用于癌症预测和诊断的染色定向的分子分析的制作方法

专利名称：用于癌症预测和诊断的染色定向的分子分析的制作方法
技术领域：
本发明涉及在组织外观显示癌可能已经扩散之前，对含有疑似扩散性癌细胞的组织进行早期定位和预测的联合方法，而前述观察组织外观的方法通常会延误通过常规的定位、切除和组织学方法对癌前期或癌性组织进行的诊断。
另一方面，本发明涉及对含有这种疑似扩散性癌细胞的组织进行定位和检测的联合方法，含有疑似扩散性癌细胞的组织通常表现为外观异常，当外观已经表现异常时会导致延误诊断和治疗。
背景技术：
如果患癌的诊断延迟2个月以上，则患者的死亡危险性将大大高于在较早获得诊断的患者(见Cancer，92[11]2885-2891，2001)。因此，如果对患者经常进行癌检，并用确定的方法进行早期预测或诊断，就可以降低癌的死亡危险性。
因此，本发明提供对最终发展为扩散性癌进行早期预测或确诊的扩散性癌预测和诊断方法，该方法可有步骤、快速而且准确地在临床应用。
癌前期和癌性组织的发展肿瘤的发展需要两个独立的突变事件。其中一个可出现于生殖系并可遗传。另一个出现于体细胞。另外，这两个突变事件也可只在个体的体细胞中出现。
癌检方法传统的目测查法能够正常观察到的细胞突变已有大量记载，所述细胞突变可包括增厚、变色、非典型的痣或硬化。本领域技术人员已知区分早期的黑色素瘤和良性的黑素细胞痣的若干组织学特征。例如

然而，这些病变组织通常发展到晚期才会明显表现出这些通常可见的征状及其特点。因此，需要一种简单、快速并相对精确的检查方法，以使临床医生在癌性或癌前期组织出现通常可见的特征之前将可疑组织定位。
对疑似癌性组织早期定位的体内癌检方法现在已开发出了体内检查技术，这种技术能够在采用传统的观察法揭示可疑组织之前，快速并且非侵入性地鉴定患者身体上可能含有肿瘤或癌性表型细胞的大体或特定部位。这种确定此类疑似癌变尤其是上皮癌的部位的体内检查技术甚至对普通的临床工作者来说也十分便捷而易行。
大体解剖检查大体解剖检查的一个实例是对单一的唾液样品的聚合酶链反应(PCR)分析。唾液含有来自头部和颈部区域(大的表面区域，其是癌细胞的常见来源，尤其是对于这些区域接触了尼古丁、酒精和其他已知或可疑的致癌物的患者)的脱落的细胞。PCR分析是一种大体初步检查方法，该方法可确定患者唾液中发现的脱落的细胞是否表现癌性表型，若为癌性表型则表明在此大体解剖区域内有癌的发展。例如，见Spafford，M.F.等，“采用微卫星分析法对脱落的黏膜细胞进行头部和颈部鳞片细胞癌的检查(Detection of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma AmongExfoliated Mucosal Cells by Microsatellite Analysis)”癌的临床研究(Clin.Cancer.Res.)，2001年3月，7(3)607-612。
通过选择性体内染剂染色法进行特异性定位检查本领域已知的选择性体内组织染色技术使用甲苯胺蓝O(TBO)染剂和其他的阳离子超活体标记剂以便选择性地定位癌性或癌前期组织。授予Mashberg的美国专利4,321,251和授予Tucci等的美国专利5,327,801概述了以Mashberg命名的染色方法(Mashberg法)。
在授予Burkett的美国专利6,086,852和6,194,573中公开了用于检测和识别癌或前期癌的TBO染色技术的改进。Burkett公开了合成TBO产物的方法、高产率TBO的生产方法及用于检测发育异常组织的改进方法。在授予Pomerantz的美国专利5,882,627中公开了对体内癌的识别有效的其他染剂，这些染剂包括天青A、天青B、天青C染剂和某些其他恶嗪染剂和噻嗪染剂。
基于分子分析的预测和诊断突变通常由分子内基因重组产生，例如核苷酸(DNA和RNA各自的亚单位)的取代、添加或缺失。然而最近，遗传图谱已发展了检测表征癌和前期癌的核苷酸突变的方法，例如DNA和RNA的甲基化模式和酶活性，这是核苷酸序列或“遗传密码”改变的直接结果。也已确定可通过线粒体的改变检测癌活性。
I.基因突变DNA分析DNA多态性分析揭示正常细胞和肿瘤细胞间的显著差异正常细胞在许多位点是杂合的，而肿瘤细胞在相同位点是纯合的(杂合性丧失)。
肿瘤抑制基因通常与一条染色体或部分染色体的缺失相关，该缺失通过消除肿瘤抑制基因的一个等位基因及周围的标记，导致其变为纯合性。肿瘤抑制基因剩余的等位基因由于遗传突变或体细胞突变而失活。根据大量文献的记载，肿瘤抑制基因的实例包括腺瘤样结肠息肉基因(APC)、家族性乳腺/卵巢癌基因1和2(BRCA1和BRCA2)、钙粘着蛋白1(上皮的钙粘着蛋白或E-钙粘着蛋白)基因(CDH1)、多发性内分泌腺瘤1型基因(MEN1)、神经纤维瘤1型基因(NF1)、蛋白激酶A的1型(α)调控亚基基因(PRKAR1A)、成视网膜细胞瘤基因(RB1)、丝氨酸/苏氨酸激酶11基因(STK11)和希-林综合征基因(VHL)。因此，关键的染色体位点可能预示扩散性癌的开始。
DNA分析的实例包括测定“染色体臂”或“微卫星”的突变或不稳定性的微卫星分析。微卫星是短的重复DNA序列，据观察其包含核苷酸错配、错误比对或核苷酸滑动(环化或缩短)。将诸如这些突变称为微卫星不稳定性，其与多种上皮癌相关。
新近的研究鉴定了新的微卫星标记，该微卫星标记用于在细胞发生异常形态改变前检测异质性的丧失。见Guo，Z等，“Allelic Losses inOra Test-directed Biopsies of Patients with Prior UpperAerodigestive Tract Malignancy”，Clinical Canc.Res.，第7卷，1963-1968，2001年7月。
本领域技术人员知道，具有染色体不稳定性和微卫星不稳定性的肿瘤之间在组织学水平、基因水平和解剖水平就右侧/左侧而言有显著区别。还已知在白血病和淋巴瘤中，主要的中间缺失和易位发生在大体的染色体水平。当已显示丢失了主要的染色体臂时，在各种上皮瘤中例如，发生了不同的变化。肿瘤明显按一条途径或另一条途径发展但不同时按两条途径发展。(Oncology News International，第9卷，第8期，增刊2，2000年8月)MSI分析通常需要使用5个MS标记——两个单核苷酸重复单元和三个双核苷酸重复单元。
RNA分析现在可在1000个野生型mRNA分子背景中检测1个体细胞突变的mRNA分子。该技术在包含少至10-20个细胞的样品中测定基因表达的水平，并具有在若干已知变化频繁的位点测定体细胞点突变的能力。因此，在发育异常和癌性细胞小簇中可观察到基因表达概图中的微不均一性。
使用与滚环式扩增(RCA)单分子测定系统偶联的靶定向的DNA连接步骤，在寡核苷酸微阵列上完成序列测定。DNA连接步骤可适用于测定包含点突变的mRNA。Lizardi，P.M.“Messenger RNA Profiling by SingleMolecule Counting”，耶鲁大学，(2000)，http//otir.cancer.gov/tech/imat_awards.html，(2001年11月28日)。
端粒DNA和相关蛋白，端粒酶端粒是DNA序列，其是染色体末端专有的复合物。端粒酶是帮助维持端粒的核糖核蛋白，其在许多成人细胞类型中无活性，但在许多人类癌中被高度活化。已确定端粒DNA或端粒酶，或中间RNA中的断裂或突变都可打开端粒，导致对DNA的进一步损伤。因此，已知分子分析可测定端粒的异常核苷酸或端粒酶的异常酶活性，该端粒的异常核苷酸或端粒酶的异常酶活性还与癌前期细胞的增殖相关。参见，例如Kim，M.M.等，“A Low Threshold Level of Express ion of Mutant-templateTelomerase RNA Inhibits Human Tumor Cell Proliferation”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA第98卷，第14期，7982-7987(2001年7月)。
II.外遗突变最近发现异常的启动子甲基化是基本的分子异常，这种分子异常导致肿瘤抑制基因、DNA修复基因和转移抑制基因的转录沉默，并与癌相关的其他基因的遗传改变倾向性有关。
体细胞的DNA甲基化的外遗改变与发育、细胞分化和肿瘤转化紧密相关。例如，启动子区域中CpG岛的高度甲基化与致癌作用中肿瘤抑制基因的转录失活越来越相关。尽管已有测定特定DNA片段或总DNA的甲基化的技术，但Yamamoto发展了一种称为“甲基化敏感性-扩增后片段长度多态性”(MS-AFLP)的方法来鉴定整个基因组中甲基化的变化。此种基于聚合酶链反应(PCR)的无偏见的DNA指纹分析技术可鉴定显示DNA甲基化改变的切割位点，并随后可对在其末端具有这些位点的DNA片段进行分离。带强的减弱或增强，或带型的差异与肿瘤的表型特异相关。
因此，甲基化的改变提供了对与细胞分化和癌相关的外遗改变的鉴定。通过测定DNA的甲基化可选择地测定DNA突变或异质性的丧失。见Yamamoto，F.，博士，“Technology to Detect Genome-wide DNAMethylation Changes”，Burnham Institute，http//otir.cancer.gov/tec/imat_awards.html，(2001年11月28日)。
III.线粒体的突变新近，由于发现来自人的癌细胞的线粒体DNA(mtDNA)显示突变，而发展了另一种检测癌的方法。
据估计在线粒体中有1000种不同蛋白质。这些蛋白质中的缺陷可归于“代谢疾病”，这些缺陷可引起输送机制和离子通道中的缺陷，最重要的是引起电子传递链和氧化磷酸化作用中的缺陷。核突变可影响mtDNA的复制、修复和转录，基质中的蛋白合成、蛋白输入和线粒体的其他特征。参见，例如Fliss等，“Facile Detection of Mitochondrial DNAMutations in Tumors and Bodily Fluids”，Science 287，2017-2019(2000)。在本研究中，自14个年龄从23岁到93岁的个体的尸检脑样品提取DNA，并通过PNA定向的PCR钳制检测三个突变。通过PNA定向的PCR钳制检测mtDNA中极低水平的点突变的能力，允许分析从不同年龄个体获得的组织中例如A8344G、A3253G和T414G点突变的存在与否。使用灵敏的寡核苷酸错配连接分析和凝胶电泳检测的突变mtDNA带与肺癌病例符合。
因此，线粒体基因组中的突变也是检测人细胞中癌活性的另一方法。也参见Parrella，P.等，“Detection of Mitochondrial DNA Mutationsin Primary Breast Cancer and Fine-Needle Aspirates”，Cancer Res.61，7623-7626(2001年10月)。在致病性表达的很早阶段，被侵袭的细胞很少，这时采用常规的分子分析法可有利地检测与癌相关的异常染色体的表达。
然而，由于人体的细胞组织的扩展可能使扩散性癌组织播散，所以诸如遗传的、外遗的或线粒体的分子分析的诊断技术并非是有效的早期的癌检测方法，原因在于这些技术的有效性直接有赖于自含有扩散性癌细胞的特定组织部位获得组织样品。而且，尽管现有技术中有些检查方法能鉴定可疑的癌性或癌前期组织的特定部位，但是迄今为止，定位和鉴定这样的可疑组织通常需要随后对可疑组织进行传统的组织学检查例如光学显微镜检查。通常，此传统的组织学检查表明，通过现有技术鉴定的一些部位并非是癌性或癌前期的，事实上当来自这些部位的细胞显示了在该部位最终发展为癌的标记时(该表征癌细胞增殖的标记可以已由分子分析即遗传密码(DNA或RNA)、外遗模式或线粒体DNA(mtDNA)鉴定)，这些部位并非是癌性或癌前期的。
例如，随后对来自通过线粒体染剂染色定位的可疑组织样品的细胞——最初由传统组织学鉴定为Mashberg染剂染色方案的“假阳性”的细胞——进行分子分析表明，大量的这些细胞实际上包含能够最早指示那些可疑部位最终将发展成癌的标记。(见以下的实施例II)发明内容发明人现在已发现一种检测人体组织癌前期或癌性生长的改进的预测和诊断方法，该方法将现有技术中通用或特异的优越的“定位检查”技术与精确的细胞分子分析的预测和诊断技术相结合。
简言之，本发明的方法包括至多三个步骤的多种组合和再组合(1)进行筛检，经聚合酶链反应(PCR)分析唾液以确定该大体解剖区域内是否可能发生头或颈癌；(2)对大体解剖区域局部施行体内染色，选择性染色癌性或癌前期组织，以显示可疑细胞的具体定位，从而可以在这些确定的可疑部位提取细胞或对细胞进行活检；和(3)对自此可疑部位获得的细胞进行分子分析，以确定所述提取的细胞是否显示与细胞分化或癌相关的特征。
在本发明的一个实施方式中，结合采用了大体解剖区域的体内局部选择性染色步骤和细胞分子分析步骤，所述的体内局部选择性染色用来将可疑组织定位，所述的细胞分子分析是对来自被前一步骤定位的可疑组织的细胞进行细胞分子分析。
本发明的另一实施方式包括进行头部和颈部组织的唾液筛检，随后通过对所述组织的选择性染剂染色以确定可疑组织的具体部位，随后通过对来自所述可疑部位的细胞进行分子分析，以确定该确切鉴定的可疑组织是否包含以下细胞，即表现出具有癌或最终会发展成癌的相关特征的细胞。
“分子分析”本文所用的术语“分子分析”意指鉴定表现为癌或可能最终发展为癌的细胞异常的方法。例如，这些方法包括鉴定可疑细胞的遗传密码(即DNA或RNA)、外遗模式或线粒体DNA(mtDNA)的异常的方法。因此，尽管可观察细胞核内外的无数核苷酸以检测突变，但术语“分子分析”限于那些鉴定肿瘤表型是否存在于可疑细胞中的方法。相应地，应当认为术语“分子分析”的范围包括目标核苷酸或相关蛋白和模式，以及本领域技术人员已知的各种其他检测技术。
尽管唾液筛检即步骤1只特定用于检测头颈癌，但步骤2-3可用于任何在体内能够被视觉观察到的细胞，这些细胞包括能够在身体的内腔观察到的表面或内部组织，或分布在血浆中的单个细胞。这些步骤的组合形成了简单的临床方案，远在开始上述步骤之外的视觉判断之前，这些方案就能够鉴定癌前期的位置以及可疑部位。
具体实施例方式
本发明的方法包括对细胞进行顺序检查，从而首先定位并鉴别具有可疑细胞的组织，然后检查来自这样的可疑组织的细胞，以便检测癌性或肿瘤表型的存在。肿瘤表型包括任何突变，例如与癌相关的等位缺失、异质性丧失、肿瘤抑制基因突变、异常的DNA甲基化或异常的mtDNA。
以下提供了对这些顺序步骤的详细描述，以使本领域技术人员能够实施本发明，同时也是为了指出目前优选的实施例。本描述不应理解为限制本发明的范围，该范围仅在附加的权利要求中进行限定。
步骤1对头颈癌的唾液检查可通过多种方法收集唾液样品。最重要的是收集器具符合聚合酶链反应(PCR)分析的要求，并且在分析之前不破坏核酸的完整性。
PCR分析检测称为微卫星DNA的短重复序列的增加或降低。由于微卫星DNA位于DNA上，其相当于等位基因。已经发现在上皮癌表型中微卫星DNA的突变最常见，因此其尤其适合分析唾液中发现的脱落细胞。授予Sidransky的美国专利6,291,163提供了这种分析的详细描述，在此引入作为参考。
如美国专利6,326,147所述(在此引入作为参考)，PCR分析已变得相当自动化。PCR被认为是允许以微量的核酸序列进行DNA或RNA测序的核酸扩增法。两个美国专利5,98l,293和6,241,689描述了适合收集唾液样品的器具。
即使通过唾液检查发现患者显示癌性表型的阳性指征，也必须在进行适当的预测和治疗前确定癌细胞的位置。另外，即使患者的唾液检查结果为阴性，意味着没有癌的指征，该患者仍需经过彻底的视觉检查(步骤2中描述细胞染色定位)来确定常见的和复现的癌类型。
步骤2细胞染色定位为了以后的体外分子分析，步骤2使操作者能够在体内精确定位并选择可疑的细胞，使临床医生对可疑部位的观察更加深入，使操作者能够在活检中从众多潜在的异常部位中选择可疑的细胞，以便进行分子分析。
本发明优选的实施方式采用美国专利6,086,852中详细描述的改进的体内Mashberg方案。该方案使用甲苯胺蓝O(TBO)染剂对癌性和癌前期组织进行选择性染色。在授予Mashberg的美国专利4,321,251和授予Tucci等的美国专利5,372,801中详细描述了该最初的诊断性筛检，在此引入上述专利作为参考。
已经证实其它阳离子染剂例如天青B、天青C和亮甲酚蓝可用于标记癌性或癌前期的细胞。参见例如授予Pomerantz的美国专利5,882,672，在此引入作为参考。
如果染色技术表明存在癌性或癌前期的组织，则对可疑组织进行外科切除活检和随后进行分子分析，该分子分析步骤描述于本文的“步骤3分子分析诊断-预测”，如果分子分析认为来自异常组织的细胞是恶性或癌前期的，则可以得出癌或最终发展成癌的预测/诊断。
步骤3分子分析诊断-预测用于分子分析的细胞样品获自各种活检技术，这些技术通常包括切除一小片可疑组织用于分子分析。组织切除或提取的方法根据不同的活检类型而不同。例如，活检样品可包括部分患病的皮肤或分离的血细胞，例如红细胞、白细胞、淋巴细胞、甲状旁腺组织；唾液腺组织；鼻粘膜组织、口咽组织、开放性肺组织、小肠组织等。然后进行分子分析以确定可疑组织的活检样品是否为癌性或癌前期的。
根据可用的设备、分析师能力或细胞样品的性质来选择分子分析的靶点，即对DNA、mRNA、DNA甲基化、端粒酶活性或mtDNA进行分析。细胞样品的分子分析需要在各种方法中选择。凝胶电泳、基于聚合酶链反应(PCR)的化学、滚环式扩增(RCA)单分子测定系统、荧光标记、免疫组化染色、质谱法和比色法是有效的分子分析法的典型例子。细胞样品的性质、提取和核酸消化将影响对最佳分析的具体分子分析法的选择。
在本发明优选的实施方式中，使用的分子分析法是通过PCR分析鉴定微卫星标记即DNA的重复序列的方法。然而应该理解，本发明的方法可包括任何可靠的用于鉴定细胞组分是否显示癌性或野生型表型的分子分析技术。
I.聚合酶链反应(PCR)，常见的微卫星不稳定性(MSI)检验MSI可由扩增的微卫星DNA序列的电泳分解法来鉴定。为了进行MSI检验，获得手术切除的肿瘤组织块——新鲜冰冻标本或用福尔马林固定并用石蜡包裹的标本。将肿瘤组织微切以使肿瘤组织与正常组织分开，并从两种组织中提取DNA。使用PCR将这些样品中的基因组DNA样品扩增成一组特异的单核苷酸和双核苷酸微卫星位点。
随后通过电泳分析PCR产物。将肿瘤DNA的PCR产物中的附加带(正常DNA中未观察到)评为在该位点(或特定位置)不稳定性。根据工业标准，MSI分析需要使用5个MS标记，其中两个单核苷酸重复单元和三个双核苷酸重复单元。根据国家肿瘤研究所(National CancerInstitute)关于MSI检查的一致声明，将在五个不同位点中的两个或两个以上位点显示不稳定性的任何样品均评为高MSI。详细内容见Guo Z.，Yamaguchi K.，Sanchez-Cespedes，M.，Westra W.H.，Koch W.M.，Sidransky D.，“Alleic Losses in OraTest-directed Biopsies ofPatients with Prior Upper Aerodigestive Tract Malignancy”，Clinical Cancer Res.，71963-1968，2001。在授予Sidransky的美国专利6,291,163中公开了能够使本领域技术人员进行微卫星分析的进一步的详细内容，在此引入作为参考。在美国专利6,326,147中描述了自动PCR分析，在此引入作为参考。
II.凝胶电泳首先选择性消化核酸链，然后经电泳使分子(例如蛋白质和核酸)通过凝胶(例如聚丙烯酰胺凝胶)进行迁移，并根据大小分成带。
III.RCA滚环式扩增(RCA)是固定于表面的DNA复制反应，其可显示单分子定位事件。RCA成功显示周围血淋巴细胞或伸展的DNA纤维中小至50nt的目的DNA序列。RCA的信号扩增可与核酸杂交和多色荧光成像偶联，以检测细胞学背景中DNA的单核苷酸变化或单DNA分子中的单核苷酸变化，使得能够进行直接物理单体型分析和基于逐个细胞的体细胞突变分析。可对每个由RCA产生的扩增后的DNA分子定位并将其作为不连续的荧光信号成像，这表明了特定的分子连接事件。表达概图也可为单分子计数的直方图。将授予Lizardi的美国专利6,329,150和6,210,884在此引入作为参考，以提供足够详细的说明，使得本领域技术人员能够采用RCA技术实施公开的本发明。
IV.DNA印迹DNA印迹可鉴定正常和突变等位基因的差别并鉴定其他基因组中的相关基因。在DNA印迹中，克隆的或扩增的DNA由限制性酶消化。通过电泳使各种大小不同的DNA片段分离，并将其转移至硝化纤维滤纸上。然后使片段与探针杂交，但只检测出包含与探针碱基序列同源或相同的序列的DNA片段。当碱基变化产生或破坏用来消化DNA的限制性酶的位点时，检测出个体间的单碱基差异。以这种方式也可检测限制性酶产生的改变片段大小的缺失或DNA插入。美国专利号5,811,2391在此引入作为参考，其描述了由DNA印迹检测单碱基对DNA序列的方法。
V.荧光标记由称为DNA测序的方法鉴定克隆的或PCR扩增的DNA片段的精确碱基序列。DNA测序通过对四个DNA碱基中的每一个使用不同颜色的荧光标记而自动化，由此每一种染色体“染剂”发射出的荧光信号可通过敏感的扫描仪读取并通过计算机分析。
VI.DNA探针探针是粘连于稳定物质的DNA或其他核酸的一段序列。然后将探针与游离核酸的靶点接触，该游离核酸的同一性已通过(该探针)由杂交反应(术语见Phimster BNat Genet 21[增刊]1-60，1999)检测。探针通常由发生杂交后可检测的放射性同位素或化学物质标记。例如，可将化学发光标记，例如1，2-二氧杂环丁烷、碱性磷酸盐或生物素用作杂交探针来检测由Church和Gilbert的测序流程产生的膜上的核苷酸序列梯，见Church，G.M.，Gilbert，W.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 81，1991-1995，(1984)。
VII.微矩阵可将在惰性物质如玻璃或尼龙上的高速机器人技术制造的DNA微矩阵用于鉴定基因和基因突变。将预选定的探针与“目的”DNA接触，然后利用各种显示和信息处理程序和策略分析其杂交模式。可同时对多个基因进行测定并分析基因或基因突变的鉴定和基因表达的水平，并且其比其他许多方法更快。
这些微矩阵有多个名称，例如基因组芯片、生物芯片、DNA芯片、DNA微矩阵、基因矩阵和GeneChip(“Affymetrix”的注册商标)。
实施例以下实施例为本领域技术人员示例性地说明目前本发明优选的实施方式，而不作为对其范围的限制。
实施例I通过Mashberg类型的临床方案定位可疑组织制备临床检验溶液在纯水(USP)、冰醋酸和SD18乙醇中溶解TBO(例如，美国专利6,086,852实施例1的产物)、覆盆子香味剂(IFF Raspberry IC563457)、三水醋酸钠缓冲剂和过氧化氢(30％USP)防腐剂(见美国专利5,372,801)，以产生TBO检验溶液，其具有表A所示的组成
表A组分 重量％TBO产物 1.00香料 .20缓冲剂 2.45防腐剂 .41醋酸 4.61乙醇 7.48水 83.85100.00在纯水、苯甲酸钠防腐剂和覆盆子香料中制备1重量％醋酸的预冲洗和后冲洗检验溶液。
临床方案以工作服覆盖患者以保护其衣服。预计患者有痰，因此为患者提供10盎司的杯子，可在传染性废物容器中处理该杯子或可将其内容物直接倒入水槽的下水道中央，以避免污染水槽。覆盖或自检验区移去可能被污染的环境表面或物体。
进行视觉口腔癌检查，不使用任何可能划伤或切伤软组织的器具。标记软组织和牙齿的染色前外观。
患者以约15ml的预冲洗溶液漱口约20秒并吐出，以除去过多的唾液并提供一致的口腔环境。随后再以另外的预冲洗溶液重复本步骤。
然后患者以水冲洗并含漱20秒并吐出。
然后患者以30ml的TBO检验溶液冲洗并含漱1分钟并吐出。
然后患者以15ml的后冲洗溶液冲洗20秒并吐出。重复本步骤。
然后患者以水冲洗并含漱20秒并吐出。重复本步骤。
然后使用适合的软组织检查技术观察口腔，需要的话还包括采取缩舌、很平衡的照明和放大等措施。观察并记录保留有蓝色的可疑病变的位置、大小、形态、颜色和表面特征。
10-14天后将患者召回以重复上述方案。在此期间可使首次检查时造成的任何溃疡性或创伤性病变或引起疼痛的病因得以消除。进行第二次检查后，在首次检查发现的可疑区域的染色呈阳性被认为是癌性或癌前期组织的指征。
成红细胞发生早期病变时被染成蓝色，且通常为带状或片状。然而，舌背的不规则乳头状裂隙通常也可保留染剂，这不是阳性指征。其他保留蓝色但不认为是阳性的区域包括牙斑、每个牙齿的齿龈边缘、由舌背保留的染色转移的染剂引起的软腭的弥散性染色，和易于区别的溃疡性病变。然而在所有例子中，对高度可疑但用本检验未染成阳性的损伤，则无论如何必须进行活检和进行分子分析。
实施例II基因改变的分子分析自实施了实施例1的检查步骤的各种临床部位获得可疑组织的58个样品。因为在其中两个样品的载玻片上的物质不足，认为不可能分析其中两个样品的基因改变。在余下的56个病例中，使用激光捕获微显微解剖观测设备从正常组织小心地分离肿瘤细胞(具有癌的病例)或从正常组织小心地分离上皮细胞(在其他所有病例中)。这可使在三个重要位点进行用于随后微卫星分析的细胞分离和DNA提取。在15个病例中，DNA不足，不可能进一步分析。选择用于检验的其中两个位点(D9S171和D9S736)位于包含p16基因的染色体区9p21上。第三个标记(D3S1067)位于染色体3p21上。对余下41个病例的所有分子研究均在不明其病理诊断的情况下进行。
在研究中，分开鉴定染成蓝色的病变和活检在染蓝部位旁但不在其中的病变。因此，在许多病例中，可直接同时检验染色的区域和邻近的未染色区。所有这些41个病例的关键标记的微卫星分析显示LOH(染色体缺失)实际上存在于所有患有癌和原位癌的病例中。此外，许多发育异常的病变和非发育异常的病变以及那些类别未知(无病理诊断)的病变也具有克隆遗传改变。
如所期望的，在12个癌病例中鉴定了克隆遗传改变。在所有4个原位癌或严重发育异常的病例中，也鉴定了克隆改变。在57％的发育异常的病例中(7个中的4个)和85％的没有发育异常的病例中(14个中的12个)，在一个或一个以上的这些标记中发现了克隆基因改变。在未知组织学的病例中，在25％(4个中的1个)的病例中鉴定了克隆基因变化。总之，通过微卫星分析，在80％的病变(41个中的33个)中鉴定了克隆改变。分子分析明确表明，约80％的由Mashberg类型的方案鉴定的病变是克隆的。
为了能使本领域的技术人员理解并实施本发明，上文描述了本发明并且列举了目前优选的实施方式。
权利要求
1.检测和诊断癌性或癌前期组织的预测/诊断方法，所述方法包括结合并顺序地实施以下步骤(a)对上皮组织局部应用使癌性和癌前期组织选择性染色的染剂以定位可疑组织；(b)自所述的可疑组织分离细胞；并(c)对所述细胞进行分子分析以确定所述提取的细胞是否显示与细胞分化或癌相关的特征。
2.如权利要求1所述的方法，其中在进行步骤(a)前进行唾液癌检，以确定癌性或癌前期组织是否存在于头部和颈部组织中，随后对所述的头部和颈部组织实施步骤(a)。
全文摘要
对上皮组织局部施用使癌或癌前期组织选择性地染色的染剂来确定染色部位，在该染色部位获得组织样品，通过分子分析来确定细胞是否显示与细胞分化或癌相关的特征。
文档编号G01N33/48GK1558956SQ02818701
公开日2004年12月29日 申请日期2002年10月5日 优先权日2001年12月14日
发明者道格拉斯·D·伯克特, 道格拉斯 D 伯克特 申请人:日拉生物技术公司