞还可以是靶组织中的恶性的、转化的，或是癌/瘤细胞。转化的细胞和组织表达改变类型的糖基化，这样可以提供细菌的受体。凝集素或糖与糖蛋白或糖脂上的糖类结合(糖类-糖类相互作用)可以激活细胞，如果是癌/恶性细胞就可能导致癌的生长或转移。这里描述的几种寡糖表位如GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc(Hu，J.等，1994)、Galα3Galβ4GlcNAc(Castronovo等，1989)和来自于恶性细胞的中性和唾液酸化聚乳糖胺(Stroud等，1996)已经被报道是癌相关的或癌抗原。来自于淋巴球并含有这里所述物质的寡糖链也已经被描述(Vivier等，1993)。幽门螺杆菌与胃淋巴瘤相关，这里所述物质可以用于抑制幽门螺杆菌与恶化前或恶化的细胞的结合以及抑制癌的发展或转移的活化。对结合的抑制可以治疗胃癌，尤其是淋巴癌。据报道在来自于人胃粘液素的结构GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6GalNAc中存在结合幽门螺杆菌的寡糖序列，该粘液素表位和相似的O-聚糖糖形式是人胃中最有可能的幽门螺杆菌天然高亲合力的受体，类似物序列GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6GlcNAc作为新糖脂(neoglycolipid)与幽门螺杆菌高亲合力的结合以及在某些检测中序列GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6Gal也具有某些结合活性。因此优选的寡糖序列包括O-聚糖及O-多糖序列的类似物，如GIcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6GlcNAc/GaINAc/Gal，GIcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6GlcNAc/GaINAc/GalαSer/Thr，GIcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6(Gal/GlcNAcβ3)GlcNAc/GaINAc/GalαSer/Thr以及糖肽和糖肽类似物包括O-多糖序列。即使缺少非还原末端GlcNAc的序列也具有某些活性。基于此，当连接还原末端形成结构OSβ6Gal(NAc)0-1或OSβ6Glc(NAc)0-1或OSβ6Gal(NAc)0-1αSer/Thr或OSβ6Glc(NAc)0-1αSer/Thr连接时，所有其它的结合幽门螺杆菌的寡糖序列(OS)、尤其是三糖表位也是特别优选的。当与多价载体连接时，Ser或Thr化合物或其类似物或还原性寡糖也是优选的。还原性寡糖可以被还原性地连接到多价载体上。
靶细胞还可以包括血细胞，尤其是白血球。现已知与胃溃疡相关的幽门螺杆菌菌株，就如这里主要使用的菌株一样能刺激来自粒细胞的炎症反应(Rautelin等，1994a，b)，即使是细菌不易受调理素的作用时。细菌嗜菌作用中的初始事件最有可能包括特异性的类凝集素交互作用，该作用会导致粒细胞的粘合(Ofek和Sharon，1988)。吞噬事件之后存在氧化破裂反应(burstreaction)，它是导致幽门螺杆菌相关疾病的发病机理(Babior，1978)。从粒细胞分离并鉴定几种包括N-乙酰乳糖胺重复单位的唾液酸化和非-酸糖鞘脂(Fukuda等，1985；Stroud等，1996)，因此可作为存在于白血球细胞表面的结合幽门螺杆菌的潜在受体。而且，X2糖鞘脂分离自相同的来源(Teneberg，S.，未出版)。本发明证实了人类红血球和粒细胞上的受体糖类的存在，它们可以通过一种N-乙酰乳糖胺特异性的外源凝集素和一种单克隆抗体(x2，GalNAcβ3Galβ4GlcNAc-)加以识别。结合幽门螺杆菌的物质可用于抑制白血球与幽门螺杆菌的结合以及防止发生氧化作用和/或白血球活化后的炎症反应。
已知幽门螺杆菌可以结合几种寡糖序列。特异性菌株引起的某些结合可能代表了某些不能导致癌或严重症状的共生的交互作用。关于结合癌-型糖类表位的已有数据表明结合幽门螺杆菌的物质可以抑制进一步的病理反应，这之中它可以允许某些更少病原性幽门螺杆菌细菌/菌株与其他的受体结构结合。因此全部消除细菌对于抑制幽门螺杆菌相关疾病不是必须的，较少的病原性细菌甚至可以对抑制更多的幽门螺杆菌致病性菌株产生前生命期效应。
通过本发明也可以理解到幽门螺杆菌含有大的聚乳糖胺寡糖在其表面，而且至少在某些菌株中含有本发明所述的能被细菌粘附的非藻糖基化表位。这里描述的物质还可以抑制幽门螺杆菌细菌之间的结合，从而抑制细菌的定居过程。
根据本发明的描述也可以混合结合幽门螺杆菌的物质，优选附着于载体上，以药用组合物的形式，该组合物用于治疗由患者体内的幽门螺杆菌引起的症状，或是结合幽门螺杆菌的物质在治疗这种疾病的方法中的用途。根据本发明可治疗的疾病的例子有慢性浅表性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、人胃部非霍奇金淋巴瘤、胃腺癌，或某些胰腺、皮肤、肝脏或心脏疾病，婴儿猝死综合症，自体免疫疾病包括自体免疫胃炎和恶性贫血以及全部或至少是部分由幽门螺杆菌感染引起的非-类固醇抗炎症药物(NSAID)相关疾病。
含有结合幽门螺杆菌的物质的药用组合物还可以包含其他物质，如惰性赋形剂，或药学上可接受的载体、防腐剂等，这些是本领域技术人员熟知的。结合幽门螺杆菌的物质可以与其他用于抗幽门螺杆菌的药物如抗生素一起给药。
含有这种物质的结合幽门螺杆菌的物质或药用组合物可以以任何方式给药，但优选使用口服给药。
本文使用的术语“治疗”既涉及为治愈或减轻疾病进行的治疗，也涉及为预防疾病或症状发展而进行的治疗。治疗可以以急性方式或者慢性方式进行。
本文使用的术语“患者”涉及任何按照本发明需要治疗的人类或非人哺乳动物。
通过筛选能连接结合幽门螺杆菌的物质的蛋白质或糖类(通过碳水化合物-碳水化合物之间的互作)，结合幽门螺杆菌的物质可用来鉴别一种或多种粘附素。
糖类结合蛋白可以是一种外源凝激素或糖类结合酶。
可以通过如亲合层析或亲合交联法来进行筛选(Ilver等，1998)。
而且，可使用存在于人组织中的特异结合或阻止结合幽门螺杆菌的物质的物质并因此防止幽门螺杆菌的结合。这种物质的例子包括植物凝集素如Erythrina cristagalli和Erythrina corallodendron(Teneberg等，1994)。当用于人体时，该结合物质必须适宜于这种使用，例如人源化的抗体或来源于人的重组糖苷酶，其是非-免疫原性的并能从结合幽门螺杆菌的物质裂解末端的一或多个单糖残基。但在胃肠道中，对源于例如食物的多种天然凝集素和糖苷酶是耐受的。
而且，也可能将结合幽门螺杆菌的物质作为天然组合物包括食物和营养组合物的部分使用。优选将结合幽门螺杆菌的物质作为功能性或实用性食物的一部分，该功能性食物能够抑制或防止幽门螺杆菌与靶细胞或组织的结合，从而有利于人或动物的健康。结合幽门螺杆菌的物质可以是定义的食物或功能性营养组合物的一部分，该功能性食物可以包含其它可被如美国食品或药品管理局的权威机构接受的食物成分。结合幽门螺杆菌的物质还可以用于营养添加剂中，优选作为食物或饮料添加剂来生产功能性食物或功能性饮料。食物或食物添加剂还可以通过使驯养动物如奶牛或其它动物在乳汁中产生大量的结合幽门螺杆菌的物质。这可以通过使动物在其乳汁中过表达合适的糖基转移酶来完成。可选择并饲养特殊种系或种属的驯养动物以获得大量的结合幽门螺杆菌的物质。用于营养组合物或营养添加剂中的结合幽门螺杆菌的物质也可使用微生物如细菌或酵母来生产。
结合幽门螺杆菌的物质尤其可作为婴幼儿食物或营养组合物的一部分使用，优选作为婴儿配方食物的一部分。许多婴儿是用特殊的配方代替天然人乳的一部分。配方可能缺乏人乳中特定的以乳糖为基础的寡糖，尤其是延长类型的乳糖如乳-N-新四糖，Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc，及其衍生物。已知乳-N-新四糖和对-乳-N-新己糖(Galβ4GlcNAcβ3Gal4GlcNAcβ3Galβ4Glc)以及Galβ3Galβ4Glc来自于人乳并因此认为是婴儿食物的安全添加剂或成分，考虑到其随后导致的疾病而预防其感染是明智的。也已知幽门螺杆菌能引起婴儿猝死症，但用于根治细菌的强抗生素治疗可能对婴幼儿极为不合适。
在功能性食物中添加的人乳寡糖的浓度(例如，在一种婴儿的再生配方中)优选接近于天然人乳中存在的浓度。众所周知天然人乳中含有大量游离寡糖和包含本发明描述的寡糖序列的糖缀合物(可以是多价的)，因此有可能使用甚至高于天然浓度的单一分子来和获得强烈的抗幽门螺杆菌的抑制效应，并且同时没有有害的负作用。天然人乳中含有除了个别差异外至少浓度范围为10-210mg/l的乳-N-新四糖(Nakhla等，1999)，因此，用于功能性食物中的乳-N-四糖的浓度范围优选0.01-10g/10，更优选0.1-5g/l，最优选0.1-1g/l。当这里描述的游离寡糖是在还原末端具有Galβ4Glc的三糖或二糖时，优选添加的浓度为1-100g/l，更优选浓度范围为1-20g/l。作为选择，其在功能性食物中使用的总的浓度与天然人乳中乳糖类的浓度相同或相似，这些乳糖类包括象描述的结合幽门螺杆菌的物质，或是本发明所述的包含结合表位/寡糖序列的物质。至少有一例报道称人乳中含有一种以高浓度存在的主要的中性寡糖Galβ3Galβ4Glc(Charlwood等，1999)。
另外，有可能将结合幽门螺杆菌的物质用于诊断由幽门螺杆菌感染引起的疾病，诊断用途还包括使用结合幽门螺杆菌的物质来对幽门螺杆菌进行分型。当该物质用于诊断或定型时，它可以包括如探针或测试棒中，优选构成试剂盒的组成部分。当将此探针或测试棒与包含幽门螺杆菌的标本接触时，细菌将与探针或测试棒结合并且因此能从标本上分离以作进一步分析。
结果还表明在本发明优选的三糖序列的非还原末端单糖残基可以在碳6位包含一个羧酸基团(末端单糖残基是糖醛酸，HexA或者HexANAc，其中Hex是Gal或Glc)，或HexA(NAc)残基碳6位的衍生物，或碳6位相应于Hex(NAc)残基的碳6衍生物。这种末端残基优选包括β3-连接的葡糖醛酸和更优选其6-酰胺如甲酰胺。因此序列类似物或衍生物可以通过对三糖表位的末端6-位进行改变或衍生产生。
优选的结合幽门螺杆菌的物质当存在于薄层表面时，可以发现本发明所述的寡糖序列是一种非显而易见的有效的结合剂。该方法允许糖脂序列的多价表达(presentation)，寡糖序列多价表达的惊人高活性形成多价的一种优选方法来表现本发明的寡糖序列。
糖脂结构以多价形式天然存在于细胞膜上，这种类型的代表可以通过以下描述的固相检测或制备糖脂或新糖脂的脂质体来模拟。
通过疏水十六烷基苯胺的还原性氨化产生所述的新的新糖脂(neoglycolipid)可以提供寡糖有效的表达。大多数先前知道的用于结合细菌的新糖脂糖缀合物含有一个负电荷基团，如磷脂酰(phosphadityl)乙醇胺新糖脂的磷脂。这种化合物的问题在于该物质带有负电荷并且其磷脂结构内存在天然生物学的结合。在众多与蛋白和其他生物学物质的非-特异性结合中，负电荷分子的作用是已知的。而且，许多这样的结构是易变的，可以被酶促或化学降解。本发明涉及寡糖序列的非-酸性糖缀合物，其意思就是寡糖序列与非-酸性化学结构结合。优选的，非-酸性糖缀合物是中性的，其意思就是寡糖序列是与中性的、不带电的化学结构连接。根据本发明优选的糖缀合物是多价物质。
现有技术中常常通过还原部分受体活性寡糖结构将具有生物活性的寡糖序列附着于载体结构上。已经使用了含有链(-CH2-)n和/苯甲基环的疏水性间隔基团，然而，蛋白与其它生物活性分子的非特异性互作与疏水结构相关是公知的。
随后实施例的新糖脂数据表明，在检测中使用的试验条件下，新糖脂化合物中的十六烷基苯胺部分不能引起与所研究细菌的非-特异性结合。在新糖脂中，糖缀合物的十六烷基苯胺部分可能形成了一个脂质层似结构并不适宜于结合。本发明表明属于结合表位的还原性单糖残基可以破坏结合，这也使得我们进一步了解到还原单糖可以用作亲水的间隔基团来连接受体表位和多价的表达结构。根据本发明优选经由亲水间隔基团将生物活性寡糖与多价或多化合价(multivalent)的载体分子连接以形成多价或低价/多化合价的结构。这里优选作为多价结构的所有多价(包含10个以上寡糖残基)和低价/多化合价结构(包含2-10个寡糖残基)，尽管这依赖于应用，但低价/多化合价结构可能更优选大的多价结构。亲水的间隔基优选包括至少一个羟基，更优选包括至少两个羟基，最优选包含至少三个羟基。
根据发明亲水间隔基优选是包含一或几个-CHOH-基的柔性链和/或一种酰胺侧链如乙酰胺-NHCOCH3或烷基酰胺。羟基基团和/或乙酰胺基团都能保护来自于体内酶水解产生的间隔基团。术语“柔性的”指间隔基团包含柔性键并且没有柔性时不能形成环状结构。本发明中通过还原性氨化等形成的还原单糖残基是柔性亲水间隔基团的例子。柔性亲水间隔基团是避免新糖脂或多价缀合物的非特异性结合的优选。例如，在生物检测及对药物或功能性食物的生物活性的基本最佳活性。
例如，一种具有柔性亲水接头的缀合物通式具有以下的通式2[OS-O-(X)n-L1-CH(H/{CH1-2OH}p1)-{CH1OH}p2-{CH(NH-R)}p3-{CH1OH}p4-L2]m-Z其中L1和L2是连接基团，它们各自独立含有氧、氮、硫或碳键合原子或两个联接的原子，这些原子形成的化学键如-O-，-S-，-CH2-，-N-，-N(COCH3)-，酰胺基团-CO-NH-或-NH-CO-或-N-N-(肼衍生物)或氨基氧-键-O-N-和-N-O-。L1是自X的还原末端单糖的碳1位的键，或者当n＝0时，L1代替氧键并直接从OS的还原性末端C1起连接。
p1、p2、p3和p4分别独立为从0到7的整数，限制条件是p1、p2、p3和p4中至少一个至少为1。在支链形式{CH1-2OH}p1中的CH1-2OH表明链的终止基团是CH1-2OH，而且当p1大于1时仲醇基-CHOH-将终止基团与间隔基团的剩余部分连接起来。R优选乙酰基基团(-COCH3)或R是一种与Z连接的可选择的键，然后L2是一或二原子链终止基团。在另一个方案中，R是一种包含含有形成胺的酰胺结构或H或C1-4烷基的C1-4酰基基团(优选亲水的如羟烷基)的类似物形成基团，而且m＞1，Z是多价载体，OS和X已经在通式1中作了定义。
优选的多价结构包括相应于通式2中所述的一个柔性的亲水间隔基团。结合幽门螺杆菌的寡糖序列(OS)β1-3与Galβ4Glc(red)-Z和OSβ6GalNAc(red)-Z连接，其中“(red)”指通过将末端单糖和多价载体Z的氨基基团进行还原性氨化作用形成的胺键结构。
在本发明中，寡糖基团优选以一种多价或低价形式与载体连接，其中载体不是一种蛋白或肽，从而可以避免抗原性和可能的过敏反应，优选骨架是一种天然非抗原性的多糖。
当对糖脂和新糖脂的结合活性进行比较时，发现含有Galα3Galβ-的序列在薄层板上进行多价表达中具有较低的活性，末端带有Galβ4GlcNAc-的序列的活性还要更弱一些。因此依据本发明的最佳多价非酸性物质包括一种末端寡糖序列Gal(A)q1(NAc)r1/Glc(A)q2(NAc)r2α3/β3Galβ4Glc(NAc)u，其中q1、q2、r1、r2和u分别各自为0或1，具有限制性的是当q1和r1都为0时，非还原性末端终止单糖残基就不是Galα。更优选u＝0，最优选以多价形式存在的寡糖序列GalNAc/Glc(NAc)r2α3/β3Galβ4GlcNAc其中r2独立为0或1，并且是其一种类似物或衍生物。
随后的寡糖序列是特别优选的，这些代表结构还未被从人或动物组织的组织描述过，如Glc(A)q(NAc)rα3/β3Galβ4Glc(NAc)u，其限制性条件是当寡糖序列含有β3键时，q和r为1或0；或者GalA(NAc)rα3/β3Galβ4Glc(NAc)u。
上述寡糖序列的新颖性使得它们成为特别优选的方案，还没有已知的剪切这种序列的糖苷酶。因此，这种序列是尤其稳定的并且优选处于生物学环境下。本发明所述序列的天然形式可被糖苷酶剪切，从而当用于人体或动物体时，减少了它们的有效性。已知剪切序列的糖苷酶在人胃肠道中是具有活性的。几种糖苷酶如N-乙酰己糖胺酶或半乳糖苷酶已经被作为消化酶描述过，并且还存在于食物材料中。
根据本发明可以认识到新物质还可用于抑制艰难梭菌S.的毒素(Teneberg等，1996)。毒素A与已知物质的结合情形与这里描述的幽门螺杆菌的特异性相似。因此，结合幽门螺杆菌的物质可以用于治疗，如由艰难梭菌引起的腹泻。
糖脂和糖类命名法遵循IUPAC-IUB生化命名委员会(BiochemicalNomenclature)中的建议(Carbohydrate Res.，1998，312，167；CarbohydrateRes.，1997，297，1；Eur.J.Biochem.1998，257，29)。
设想Gal、Glc、GlcNAc和Neu5Ac是D-构型，Fuc为L-构型，并且所有的糖以吡喃形式存在。葡糖胺指GlcN或GlcNH2等，半乳糖胺指如GaIN或GalNH2。糖苷键的命名法部分遵循简略命名法，部分遵循长命名法，Neu5Ac-残基α3和α6之间的键分别与α2-3与α2-6相似，与其它单糖残基α1-3、β1-3、β1-4和β1-6分别可以缩写为α3、β3、β4和β6。乳糖胺指N-乙酰乳糖胺，Galβ4GlcNAc，和唾液酸是N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)或N-羟乙醛基神经氨酸(Neu5Gc)或任何其他天然唾液酸。
术语聚糖在这里指存在于人或动物糖缀合物中尤其是糖脂或糖蛋白上广泛的寡糖或多糖链。在脂肪酸和碱的速记命名法中，冒号前的数字指碳连长度，且冒号后的数字指分子中双键的总数。缩写GSL指糖鞘脂。缩写或短命名或符号在本文中和表1和2中给出。幽门螺杆菌还指与幽门螺杆菌相似的细菌。
对本发明中十六(NAc)-糖醛酸和它们的衍生物和残基作以下的说明GlcA是葡糖醛酸和葡萄糖或葡糖醛酸碳6衍生物，GalA是半乳糖醛酸和半乳糖或半乳糖醛酸碳6衍生物，GlcANAc是N-乙酰葡糖醛酸和N-乙酰葡糖胺碳6衍生物或是N-乙酰氨基葡萄糖糖醛酸碳6衍生物，和GalANAc是N-乙酰半乳糖胺糖醛酸及N-乙酰半乳糖胺或N-乙酰半乳糖胺糖醛酸碳6衍生物。
“末端寡糖序列”的措辞意思是寡糖没有被另一种单糖残基取代非还原性终端残基。
术语“α31β3”表明寡糖序列中的相邻残基可以通过α3-orβ3-1相互连接。
本发明用以下的实施例作进一步的详述，但决不是用此来限定本发明的范围。
实施例材料与方法材炉-TLC硅胶60(铝)板来自于Merck(Darmstadt，德国)。所有研究的糖鞘脂都是在本实验室获得。β-半乳糖苷酶(埃希氏大肠杆菌)购自Boehringer Mannheim(德国)，Ham′s F12培养基来自于Gibco(U.K.)，35S-甲硫氨酸从Amersham(U.K.)获得，FCS(胎牛血清)从Sera-Lab(英国)获得。β4-半乳糖苷酶(肺炎链球菌)、β-N-乙酰己糖胺酶(肺炎链球菌)和唾液酸酶(Arthrobacter ureafaciens)来自于牛津GlycoSystems(Abington，U.K.)。分别来自于胃炎患者和十二指肠溃疡患者的临床分离出的幽门螺杆菌(菌株002和032)赠自于D.Danielsson博士(Orebro医学中心，瑞典)。典型菌株17875来自于Gteborg大学(CCUG)的培养收集。
糖鞘脂_图7A和7B显示的试验用纯化糖鞘脂通过所述列于表2(Karlsson，1987)来源的总的酸性或非酸性片段来制备。通常，个别糖鞘脂通过对总糖鞘脂级分乙酰化(Handa，1963)并且在硅酸柱上重复进行色谱而将各个糖鞘脂分离，纯化的糖鞘脂用质谱法(Samuelsson等，1990)、波谱(Falk等，1979a，b，c；Koerner Jr等，1983)和降解研究(Yang和Hakomori，1971；Stellner等，1973)进行结构鉴定。后面将对来源于兔胸腺的糖脂进行描述。
纯化糖脂 从1000g兔胸腺丙酮粉中分离出酸性糖鞘脂(Pel-FreezeBiological Inc.，North Arkansas，Ark.US)。丙酮粉在Soxhlet装置上用氯仿/甲醇2∶1(体积比，除非另有说明)萃取24小时，接着用体积比为8∶1∶1的氯仿/甲醇/水提取36小时。提取的240g脂质进一步用Folch法分离(Folch等，1957)并通过DE23纤维素离子交换凝胶色谱收集亲水相(DEAE，Whatman，Maidstone，UK)。经过分离步骤获得2.5g酸性糖鞘脂。用开放管状色谱法通过离子交换凝胶在玻璃柱上根据硅酸的数量分离神经节苷脂(50mm i.d)。柱与HPLC泵连接产生一种凹面(concave)梯度(pre-rogrammedgradient no 4，System Gold Chromatographic Software，BeckmanInstruments Inc.，CA，USA)，开始使用甲醇，用溶于甲醇的0.5M CH3COONH4终止。以流速4ml/分钟收集200种级分，每一级分8ml。将300-400mg神经节苷脂混合物同时加样在500g的DEAE琼脂糖上(CL6，Pharmacia，Uppsala，瑞典，基准高度约为130mm)。单唾液酸神经节苷脂在300mm×22mm硅柱(孔径为120，10μm粒子孔径，SH-044-10，Yamamura Ltd.，Kyoto，Japan)上进一步经HPLC分离。获得约150mg单唾液酸神经节苷脂并通过强的洗提梯度洗脱(氯仿/甲醇/水的体积比从60/35/8到10/103，流速为4ml/min，240级分)。
部分酸水解 在100℃时在1.5％的CH3COOH水溶液中对神经节苷脂进行脱唾液酸作用，获得物质经NaOH中和并在氮环境中干燥。为了部分降解碳水化合物骨架，在0.5M HCl中将糖脂置于热水浴中水解7分钟。这样该物质被中和并通过C/M/H20(8∶4∶3，v/v)2进行分离。收集下相，氮下蒸发，回收的糖脂用于分析。
通过酶水解六糖基神经酰胺制备五糖基神经酰胺 通过酸性脱唾液酸作用得自七糖基神经酰胺(4mg，来自于兔胸腺)(结构1，表1)的六糖基神经酰胺(结构2，表1)溶解于C/M(2∶1)并经硅胶柱(0.4×5cm)纯化，用C/M/H20(60∶35∶8，v/v)洗脱。收集到约0.2ml的级分并将之用于检测糖类的存在。回收的六糖基神经酰胺(2.0mg)溶于1.5ml 0.1M的磷酸钾缓冲液，该缓冲液pH为7.2，其中含有牛磺酸脱氧胆酸钠(1.5mg/ml)、MgCl2(0.001M)和β-半乳糖苷酶(大肠杆菌，当用2-硝基苯-β-D-半乳糖苷作为底物检测时500U)，样本在37℃过夜培养，将物质置于C/M/H20(10∶5∶3)中进行分离并收集含有糖脂的下相，然后使用上述用于六糖基神经酰胺的硅胶柱层析(0.4×5cm柱)法纯化获得糖脂。为了移走所有污染的洗涤剂，将层析重复两次，回收的五糖基神经酰胺的终产量为0.7mg。
内源糖基神经酰胺酶消化糖脂(Ito和Yamagata，1989) 反应混合物包含200μg糖脂、80μg牛磺脱氧胆酸钠和由pH6.0的160μl 50mM的醋酸盐缓冲液稀释的0.8mU的酶，样品37℃过夜温育后，加水(140μl)和C/M(体积比为2∶1，1500μl)，对样品进行振荡和离心。在氮气中干燥上相，并将之溶于少量的水后在Sephadex G-25柱(0.4×10cm)上脱盐，该柱在H2O中平衡并用水洗脱。收集到0.1ml的级分并将之用于检测糖的存在。
糖的过甲基化 根据Larson等1987年报道的方法对糖进行过甲基化。按照Needs和Selvendran 1993年建议的在甲基碘化物加入样本之前加入氢氧化钠。在某些实验中，在糖基甲基化之前用NaBH4进行还原。在该例子中甲基碘化物的量增至终比率为DMSO(二甲基亚砜)/甲基碘化物为1∶1(Hansson和Karlsson，1990)。
气相色谱法/质谱法 气相色谱在Hewlett-Packard 5890A系列II气相色谱仪上进行，该色谱仪装备有一个柱注入器和一个火焰离子检波器。过甲基化的寡糖在一个覆盖有交联PS264(膜厚0.03μm)熔化的硅毛细管柱(Fluka，1 lm×0.25mm i.d.)上分析，将样品溶于乙基醋酸盐溶液并在80℃时注射入进样柱(on-column)，柱内温度以10℃/min的速度从80℃升至390℃。寡糖的过甲基化气相色谱法-质谱法在Hewlett-Packard5890A系列II气相色谱仪连接JEOL SX-102质谱仪(Hansson和Karlsson，1990)上进行，通过使用Xe原子轰击(10kV)和三乙醇胺作为基质产生阴性FAB光谱。
NMR波谱 在Jeol Alpha 500(Jeol，Tokyo，Japan)波谱仪上于11.75T获得质子NMR波谱。样品在分析之前进行氘交换，在30℃用0.35Hz/pt的数字分辨记录波谱。使用内在溶解信号给出相对于TMS(四甲基矽甲烷)的化学位移。
分析性酶促试验 根据使用手册的说明进行Oxford GlycoSystems酶促试验，除了在每个温育的混合物中加入Triton X-100至终浓度为0.3％，当唾液酸酶和β4-半乳糖苷酶混合物用来消化时，采用来自β4-半乳糖苷酶试剂盒的温育缓冲液；如果在消化混合物中存在β-己糖胺酶时相应地使用该酶试剂盒的缓冲液。温育混合物中酶浓度为Hexβ4HexNAc-半乳糖苷酶(S.pneumoniae)为80mU/ml，对于β-N-乙酰己糖胺酶(S.pneumoniae)为120mU/ml，和唾液酸酶(Arthrobacter ureafacielns)为1U/ml。底物浓度为约20μM。37℃下酶消化过夜。消化后，干燥样品，采用Sephadex G-25小柱脱盐(wells and Dittmer，1963)，0.3g，在C/M/H2O(60∶30∶4.5，v/v)平衡。每一样品上柱为同样溶剂中2ml，采用2.5ml C/M/H2O(60∶30∶4.5，v/v)和2.5mlC/M(2∶1)洗脱。收集加样和洗涤溶液并在氮气中使之挥发。
其它分析方法 己糖根据Dubois等(1956)的方法来确定。
脱-N-酰化作用 通过用前述的(Angstrom等，1998)无水肼处理各种糖鞘脂，将GlcNAc/GalNAc残基乙酰氨基部分转化为胺。
细菌生长 将幽门螺杆菌株贮存在-80℃含有15％甘油(按体积)的胰蛋白酶大豆培养基中，细菌首先在GAB-CAMP琼脂(Soltesz等，1988)上以湿度(98％)微需氧条件(5-7％的O2，8-10％的CO2，和83-87％的N2)于37℃培养48-72小时。为进行标记，将菌落接种于GAB-CAMP琼脂上，除了图1A和1B显示的结果，另外还替代使用了Brucella琼脂，同时向平板上喷洒用0.5ml磷酸缓冲液(PBS)稀释的pH7.3的50μCi35S-甲硫氨酸(Amersham，U.K.)。在微需氧条件下于37℃培养12-24小时后将细胞刮下，用PBS洗涤三次，并在PBS中重悬成1×108CFU/ml。或者，将菌落接种于添加了10％热灭活的胎牛血清(Sera-Lab)的Ham′s F12培养基(Gibco BRL，U.K.)中。为进行标记，按每10ml培养基50μCi35S-甲硫氨酸的量加入35S-甲硫氨酸，将培养基在37℃微需氧条件下振摇保温24小时。经离心收集细菌细胞，并纯化培养基和经相差显微镜检测以确保球菌形式含量很低。用PBS洗涤两次后将细胞在PBS中重悬成1×108CFU/ml。两种标记方法得到每100个幽门螺杆菌大约1cpm比活性的悬液。
TLC细菌涂覆测试 在玻璃-或铝支持的60HPTLC板(Merck，Darmstadt，Germany)上，用氯仿/甲醇/水(体积比为60∶35∶8)作为溶剂系统进行薄层色谱。化学测定通过茴香醛染色来完成(Waldi，1962)。细菌涂覆测试按上述的方法((Hansson等，1985)进行。糖鞘脂((1-4μg/泳道，或如图例所示)在铝支持的硅胶板上进行层析，然后用0.3-0.5％的多聚异丁基异丁烯酯的二乙醚/n-正己烷(按体积1∶3)处理1分钟，干燥后浸入含有2％牛血清白蛋白和1％Tween 20的溶液中2小时。将放射性标记的细菌(用PBS稀释成1×108CFU/ml和1-5×106cpm/ml)的悬液喷洒在色谱上温育2小时并在用PBS重复洗涤。干燥后，使用XAR-5X-线胶片(Eastman Kodak Co.，Rochester，NY，USA)将薄层板进行放射自显影12-72小时。
TLC蛋白涂覆测试 按照Iodogen法(Aggarwal等，1985)对单克隆抗体TH2和来自于Erythrina cristagalli(载体实验室，Inc.，Burlingame，CA)的凝集素进行125I-标记，产生的量平均为2×103cpm/ul。除了涂覆过程中没有试验Tween外其它与上述用于细菌的方法相同，用PBS稀释成约2×103cpm/ul含有20％牛血清白蛋白的125I-标记的蛋白用于替代细菌悬液。
分于建模 列于表1的糖鞘脂的最低能量构象用Biograf分子成模程序((Molecular Simulations Inc.)在Silicon Graphics 4D/35TG工作站上使用Dreiding-II分子力场(forcefield)(Mayo等，1990)计算。使用电荷平衡方法(Rappe和Goddard III，1991)产生部分原子电荷，并且将距离依赖的介电常数(ε＝3.5r)用于Coulomb相互作用中。此外使用特殊的氢原子成键term，其中最大相互作用(Dhb)设置为-4kcal/mol。GlcβlCer键的双面角的定义如下起始于葡萄糖末端的φ＝H-1-C-1-O-1-C-1、ψ＝C-1-O-1-C-1-C-2和θ＝O-1-C-1-C-2-C-3(见Nyholm和Pascher，1993)。
当存在8mM MnCl2和0.2mg/ml ATP时，通过将受体糖类与人血清β3-N-乙酰糖胺转移酶和UDP-GlcNAc放入50mM pH7.5 TRIS-HCl中于37摄氏度温育5天，可以由Galβ4GlcNAc合成寡糖GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc(Sigma，St.Louis，USA)和由Galβ4GlcNAcβ6GlcNAc合成GIcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6GlcNAc。通过将二糖与β4-半乳糖苷转移酶(牛奶，Calbiochem.，CA，USA)和UDP-Gal在20mM MnCl2存在时在50mM MOPS-NaOH(pH7.4)中温育几个小时自GlcNAcβ6GlcNAc(Sigma，St Louis，USA)获得Galβ4GlcNAcβ6GlcNAc。按照生产者建议的用400mUβ3/6-半乳糖苷酶过夜处理己糖Galβ3GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc(1mg，获自Dextra实验室，UK)，寡糖经层析纯化，它们的纯化度经由MALDI-TOF质谱法和NMR来确定。Galα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc获自Dextra实验室(reading，UK)。按照Lanne等(1995)描述的将糖脂GlcAβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer(Wako Pure Chemicals，Osaka，Japan)还原成Glcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer。根据Lanne等(1995)描述的通过将GlcAβ3Galβ4Gl cNAcβ3Galβ4GlcβCer的葡糖醛酸的羧基基团氨基化生成糖脂衍生物Glc(A-甲酰胺)β3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer。
结果利用上述HPLC从兔胸腺中纯化七糖基神经酰胺NeuGcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer，并通过NMR和质谱法确定其结构(数据未给出)。本发明人实验室中分离检测的大部分幽门螺杆菌都能结合七糖神经节苷脂。
为了检测七糖基神经酰胺物质中可能的最小异构成分，神经节苷脂被脱唾液酸，用内源性糖基神经酰胺酶处理后在其释放出的寡糖被过甲基化，并通过气相色谱法和EI/MS分析，(图1A和1B)。在六糖区域鉴别出两种显示出预期糖序列Hex-HexNAc-Hex-HexNAc-Hex-Hex的糖，在m/z 219、464、668、913和1118的片断离子(fragmention)证实了这一点。当在甲基化之前糖被转化为糖醇(通过NaBH4还原)时，除了先前列出的离子外在m/z 235、684和1133还发现了明显的片断离子(数据未给出)。在m/z 182的强片断离子证实了β4GlcNAc(新乳系列，2型糖链)的存在，由此可以定性超过物质总量90％的主要的糖(峰B，图1A和1B)。少量糖(峰A，图1A和1B)给出了1型糖链(乳糖(lacto)系列)的波谱，其在m/z 182有一个非常弱的片断离子和在m/z 228有一个强片断离子。制备的物质还包括微量的其它糖类(sugar-positive)物质，这些物质可能是含有4-和5-糖的相同系列的糖。在混合物中未发现含有糖的海藻糖。脱唾液酸神经节苷脂(asialoganglioside)的纯度还可以通过FAB/MS和NMR色谱测定。七糖基神经酰胺的阴性FAB/MS(图2A)证实了预期糖序列并显示出神经酰胺主要由鞘氨醇和C16∶0脂肪酸(m/z 536.5)组成。由七糖基神经酰胺获得的NMR波谱(图3A)显示其在β-结合(J1，2≈8Hz)的端基异构区含有4个主要的双重峰(doublets)，它们的强度比率为2∶2∶1∶1。在4.655ppm(GlcNAcβ3)、4.256ppm(内在Galβ4)、4.203ppm(末端Galβ4)和4.166ppm(Glcβ)处的信号与先前出版的nLcOse6-Cer(ClauSen等，1986)的结果一致。在4.804ppm处还有一个小的双重峰，它与1.81ppm的一个小的甲基信号(看作是大的2型甲基谐振的一个肩部)连在一起，这表明了存在一个含有1型链的小的级分。由于4.15到4.25ppm区域的重叠，故不能确定这种1型键的位置和分布。1型键的总量大致为10％，而通过β-半乳糖苷酶消化获自己糖基神经酰胺的五糖基神经酰胺中1型链的数量约为5％，由此看来1型键均匀地分布于糖链的内在和外部，例如5％的糖脂可能是1型-1型。
为了查明糖脂的结合活性是否与主要的新乳糖(neolacto)(2型)结构相关联，用β4-半乳糖苷酶和β4-己糖胺酶处理脱唾液酸-糖脂，并通过TLC和涂覆实验来研究产物(图4A，4B和4C)。如预期的，首先酶促使六糖基神经酰胺转化为七糖基神经酰胺(4A，泳道3)，并且两种酶的混合物将物质降解成乳糖苷神经酰胺(4B，泳道6)。根据对TLC板的目视评估，两个反应是完全的或几乎是完全的，通过唾液酸和酸处理物质获得了相同的结果。伴随着六糖基神经酰胺被β4-半乳糖苷酶降解，在TLC板上该糖脂结合幽门螺杆菌区域的结合活性消失了，而同时在七糖基神经酰胺区域出现了强的活性(4C，泳道3)，对七糖基神经酰胺的进一步酶降解导致了该区域结合活性的消失，在四-糖区域没有观察到存在结合活性。TLC板的化学染色的灵敏度太低以致于不能观察到微量的物质。
在个别实验中，亲代神经节苷脂进行部分酸降解，释放出的糖脂用于研究幽门螺杆菌的结合活性。图5A和5B显示了在用35S-标记的幽门螺杆菌涂覆于水解产物上后水解产物的TLC结果(5A)和相应的放射自显影(5B)。定位于六-、五-、四-和二糖基神经酰胺区域的糖脂显示出结合活性，但是三糖基神经酰胺却是失活的。
当用至少三种幽门螺杆菌菌株(17875，002和032)来检测时，六-、五-、四-糖基神经酰胺与菌株的结合是相近的。
在从六糖基神经酰胺分离出末端半乳糖并用硅胶层析纯化后，在较大的尾部观察到产生的强的结合七糖基神经酰胺的活性，该糖脂的阴性FAB/MS波谱证实了HexNAc-Hex-HexNAc-Hex-Hex-糖序列的存在并且表明了象六糖基神经酰胺一样的神经酰胺组分(图2B)。由五糖基神经酰胺获得的质子NMR波谱(图3B)在端基异构区含有4个主要的β-双重峰(doublet)，分别位于4.653ppm(内在GlcNAcβ3)、4.615ppm(末端GlcNAcpβ3)、4.261ppm(两倍强度，内在Gaiβ4)和4.166ppm(Glc3)，与GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer一致并与被脱离掉末端Galβ的六糖化合物完全一致。相应于β-替代的GlcNAcβ(1型链)在4.787ppm处还有一个小的β-双重峰，在1.82ppm处也观察到了作为许多大的甲基化信号肩膀的预期的甲基化信号，但重叠抑制了这些信号的量化。端基异构质子部分可以占到含有1型链糖脂的6％，因此2型和1型糖链的相对比例近似于六糖糖脂。在TLC板上在六-和五糖基-部分呈现的两个斑点反映了糖链化合物中存在的一种神经酰胺异质，而不是与通过它们对β4-半乳糖苷酶的易感性来判断的差异。在非选择性水解脱唾液酸神经节苷脂和选择性剪切来自于脱唾液酸产物的4-键合半乳糖后均可以呈现上述五-区域的斑点，而且，当含有高通量上部层析亚片断的六糖基神经酰胺被β4-半乳糖苷酶和β4-己糖胺酶降解时，产生的乳糖苷神经酰胺会显现出两条明显的色谱条带。色谱法同质的六糖基神经酰胺导致仅有一条乳糖苷神经酰胺带。涂覆试验表明五-区域的上部和下部都是高度活性的。
使用TLC涂覆法通过半-定量实验来检测含有6、5和4糖(结构2、4和5，表I)的新乳系列的糖鞘脂，系列稀释的糖鞘脂加样到硅胶板上并涂覆标记过的细菌，然后通过目测评估并进行放射自显影(图6A和6B)。最有活性种类是五糖基神经酰胺，其在降至0.039nmol/spot的量(7个试验计算出的平均值，标准离差δn-1＝0.016nmol)的过程中在TLC板上呈现为阳性反应，六-和四糖基神经酰胺分别以c∶a为每点0.2和0.3nmoles糖脂的量粘附幽门螺杆菌。
结合幽门螺杆菌的研究系列中更高级糖脂是高度可重复的。记录的幽门螺杆菌菌株032与五糖基-和六糖基神经酰胺的结合频率约为90％(板的总数约为100)结合检测揭示了异构受体和结合的特异性(图7A和7B)。
除了来自于兔胸腺的七-糖糖鞘脂具有新乳核心NeuGcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer和来源于其的四-到六糖基神经酰胺外，来自于新乳系列的其它糖脂也可以具有结合特异性。
图7A和7B为通过涂覆实验显示的幽门螺杆菌与在薄层板上分离的纯化糖鞘脂的结合。这些结果与那些来自于额外数量的纯化糖鞘脂被归纳在表2中。幽门螺杆菌与新乳四糖基神经酰胺(泳道1)及来源于NeuGcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer的五-和六-糖糖鞘脂(泳道5和6)的结合与上述结果是等同的。然而出乎意料地是，还发现了幽门螺杆菌与GaINAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer(x2糖鞘脂，泳道7)和脱岩藻糖基A6-2糖鞘脂GalNAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer的结合(第12，表2)，同时还发现了Galα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer(B5糖鞘脂，泳道2)也具有结合活性，这些结果表明存在交联的可能性而不是存在对这些糖鞘脂中每一个具有特异性的多重粘附(见下文)。而且，不同的含有只提及了可以耐受细菌粘附糖鞘脂的五-糖仅有的延长形式是将Galβ4加至来源于胸腺的GlcNAcβ3-终止的化合物上(泳道6)。其它延长结构如NeuAc-x2(泳道8)和GaINAcβ3-B5(第25，表2)均被发现是不能结合的。由此可以进一步认识到B5中内在的乙酰氨基基团GIcNAcβ3对于结合是至关重要的，因为通过无水肼处理使得这些部分脱-N-酰化作用导致了活性的完全丧失(泳道3)，就是当新乳四糖基神经酰胺被作相似处理时也出现了相同结果(第6，表2)。
五-糖糖鞘脂的交联结合。为了理解本研究中基于不同新乳-的糖鞘脂分子的结合特性，通过分子建模来研究活性和非活性结构构象的参数选择。图8A、8B、8C和8D显示了X2糖鞘脂和其它三种序列脱岩藻糖基A6-2、B5及脱-N-酰化作用B5之间具有相近的结合强度，其中除修饰的B5外。来自于兔胸腺的五-糖糖鞘脂(图9A)也可以被包括进这种比较中，因为仅在末端残基的位置4与X2结构不同的这种结构一样具有活性。因此四种均含有新乳核心的结构是分别由GalNAcβ3，GalNAcα3，Galα3和GlcNAcβ3终止的序列。按前述方法(Teneberg等，1996)产生这些结构的最低能量构象，表2中给出的其它最低能量结构是参考了文献中已经记载的(Bock等，1985；Meyer，1990；Nyholm等，1989)。关于唾液酸-终止的糖鞘脂，采用倾斜的构象用于α3-键合残基的糖苷双面角，如图9C所示，但其它构象的效应(Siebert等，1992)尤其是背斜的构象也被进行了测试。为了相同的目的还产生了几个α6-键合的几个不同的低能量构象(Breg等，1989)。
如上所述，四种具有结合活性的五-糖糖鞘脂(表2第10-13)都含有一个新乳核心的事实表明交联至相同粘附位点可能是隐藏在这些观察背后的反应。在第一次看时，仍然让人惊讶的是虽然B5糖鞘脂与从兔胸腺获得的五-糖化合物比较在末端位置上不同，前者具有Galα3，后者具有GlcNAcβ3，但是它们一样都具有活性并都具有新乳系列的结合特异性。不管这些化合物存在两种末端糖的事实，在它们的端基异构键中也存在差别，从图8C和9A可以看出它们拓扑异构的最低能量结构是非常接近的，差别在于Galα3缺少一个乙酰氨基而在轴向位置有一个4-OH并且它的环状平面微升至五-糖化合物中相应平面之上。然而既不是4-OH位置也不是缺少/存在一个乙酰氨基显示出对结合是至关重要的，因为分别由GalNAcβ3和GalNAcα3终止的X2和脱岩藻糖基的A6-2糖鞘脂(图8A，B)对于幽门螺杆菌粘附素都具有相近的亲合力。根据这些发现，可以预见从人红血球分离的Galβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer(Stellner和Hakomori，1974)也应具有结合细菌粘附素的活性。根据结合的法则结合幽门螺杆菌的表位中的三种其它末端单糖也有可能是三糖表位，命名为GIcNAcα3Galβ4GlcNAc、Glcβ3Gal4GlcNAc和Glcα3Galβ4GlcNAc。迄今为止这些来源于人组织的化合物还是未知的，但却代表了相当的天然受体类似物，而不仅仅是凑巧检测了Galβ3Galβ4GlcNAc-糖脂或这三种类似物而已。
新乳七-糖化合物NeuGcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer也用来分子建模。图10显示了在延长构象中含有GlcβCer键的最低能量构象的两种不同方案。
虽然给出了唾液酸的顺错(syn clinal)构象但在无支链结构中也可能有反构象异构体(Siebert等，1992)。与六-糖化合物相比较，唾液酸显现出能少许影响与结合幽门螺杆菌的的活性，9B。将第一个方案与图9A和9B相比较说明在七-糖结构中也可能获得相同的结合表位。
新乳结合表位的描绘。通过化学和酶法降解兔胸腺七-糖化合物(第1、5、10、21，表2)获得结构的相对结合长度表明三-糖序列GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3可以构成最小结合序列。因此，可以预见在六糖化合物中存在一种来自于末端Galβ4的抑制效应，然而对于缺少末端GlcNAcβ3残基的新乳四糖苷神经酰胺来说，由于表位中仅有三糖的两个，从而缩小了结合的长度。通过将乳四糖基神经酰胺和B5的乙酰基进行脱-N-酰化作用生成胺后(第6和14，表2)，它们就丧失了与细菌的结合能力，由此非常清楚地显现出内在GlcNAcβ3的重要性。既可以通过缺失粘附素和乙酰氨基部分之间的有利互作也可以通过改变这些糖鞘脂构象的参数选择来产生这种非-结合。然而，很难构建这样一种条件，即通过改变其内在Galβ4的定位来空间阻碍细菌与结合表位的接近。因此，确定了最小结合序列必须包含GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3序列后，现在很容易使P1、H5-2和两种唾液酸类红细胞糖苷脂结构(第15、18-20，表2)的结合活性合理消失，因为通过延长直接干扰了目标结合表位。还有来自于牛酪乳的糖鞘脂(Teneberg等，1994)是非结合的，因为该糖鞘脂含有一个附在新乳四糖基神经酰胺(第26，表2)内在Galβ4上的一个36-键合的Galβ4GlcNAcβ支链，它阻碍了细菌与结合表位的接近。
表2中具有不同结合活性的五-糖序列的延长形式表明在胸腺来源结构上仅加上Galβ4是可行的，这与观察到的4-OH既可以位于纬向也可以位于轴向但由于空间阻碍作用确实使之丧失了结合亲合力的情形相一致。NeuAcα3加至X2上或GalNAcβ3加至B5上会导致结合能力的完全丧失(第24和25，表2)。进一步发现Fucα2单位在H5-2中的消极影响，幽门螺杆菌与A6-2和B6-2(第22和23，表2)不结合证实了这点。关于由B5中发现的相同三糖终止的延长结构(第28，表2)，虽然其中也存在一个第二内在的结合表位，但它必须是如在B5中一样能引起结合的末端三糖。然而，最有可能排除的是与内在表位的结合，因为倒数第二个Galβ4可以预期获得或不依赖于菌株的类型和生长条件(Miller-Podraza等，1996，1997a，b)。
总而言之，为了获得最大活性，新乳系列糖鞘脂的结合表位必须包含三-糖序列GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3。根据本研究中使用的潜在异构受体的结合模式的比较，从图8A-D和9A-D显示的结构可以推导出几乎所有这样的三糖对于产生结合是重要的，除了末端GIcNAcβ3的乙酰氨基和相同残基上的4-OH对结合不重要外。
受体的生物学存在。在四个体外可以功能性交换地作为幽门螺杆菌受体的五-糖糖鞘脂中，仅X2天然存在于人组织中但还没有发现在胃黏膜中存在，除了在瘤组织中鉴别出的一例胃癌外(Kannagi等，1982b)。Thorn等(1992)的研究表明含有一个末端GalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ序列的X2糖鞘脂和延长结构存在于几种人组织中，但胃上皮组织恰巧不属于这些研究对象中，所以获得了由来源于几个血型A个体(泳道1-6)胃黏膜的总非-酸性糖鞘脂制备的GalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ-特异性单克隆抗体TH2的薄层色谱覆盖图(图11B)。可是使用该检测方法没有观察到来源于胃上皮细胞糖鞘脂的可鉴别的结合。图11A、11B和11C显示了使用来源于E.cristagalli的Galβ4GlcNAc-结合凝集素的相应涂覆试验。在胃上皮细胞来源制备的不同的糖鞘脂中，在四-糖区域前三个泳道显现出微弱的与条带结合，这可能与乳四糖基神经酰胺相符，但由于这种糖鞘脂的数量少故不能清楚观察到幽门螺杆菌与这些条带的可鉴别的结合(Teneberg等，2001)。
此外，不管序列Galα3Galβ4GlcNAcβ是否存在于B5糖鞘脂或在上述延长结构(第28，表2)中，由于增加(Larsen等，1990)Galα3引起转移酶不表达使得在正常人组织中不可能发现该序列。因此结论是如果运输上述鉴别的表位的靶受体存在于胃上皮细胞的表面，那么在糖鞘脂中它们可以建立在糖蛋白重复性N-乙酰乳糖胺元件之上而不是基于脂质的结构之上。
但是，与胃溃疡相关联的幽门螺杆菌菌株是已知的，就象这里主要使用的菌株，其激活了粒细胞的炎症应答反应一样，即使细菌不易受调理素的作用(Rautelin等，1994a，b)。细菌噬菌作用过程中的最初事件多数可能包括特异性的导致粒细胞粘合的类凝集素相互作用(Ofek和Sharon，1988)。在噬菌事件之后发生了氧化破裂反应，这可能是幽门螺杆菌-关联疾病发病机理的诱因(Babior，1978)。几种来自于粒细胞的酸性和非酸性糖鞘脂都有一个新乳核心和重复的乳糖胺单位，包括列于表2中的第21个化合物和唾液酸化七-糖化合物(第27个，表2)，其中唾液酸的乙酰氨基是以乙酰基的形式存在，它们被分离和定性(Fukuda等，1985；Stroud等，1996)，并且由此可以作为在白血球细胞表面的潜在的幽门螺杆菌的受体。而且，X2糖鞘脂也可以从相同的来源分离(Teneberg，S.unpublished)。
返回图11B可以看到单克隆抗体TH2实际结合于五-糖区域的条带，对于粒细胞和红血球(分别为泳道7和8)来说也是一样的，这可能与X2糖鞘脂相应(Teneberg，S.，未出版；Thorn等，1992；Teneberg等，1996)。同样地，当在涂覆测试中用E.cristagalli凝集素替代使用时，发现在粒细胞和红血球中都存在新乳四糖基神经酰胺(图11C，泳道7和8)。在这两例中，结合幽门螺杆菌的于乳四糖基神经酰胺(Bergstom，J.，未出版)。对于粒细胞来说，在六-糖区域发现了一条可能相应于延长了一个N-乙酰乳糖胺单位的新乳四糖基神经酰胺(参见第21，表2)的相当弱的条带，这与Fukuda等(1985)的结果一致。不管这些糖鞘脂在上述提及的粘合过程中是否是首要靶点，仍然对它们进行了描述。
对新糖脂和新的糖脂的分析通过氰硼氢化物(Halina Miller-Podraza，稍后将要公开)并用4-十六烷基苯胺(缩写为HDA，from Aldrich，Stockholm，Sweden)将寡糖GlcNAcβ3Galβ4 GlcNAc、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6GlcNAc、Galα3Galβ4GlcNAeβ3Galβ4Glc和GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc及麦芽庚糖(Sigma，Saint Louis，USA)进行还原胺化。用质谱法鉴定产物并证实为GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc(red)-HDA、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6GlcNAc(red)-HDA、Galα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc(red)-HDA、GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc(red)-HDA和麦芽庚糖(red)-HDA[其中“(red)-”意思是从糖的末端还原性葡萄糖和十六烷基苯胺(HAD)的胺基还原胺化形成的胺键结构]。在与上述的TLC-涂覆测定中幽门螺杆菌相比，化合物Galα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc(red)-HDA和GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc(red)-HDA呈现明显的结合活性，GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ6GlcNAc(red)-HDA则具有强烈的结合活性，而GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc(red)-HDA和麦芽庚糖(red)-HDA的结合很微弱或是无活性的。此例显示四糖GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Gal是结合幽门螺杆菌的一个结构。还原末端Glc-残基可能对于结合是不必需的，因为还原破坏了Glc-残基的吡喃环结构。而作为对照，还原末端GlcNAc的完整的环结构对于三糖GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc很好地结合是必需的。
在TLC涂覆测试中检测生物合成的NHK-1糖脂的类似物GIcAβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer和新的糖脂Glcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer和Glc(A-甲酰胺)β3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer，从中观察到了它们相对于幽门螺杆菌的结合活性。Glc(A-甲基酰胺)指葡糖醛酸衍生物，其中羧酸基被甲基胺酰胺化。Glcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer结构具有强的结合幽门螺杆菌的活性，而Glc(A-甲酰胺)β3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcβCer则具有很强的结合活性。
GlcAβ3Galβ4Glc(NAc)经转糖基作用的生产受体糖Galβ4Glc或Galβ4GlcNAc(约10-20mM)与过量的10倍摩尔的对硝基苯-β-葡糖醛酸和用缓冲液稀释的pH约为5的牛肝脏β-葡萄糖苷酸酶(20000U，Sigma)一起于37摄氏度搅拌着温育两天。产物经由HPLC纯化。
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权利要求
1.含有结合幽门螺杆菌的寡糖序列[Gal(A)q(NAc)r/Glc(A)q(NAc)rα3/β3]s[Galβ4GlcNAcβ3]tGalβ4Glc(NAc)u的物质，以及具有结合幽门螺杆菌活性的所述寡糖序列的类似物或衍生物在制备具有幽门螺杆菌结合或抑制活性的组合物中的用途，其中q、r、s、t和u各自独立为0或1，当t＝0和u＝0时，寡糖序列与多价载体连接或以高浓度的游离寡糖存在。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述物质包含寡糖序列GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc或GIcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc，其末端GlcNAcβ3的C4位任选通过糖苷键与Galβ1-或寡糖链连接。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述物质包含一种或几种以下的寡糖序列Galβ4GlcNAc，GalNAcα3Galβ4GlcNAc，GalNAcβ3Galβ4GlcNAc，GlcNAcα3Galβ4GlcNAc，GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc，Galβ3Galβ4GlcNAc，Glcα3Galβ4GlcNAc，Glcβ3Galβ4GlcNAc，Gaβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAc，Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc，GalNAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc，GalNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc，GlcNAcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc，GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc，Galβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc，Glcα3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc，Glcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc，GalANAcβ3Galβ4GlcNAc，GalANAcα3Galβ4GlcNAc，GalAβ3Galβ4GlcNAc，GalAα3Galβ4GlcNAc，GalANAcβ3Galβ4Glc，GalANAcα3Galβ4Glc，GalAβ3Galβ4Glc，GalAα3Galβ4Glc，GlcANAcβ3Galβ4GlcNAc，GlcANAcα3Galβ4GlcNAc，GlcAβ3Galβ4GlcNAc，GlcAα3Galβ4GlcNAc，GlcANAcβ3Galβ4Glc，GlcANAcα3Galβ4Glc，GlcAβ3Galβ4Glc，GlcAα3Galβ4Glc，Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc，和它们的还原-末端多价缀合物。
4.如权利要求1所述的用途，其中所述的物质包含一种或几种下列寡糖序列GalNAcα3Galβ4Glc，GalNAcβ3Galβ4Glc，GlcNAcα3Galβ4Glc，GlcNAcβ3Galβ4Glc，Galβ3Galβ4Glc，Glcα3Galβ4Glc，Glcβ3Galβ4Glc，和它们的还原-末端多价缀合物。
5.如权利要求3所述的用途，其中所述物质包含一种或几种下列寡糖序列Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc(乳-N-新四糖)，Galβ4GlcNAcβ3Galβ4GlcNAcβ3Galβ4Glc(对-乳-N-新六糖)，和它们的还原-末端多价缀合物。
6.如权利要求1-5所述的用途，其中所述物质与多糖缀合，优选与聚乳糖胺链或其缀合物连接。
7.如权利要求1-5所述的用途，其中所述物质是一种糖脂。
8.如权利要求1-5所述的用途，其中所述物质是一种含有至少两个或三个寡糖链的寡聚分子。
9.如权利要求1-5所述的用途，其中所述物质由含有一种或多种权利要求1-8所述物质的微团组成。
10.如权利要求1-9中任一项所述的用途，其中所述物质的一或多种结合于一种载体上。
11.如权利要求1-10中任一项所述的用途，其中所述物质与能有效抑制幽门螺杆菌的抗生素共价缀合，其中优选青霉素类抗生素。
12.如权利要求10中所述的用途，其中所述寡糖序列(OS)的还原末端Glc或GlcNAc的C1位通过氧键(-O-)与低价或多价载体(Z)连接，中间经由一个间隔基团(Y)和任选地经由一个单糖或寡糖残基(X)，形成了以下结构[OS-O-(X)n-Y]m-Z其中整数m和n的值为m≥1，n独立为0或1；X优选乳糖基、半乳糖基、聚-N-乙酰-乳糖胺基，或O-聚糖或N-聚糖寡糖序列的一部分，Y是间隔基团或末端缀合物如神经酰胺脂质部分或到Z的键；或是具有结合幽门螺杆菌活性的所述结构物质的衍生物。
13.权利要求1-12所述的物质在制备治疗或预防由幽门螺杆菌存在引起的任一疾病的药用组合物中的用途。
14.如权利要求13所述的用途，其中所述的药用组合物用于治疗慢性浅表性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃腺癌、人胃部非霍奇金淋巴瘤、肝病、胰腺疾病、皮肤病、心脏病或自体免疫疾病包括自体免疫胃炎和恶性贫血以及非-类固醇抗炎症药物(NSAID)相关的胃病，或用于预防婴儿猝死综合症。
15.如权利要求1-12所述的物质在诊断由幽门螺杆菌感染引起的疾病中的用途。
16.如权利要求1-12所述的物质在制备治疗或预防任何一种由幽门螺杆菌存在引起的疾病的营养添加剂或组合物中的用途。
17.如权利要求16所述的用途，其中所述的营养添加剂或组合物用于婴儿食品。
18.如权利要求1-12所述的物质在鉴别细菌粘附素中的用途。
19.如权利要求1-12所述的物质或根据权利要求18鉴别的物质在制备抗幽门螺杆菌疫苗中的用途。
20.如权利要求1-12所述的物质在对幽门螺杆菌分型中的用途。
21.如权利要求1-12所述的物质在幽门螺杆菌结合检测中的用途。
22.一种结合幽门螺杆菌的物质及其结合幽门螺杆菌的类似物或衍生物，该物质含有寡糖序列Glc(A)q(NAc)rα3/β3Galβ4Glc(NAc)u，其中q、r和u独立选自0或1，其限制性条件是当寡糖序列含有β3键时，q和r为1或0；或者含有寡糖序列GalA(NAc)rα3/β3Galβ4Glc(NAc)u，其中r和u独立选自0或1。
23.一种含有权利要求1所述寡糖序列的结合幽门螺杆菌的非-酸性多价物质及其结合幽门螺杆菌的类似物和衍生物，其中所述的寡糖序列(OS)是权利要求12所述的结构[OS-O-(X)n-Y]m-Z的一部分，Y是亲水间隔基团，更优选一种柔性亲水间隔基团。
24.如权利要求23所述的结合幽门螺杆菌的非-酸性多价物质，其中接头结构Y是[OS-O-(X)n-L1-CH(H/{CH1-2OH}p1)-{CH1OH}p2-{CH(NH-R)}p3-{CH1OH}p4-L2]m-Z，其中其中L1和L2是连接基团，它们各自独立含有氧、氮、硫或碳键合原子或两个联接的原子，这些原子形成的化学键如-O-，-S-，-CH2-，-N-，-N(COCH3)-，酰胺基团-CO-NH-或-NH-CO-或-N-N-(肼衍生物)或氨基氧-键-O-N-和-N-O-；L1是自X的还原末端单糖的碳1位的键，或者当n＝0时，L1代替-O-并直接从OS的还原末端C1起连接；p1、p2、p3和p4分别独立为从0到7的整数，限制条件是p1、p2、p3和p4中至少一个至少为1；在支链形式{CH1-2OH}p1中的CH1-2OH表明链的终止基团是CH2OH，而且当p1大于1时仲醇基-CHOH-将终止基团与间隔基团的剩余部分连接起来；R优选乙酰基基团(-COCH3)或R是一种与Z连接的可选择的键，然后L2是一或二原子链终止基团，在另一个方案中，R是形成类似物基团，包含含有酰胺结构或H的C1-4酰基基团，或形成氨的C1-4烷基；而且m＞1，Z是多价载体；OS和X的定义如权利要求12。
25.一种含有寡糖序列的结合幽门螺杆菌的物质及其结合幽门螺杆菌的类似物和衍生物，其中所述的寡糖序列Gal(A)q(NAc)r/Glc(A)q(NAc)rα3/β3Galβ4Glc(NAc)u作为非还原末端终止序列，其中q、r和u分别独立为0或1，限制条件是所述寡糖序列不是Galα3Galβ4Glc/GlcNAc。
26.如权利要求22-25中任一项所述的物质用于与细菌、毒素或病毒结合。
27.如权利要求22-25中任一项所述的物质用作药物。
28.一种治疗由于幽门螺杆菌存在引起的疾病的方法，其中给予需要这种治疗的对象有效药物量的如权利要求1-12或22-25中任一项所述的物质。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述疾病是由于患者的胃肠道中存在幽门螺杆菌引起的。
30.如权利要求28所述的方法，该方法用于治疗慢性浅表性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胃腺癌、人胃部非霍奇金淋巴瘤、肝病、胰腺疾病、皮肤病、心脏病或自体免疫疾病包括自体免疫胃炎和恶性贫血以及非-类固醇抗炎症药物(NSAID)相关的胃病，或用于预防婴儿猝死综合症。
31.根据权利要求28-30任一项所述的治疗方法，其中所述的物质是一种营养添加剂或营养组合物的一部分。
32.根据权利要求26所述的物质，其中所述的毒素是艰难梭菌的毒素。
33.根据权利要求1所述的用途，其中所述的寡糖序列是通过β1-6键将还原末端和GalNAc、GlcNAc、Gal或Glc连接起来的。
34.根据权利要求2的用途，其中所述的寡糖序列是Glc(A)q(NAc)rβ3Galβ4GlcNAc，q和r的定义同权利要求1。
全文摘要
本发明描述了含有结合幽门螺杆菌的寡糖序列[Gal(A)
文档编号G01N33/53GK1525862SQ02805753
公开日2004年9月1日 申请日期2002年1月18日 优先权日2001年1月19日
发明者哈利那·米勒-波德拉扎, 苏珊·特尼伯格, 乔纳斯·安格斯特罗姆, 卡尔-安德斯·卡尔森, 贾里·纳图南, 安格斯特罗姆, 哈利那 米勒-波德拉扎, 特尼伯格, 纳图南, 驳滤埂たǘ 申请人:比奥蒂治疗公司