细胞能力检验的制作方法

专利名称：细胞能力检验的制作方法
技术领域：
本发明涉及确定受试者造血的细胞能力的方法，该方法包括以下步骤(a)确定从受试者得到的血样中存在的白细胞量，其中所述受试者已经被施与单剂量G-CSF并且已维持了一定时间，该时间足够允许白细胞从造血和贮藏组织以及边集(margination)部位动员或释放到血液；和(b)通过用对照受试者动员或释放的白细胞的量对步骤(a)中确定的白细胞量进行评估来确定造血的细胞能力，其中所述对照受试者选自具有(i)与高剂量细胞毒性化学治疗和/或造血细胞移植相关的疾病、失调或并发症的高危性，(ii)与高剂量细胞毒性化学治疗和/或造血细胞移植相关的疾病、失调或并发症的中危性或(iii)与高剂量细胞毒性化学治疗和/或造血细胞移植相关的疾病、失调或并发症的低危性的受试者。本发明还涉及选择抗微生物适宜的预防或治疗、嗜中性粒细胞减少性发热的适宜的预防或治疗、移植CD34+细胞的适宜量、受试者造血生长因子的适宜量或支持治疗的适宜水平的方法。最后，本发明所包括的是从受试者得到的白细胞的用途，用于制备诊断与高剂量细胞毒性疗法和/或造血细胞移植相关的疾病、失调或并发症的易感性的诊断组合物，其中所述受试者已经被施用单剂量G-CSF并且已维持了一定时间，该时间足够允许白细胞从造血和贮藏组织以及边集部位动员或释放到血液中。
恶性肿瘤的细胞毒性化学治疗后骨髓抑制和造血恢复是治疗相关的发病和死亡的主要决定因素(Bodey 1966；Link 1994)。从骨髓或外周血收获的自体造血干细胞和祖细胞的移植可挽救高剂量治疗后宿主的造血功能。高剂量疗法显示出淋巴瘤或多发性骨髓瘤患者中有利的疾病控制和存活(Philip 1995；Attal 1996；Barlogie 1997；Lenhoff 2000)。动员的外周血干细胞(PBSCs)由于是更快移入的移植而几乎完全代替了自体骨髓作为移植物的使用(Beyer 1995；Schmitz 1996)。PBSC移植物中CD34+细胞的数目是干细胞和祖细胞数量的标记并且和造血恢复相关。尽管可精确确定CD34+细胞的数目，但是在造血恢复的预测中仍然存在大的易变性(Bensinger1995；Tricot 1995；Weaver 1995；Ketterer 1998)。对细胞毒性疗法后在造血恢复中起作用的宿主因素的定义不充分(Tricot 1995；Bolwell 1997)。
使用动员的PBSC通常使高剂量疗法后的中性白细胞减少症减少，虽然该症在一些天都是严重的。大多数患者发生表明感染的嗜中性粒细胞减少性发热(Kolbe 1997；Reich 2001)。感染的临床发病病程是可变的并且许多患者并发症可以成为致命的。
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是对嗜中性粒细胞产生和发挥功能特异的造血生长因子。其增加骨髓中嗜中性粒细胞祖细胞的增殖速率并加速嗜中性粒细胞的成熟(Lord 1989)。现今G-CSF的主要应用是降低嗜中性粒细胞减少性发热的危险并动员PBSCs(Ozer 2000)。
骨髓抑制患者的危险评估，如果可能的话，可用于明确支持治疗的不同水平，可用于将造血生长因子的应用和剂量以及抗微生物预防和治疗的强度和持续时间分级。
从而，本发明根本的技术问题是提供与高剂量化学治疗和/或造血细胞移植相关的疾病、失调或并发症的预测、诊断、预后和治疗的手段和方法，从而上述不希望的副作用可以被避免、改善或充分治疗。
通过权利要求书表征的实施方案解决了本发明根本的技术问题。
因此，本发明涉及确定受试者造血的细胞能力的方法，其包括下述步骤(a)确定从受试者得到的血样中存在的白细胞量，其中所述受试者已经被施与单剂量G-CSF并且已经维持了一定时间，该时间足够允许白细胞从造血和贮藏组织以及边集部位动员或释放到血液；和(b)通过用对照受试者动员或释放的白细胞量评估步骤(a)中确定的白细胞量来确定造血的细胞能力，其中所述对照受试者选自具有(i)与高剂量细胞毒性化学治疗和/或造血细胞移植相关的疾病、失调或并发症的高危性，(ii)与高剂量细胞毒性化学治疗和/或造血细胞移植相关的疾病、失调或并发症的中危性或(iii)与高剂量细胞毒性化学治疗和/或造血细胞移植相关的疾病、失调或并发症的低危性或者为此的易感性的受试者。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及上述方法，其中在步骤(b)中，对照受试者是健康受试者。在本发明的进一步优选的实施方案中，通过将在步骤(a)中确定的白细胞数与一个或多个对照受试者的白细胞数的存储数字或范围比较来进行评估，其中一个或多个对照受试者优选为健康受试者。
此外，本发明设想在步骤(b)中，白细胞的量存在于来自对照受试者的血样中，其中所述白细胞已经被动员或释放。
术语“造血的细胞能力”指预测与高剂量细胞毒性化学治疗和/或造血细胞移植相关的疾病、失调或并发症的诊断、预后和治疗的值。所述值可如下述和相关的实施例中确定。其代表在细胞毒性疗法，如高剂量化学治疗后受试者中由于施用单剂G-CSF所诱导的白细胞。造血的细胞能力表示所诱导的白细胞峰对相对尺度和/或类别的影响。通过将白细胞峰归类成＜25个百分点、＞25个百分点、＜50个百分点、＞50个百分点、＜75个百分点、＞75个百分点，或者转化成关于分布的中位数(其可设为1.0)的相对值可以计算造血细胞能力；也见相伴的实施例。
术语“白细胞”包括B淋巴细胞和T淋巴细胞、粒细胞(嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、单核细胞和巨噬细胞以及它们的前体或衍生自它们的细胞。
如按照本发明所用的术语“受试者”涉及动物，优选脊椎动物，和人类。
如此处所用的术语“施用”指蛋白质或多肽，如G-CSF的所有适宜的施用模式。这些施用模式包括G-CSF的静脉内和皮下施用。而且，该物质还可与其他物质组合以共同的药物组合物施用或者作为分别的药物组合物施用。
术语“单剂”指在测定造血的细胞能力前以特定的时间间隔将G-CSF施用于患者并进行医学治疗的其他步骤，如PBSCs或造血生长因子的移植或对受试者的抗微生物治疗。然而，所述术语不必需要G-CSF仅仅施用一次，相反，单剂G-CSF也可以在几步中独立地施用。按照本发明的方法施用的单剂G-CSF可以在细胞毒性治疗之前、之中或之后给予。优选地，所述单剂在给予细胞毒性治疗之后施用。当细胞毒性治疗包括为了这种细胞毒性治疗施用几次一种或多种治疗剂时，优选期望在细胞毒性治疗中施用所述G-CSF单剂，从而当为这种细胞毒性治疗已经第一次施用了一剂治疗剂时，但是在为这种细胞毒性治疗而施与最后一剂相同的或另一种治疗剂之前施用了所述G-CSF单剂。更优选地，所述时间间隔为约1到约120小时。更优选地，所述时间间隔为约1小时、约2小时、约6小时、约10小时、约12小时、约14小时或约18小时。
在本发明的另一个实施方案中，单剂G-CSF可独立于细胞毒性治疗和/或造血细胞移植施用。从而术语“造血的细胞能力”也可以指疾病、失调或与感染相关的并发症的诊断、预后和治疗的预测的值。所述值可如下面和相伴的实施例所描述的确定，独立于具有细胞毒性治疗和/或造血细胞移植的病人的先前治疗。其代表由于在受试者中施用单剂G-CSF而诱导的白细胞。造血的细胞能力表示所诱导的白细胞峰对相对尺度的影响。通过将白细胞峰归类成＜25个百分点、＞25个百分点、＜50个百分点、＞50个百分点、＜75个百分点、＞75个百分点，或者转化成关于分布的中位数(其可设为1.0)的相对值可以计算造血细胞能力；也见相伴的实施例。此外，术语“单剂”也可以指在测定造血的细胞能力前G-CSF被以特定的时间间隔施用，独立于医学治疗的其他步骤，如对受试者的造血生长因子或抗微生物治疗或造血移植。所述术语不必要求G-CSF仅仅被施用一次，相反，单剂G-CSF也可以在几步中均施用。按照本发明的方法施用的单剂G-CSF可独立于细胞毒性治疗施用，和/或没有任何细胞毒性治疗。
术语“G-CSF”指具有粒细胞集落刺激因子的生物学活性的多肽或蛋白质，其描述如Filgrastim(h-metHu G-CSF)in clinical practice，Eds.George Morstyn，第二版1998，Marcel Dekker Inc，纽约；Kubota 1990；Asano 1991；Welte 1996。术语多肽和蛋白质在此处为同义词。优选地，所述G-CSF蛋白或多肽具有如Genbank登记号CAA27291(SEQ ID No1)或CAA27290(SEQ ID No2)所示的G-CSF的至少为成熟序列的氨基酸序列，其中氨基酸1到30位对应于信号序列，氨基酸31到207位对应于负责G-CSF生物学活性的成熟多肽。此外，如Genbank登记号CAA01330(SEQ ID No3)或CAA01319(SEQ ID No4)所示的氨基酸序列也对应于成熟G-CSF多肽。治疗适宜的G-CSF组合物可通过商业途径得到并且在下面详细描述。G-CSF多肽或蛋白质还包括与上面提到的任一序列具有至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一的氨基酸序列的分子变体。在本发明的一个优选的实施方案中，可以使用具有EP0459630中提供的任一序列的G-CSF变体。同样，G-CSF的修饰序列可以按照EP0459630的教导制备，并且如此制备的G-CSF可以按照本发明使用。优选地，具有如上描述的G-CSF生物学活性的所述分子变体，而且，具有如上述G-CSF的生物学活性的G-CSF片段也按照根据本发明的方法被包括。那些片段可含有成熟G-CSF多肽的N-和C-末端缺失。最后，还位于本发明方法的范围内的是上述G-CSF蛋白的融合蛋白、其分子变体或片段。所述融合蛋白除了含有所述G-CSF蛋白、其分子变体或其片段之外还含有可从与G-CSF不相关的蛋白如抗体衍生的氨基酸序列。然而，所示融合蛋白必须显示出此处提及的G-CSF的生物学活性。本发明还包括上面提到的蛋白和多肽的所有适宜的化学修饰，象PEG化。PEG化方法是本领域技术人员公知的。US 6,166,183教导了PEG化的人G-CSF、其生产和用途。
上面提及的蛋白或多肽可在适宜的稀释剂中施用。选择稀释剂使得不影响组合的生物学活性。这些稀释剂的实例为蒸馏水、生理盐水、林格溶液、葡萄糖溶液和Hank’s溶液。此外，药物组合物或制剂也可以含有其他载体、佐剂或非毒性、非治疗性、非免疫原性稳定剂，等等。而且，所述蛋白或多肽可与其他治疗剂，如标准药物、抗微生物剂、单克隆抗体和其他重组生长或发育因子共同施用。
术语“抗微生物剂”旨在包括预防或治疗与细菌、真菌、病毒、原生动物或寄生虫感染相关的疾病、失调和/或并发症的治疗剂。
术语“足以允许白细胞动员或释放的时间”指白细胞被G-CSF激活所需要的时间和它们需要被动员并进入血液中的时间。所述时间窗口值可在不同的受试者类别和同一类受试者不同的个体之间变化。然而，本领域技术人员可容易地采用本发明的方法而不用进一步的创造性劳动。
术语“造血和贮藏组织以及边集部位”包括能够产生、贮藏或容纳白细胞的组织和器官。所述组织或器官或位置包括肝脏、骨髓、脾、淋巴器官、肺、皮肤、血管内皮或微循环。
术语“评估”包括将本发明方法的步骤(a)中确定的白细胞的量与在对照受试者中动员或释放的白细胞的量相关联，其中已知所述对照受试者具有与高剂量细胞毒性化学治疗和/或造血细胞移植相关的疾病、失调或并发症的明确的危险或易感性。优选地，通过比较所述白细胞的量或由此得到的统计值实现所述评估。适宜的统计值及其计算是本领域中熟知的并且包括中位值和分布。此外，在相伴的实施例中描述了怎样进行本发明的评估的详细方法。最优选地，如在相关的实施例中所示的，通过比较确定的白细胞量和具有上面提到的疾病、失调或并发症或易感性危险的经分类对照组来进行评估。术语“对照受试者”指已经通过本发明的方法建立了造血的细胞能力并且疾病、失调、并发症或因此的易感性的危险已经从基于实验进行危险评估的以前资料中知道的受试者。术语“对照组”指与本发明所提及的疾病、失调、并发症或因此的易感性的危险分类的属于相同组的对照受试者。
术语“高度危险”、“中度危险”和“低度危险”指优选在受试者被下面的一种疗法，如高剂量化学治疗治疗后，患有疾病、失调、并发症或因此的易感性的个体素质的差异。所述高、中或低危险可通过统计学分析。优选地，具有高度、中度或低度危险的受试者或一组受试者之间的差异是统计学显著的。这可通过熟知的统计学技术包括Student’s t-检验、卡方检验、Wilcoxon-Mann-Whitney检验、Kurskal-Wallis检验或Fisher’s精确检验、log-rank检验、逻辑回归分析或Cox模型。最优选地，如相伴的实施例中所描述的分析危险组，由此进行探索性数据分析并关于中位值、25％和75％百分位数形成危险组。基于该分析，可定义危险组形成的相对取舍点值。在具有接收的相似或相同的化学治疗的组内，绝对白细胞值也可用作取舍点。术语“相似的或相同的化学治疗”优选指这些化学治疗其中在基本相同的时间点达到基本相同程度的骨髓抑制。取决于比较的组数，通过Wilcoxon-Mann-Whitney检验或Kurskal-Wallis检验来检验组的连续变量中的差异。对于命名类别或规则类别，对趋势应用Fisher’s精确检验或卡方检验。不用进一步的劳动，本领域技术人员可进行上述检验或Cox模型的多层次多变量分析以便检查预测性因子的独立影响并建立不同的危险组。
术语“与高剂量细胞毒性化学治疗和/或造血细胞移植相关的疾病、失调或并发症或因此的易感性”包括已经被报导的由该方法导致或与该方法相关的那些疾病、失调或并发症。优选地，这些疾病、失调或并发症包括那些在下面清楚地提出的。有利地，按照本发明的方法已经发现通过确定已经被细胞毒性化学治疗治疗的受试者中G-CSF所产生的白细胞峰，可以产生用于与高剂量细胞毒性化学治疗和/或造血细胞移植相关的疾病、失调或并发症的危险进行评估的预测性值。在G-CSF施用后的几小时内，白细胞进入循环。按照本发明的方法，已经观察了在高剂量治疗后给予单剂G-CSF和自体移植与造血恢复相关的外周血干细胞(PBSCs)后的白细胞峰。性别不匹配的同种异体造血移植接受者中血白细胞XY染色体的荧光原位杂交(FISH)表明移植后早期且在G-CSF施用下的外周血白细胞主要是宿主而不是移植物来源的(Arseniev 1997)。为了进一步排除自体移植对该现象的任何贡献，在自体移植前施用G-CSF并且调查是否诱导的短暂白细胞峰是宿主造血能力的功能性度量并且将预测高剂量细胞毒性化学治疗后的造血恢复和相关的变量。
高剂量化学治疗后施用单剂G-CSF，由循环中早期白细胞峰的值预测中性粒细胞减少和白细胞减少的持续时间和严重性以及宿主造血作用的恢复速率。细胞能力检验后评估的血液学参数优选为一个或多个以下参数嗜中性粒细胞和血小板恢复的时间和白细胞减少＜1000/μl的持续时间、中性粒细胞减少＜500/μl的持续时间和骨髓抑制时血液中残余的嗜中性粒细胞/白细胞水平。令人惊奇地，细胞能力检验和已知与骨髓移植导致的发病和死亡相关的这些血液学参数之间的相关性高度显著。因此，细胞能力检验似乎提供了宿主造血作用从而克服细胞毒性治疗影响的能力的一种量度。优选地，在细胞能力检验的时间点，血细胞数仍然是正常的或者接近正常，检验结果可有利地被认为用于处理骨髓抑制和/或移植物的时间期间。细胞能力检验可在细胞毒性治疗之前、之中或之后的时间点使用。细胞能力检验产生了关于评估失调、并发症和/或疾病可能性的预测。该预测可被有利地使用以确定疗法的中止和/或治疗的改变。从而，测量出非常低的细胞能力检验值后，可以决定不再(进一步)施用细胞毒性疗法和/或移植。备选地，优选当测量出低到中等的细胞能力检验值时，可决定应该改变疗法。例如，可通过例如减少一种或多种其中使用的细胞毒性剂的剂量，和/或通过省略这些细胞毒性剂的至少一种，和/或通过将选择细胞毒性剂和/或剂量和施用它们的方案改变成另一种方案来改变细胞毒性疗法，从而细胞毒性疗法对病人的造血系统具有较小的抑制效果。此外，当施用移植术时，可以考虑更高数目的CD34+细胞以便重构患者的造血系统。备选地或额外地，可以考虑同种异体的或自体造血干细胞的移植，以便(更快)重构患者的造血系统。另外，可以改变通常给予的标准抗生素治疗以便包括其他抗生素、不同的抗生素和/或更高剂量的抗生素治疗，以便更有效地防止和/或治疗感染和相关的并发症、失调、疾病和/或病症。术语“抗生素”此处应该被理解为包括有效抵抗细菌、寄生虫、原生动物、真菌和/或病毒的物质。
当比较从不同患者或患者组得到的白细胞数时，可以进行值的正态化。为此，可以使用相对尺度，从而仅仅比较数目的相对增加。备选地，或者组合地，可以使用归类，例如，如在下面的实施例中使用的归类，其中值被以四分位数归类。在本发明的另一个实施方案中，基于通过细胞毒性化学治疗达到的骨髓抑制的程度和/或存在于患者和/或对照受试者中的骨髓抑制的程度进行正态化。使用这种正态化，可以有利地比较在评估细胞能力的时间点时具有不同程度的骨髓抑制的不同患者组。
当增加细胞毒性化学治疗的开始到单剂G-CSF之间的时间间隔时，试验诱导的白细胞峰的中位值将因为可得到的成熟血细胞减少而较低。然而，这对造血恢复的速率没有影响。考虑到这一点，可以分别地对类似方案组在相对尺度上评估白细胞峰。这些关于分布中位值的相对值构成了如上面讨论的连续的细胞能力检验结果。
细胞能力检验自身独立于外周血干细胞(PBSC)移植，因为检验在输入冷冻保藏的PBSCs之前进行。自体PBSCs的移植补充了化学治疗耗尽的祖细胞库。在多变量分析中，细胞能力检验独立于预测造血恢复中PBSCCD34+细胞的剂量效应。
高剂量化学治疗后动员PBSCs的使用导致的快速造血恢复(Beyer1995；Schmitz 1996)和相关的良好耐受性和低于5％的低治疗相关死亡率已经在基于门诊病人的基础上进行自体移植方面激起了兴趣(Meisenberg1997；Herrmann 1999；Palumbo 1999)。细胞能力检验＞1.0并且当至少标准剂量的CD34+细胞(＞2.5×106/kg)被移植时，作为可能性建议门诊病人治疗(也见下面的实施例3-5)。在该有利的组中，有最优的嗜中性粒细胞和血小板恢复，该恢复分别在10和12天完成。因此，在该组中，造血恢复的发生没有延迟并且显著降低了感染的危险和对抗微生物治疗的需要减少。有利地，由于可以进行细胞能力检验，可以确定实现有利的造血恢复所进行的移植所需要的阈值CD34+细胞数。嗜中性粒细胞减少性发热经常是细胞毒性化学治疗后癌症病人感染的最初迹象和标志。其与显著的并发症率相关并且通常导致住院和进行作为标准治疗的经验性的广谱静脉内抗微生物治疗(Pizzo 1993)。已经开发了包括各种临床特征的危险模型以限定具有嗜中性粒细胞减少性发热的病人的并发症危险(Talcott 1992；Klastersky2000)。低危险患者是经验性口服抗微生物疗法(Kern 1999；Freifeld 1999)或门诊病人治疗(Talcott 1994；Rubenstein 1993)的候选者。明显地，化学治疗的强度是嗜中性粒细胞减少性发热的一个重要的危险因素而且也是个体容易感染的一个重要的危险因素。化学治疗后低白细胞数可预测嗜中性粒细胞减少性发热的发生(Blay，1996)。第一周期化学治疗后嗜中性粒细胞最低点预示随后在下面的周期中发生嗜中性粒细胞过低、化学治疗剂量减少或治疗延迟(Silber，1998)。然而，细胞能力检验是发生嗜中性粒细胞减少性发热、有记载的感染和需要的静脉内抗微生物疗法的主要预测方法。即使当接受≤2.5×106CD34+个细胞/kg并因此构成不利组的病例被排除于分析之外，观察到的细胞能力检验和嗜中性粒细胞减少性发热的缺乏和/或有记载的感染之间的连续的直接联系和需要抗微生物疗法的相反联系并没有改变。细胞能力检验为临床医生提供关于个体患者感染危险性的额外的信息。细胞能力检验还提供了危险层次化的手段。
基于本发明的研究，已经建立了本发明的方法，该方法可预测独立于移植的CD34+细胞的剂量效应的造血恢复和预测高剂量细胞毒性化学治疗后感染的危险。而且，本发明的细胞能力检验可将造血生长因子的应用和剂量、将要移植的CD34+细胞数、抗微生物预防和治疗的强度和持续时间和骨髓抑制病人的治疗水平分成不同层次。本发明还包括由于医学治疗、感染或原发和继发性骨髓疾病或失调导致的骨髓抑制或免疫抑制的不同形式中的细胞能力检验。因此，根据本发明，考虑通过应用细胞能力检验和根据细胞能力检验的结果确定适宜的抗微生物、抗真菌和/或抗病毒疗法，任选通过考虑其他关于患者和任选地，他的亲戚的总体健康或疾病状态的数据，来预防通常在骨髓抑制受试者中感染的方法。抗真菌、抗微生物和/或抗病毒疗法可以作为预防性和/或治疗性治疗施用。例如，对于慢性感染，可基于细胞能力检验的结果和任选地，关于患者和任选地，他的亲戚的总体健康或疾病状态的数据，决定患者不能够有效抵抗感染。因此，可以启动治疗性治疗。
此外，基于来自细胞能力检验的低结果，可决定治疗患者的造血和/或免疫系统，而不是治疗感染或通过预防来防止感染。为此，可考虑作为单剂或作为连续剂或作为长期治疗的造血干细胞抑制，或者施用造血生长因子。一种造血生长因子是G-CSF。其他因子包括血栓形成素、GM-CSF、干细胞因子、Fit3配体、红细胞生成素、KGF。
本发明还涉及为受试者选择适宜的抗微生物预防或治疗的方法，其中所述方法包括上面提到方法中的步骤和下面的步骤(c)基于步骤(b)中得到的结果为所述受试者选择适宜的抗微生物预防法或疗法。上面所作的术语的定义和解释已作必要的改动而应用。术语“适宜的抗微生物预防法或疗法”包括有效防止微生物感染或允许对其有效治疗的医学治疗。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述预防法或疗法为治疗、防止或改善感染的预防法或疗法。
在本发明的一个更优选的实施方案中，所述感染选自真菌、病毒、原生动物、寄生虫和细菌感染。
在本发明的一个更优选的实施方案中，感染选自肺炎、侵入性真菌感染、小肠结肠炎、软组织感染和脓毒症。
所述医学治疗可包括施用抗微生物剂或其他物质，如卷须霉素、两性霉素B、氟康唑、三甲氧苄二氨嘧啶-磺胺甲基异噁唑、无环鸟苷、氧哌嗪青霉素/唑巴克坦、庆大霉素、美罗培南、万古霉素或所述抗微生物或物质同时或相继施用的任何组合。可以施用许多其他抗微生物剂或物质。同样，可以给予细胞制剂，象粒细胞注入或其他制剂。这些抗微生物或其他医学治疗的剂量和方案取决于要实施的是预防还是治疗微生物感染。此外，临床医生还必须考虑他/她预计的是什么感染物以及自该患者分离了什么感染物。适宜的抗微生物预防法或治疗法的临界值是受试者造血恢复的能力。这些考虑到目前为止还是基于经验数据做出的。由于本发明，将造血的细胞能力作为受试者中造血恢复和感染危险的关键标志，这一标志可以被确定并允许选择适宜的预防法或治疗法而不用仅仅依赖于经验和平均数据。
此外，本发明涉及为受试者的嗜中性粒细胞减少性发热选择适宜的预防法或疗法，其中所述方法包括上面提到的方法的步骤和另一步骤(c)基于在步骤(b)中得到的结果为嗜中性粒细胞减少性发热选择适宜的预防法或治疗法。
上面作出的定义和解释已作必要的修正后应用。
术语“嗜中性粒细胞减少性发热的预防法或治疗法”包括有效防止嗜中性粒细胞减少性发热或允许其有效治疗的医学治疗。所述医学治疗可经口或静脉内施用抗微生物剂或生物学体液或细胞疗法的一种或其组合。优选地，嗜中性粒细胞减少性发热的有效预防法或治疗法包括施用重组生长和发育因子或细胞因子象G-CSF以及其他药物，以不同剂量和方案进行单一或组合治疗。最优选地，所述重组生长和发育因子或细胞因子被预防性地施用。嗜中性粒细胞减少性发热适宜的预防或治疗的临界值是受试者造血恢复的能力。这些考虑到现在为止都是基于经验数据作出的。由于本发明，造血细胞能力，作为受试者中造血恢复和感染危险的关键标志，可以被确定并允许选择适宜的预防法或治疗法而不用仅仅依赖于经验和平均数据。
此外，本发明涉及为进行受试者的治疗而注入的造血干细胞，优选CD34+细胞的适宜量的选择方法，其中所述方法包括上面提到的方法的步骤和另一步骤(c)基于在步骤(b)中得到的结果选择为受试者的治疗而被注入的所述细胞的量。
上面作出的定义和解释已作必要的修正后应用。
术语“用于治疗的造血干细胞，优选CD34+细胞的适宜的量”指使得有效的造血恢复的所述细胞的量。
本发明还涉及为受试者的治疗选择造血生长因子或细胞因子的适宜量的方法，其中所述方法包括上面提到的方法的步骤和另一步骤(c)基于在步骤(b)中得到的结果为所述受试者的治疗选择造血生长因子或细胞因子的适宜量。
上面作出的定义和解释已作必要的修正后应用。
术语“造血生长因子或细胞因子的适宜量”指支持有效的造血恢复的造血生长因子的量。优选地，所述造血生长因子为G-CSF，或其他因子，象GM-CSF、红细胞生成素、干细胞因子、血栓生成素或KGF，更优选地，G-CSF的适宜的剂量为皮下应用每天约5μg/kg。
本发明的方法包括体外应用。
本发明还包括确定受试者造血细胞的能力的方法，该方法包括以下步骤(a)确定参数，优选样品参数，其中所述样品优选体液，优选血液或来自血样的样品，其中该参数优选为在所述来自哺乳动物的样品中优选造血细胞的细胞群体或亚群的标记，其中所述哺乳动物已经被施用单剂造血生长因子，优选G-CSF，并且已经维持了一定时间，该时间足以允许白细胞从造血以及贮藏组织和边集部位动员或释放到血样中，和(b)通过用以类似方式在对照哺乳动物中测量的参数的值评估步骤(a)中确定的参数的值来确定造血细胞能力，其中所述对照哺乳动物选自具有(i)与高剂量细胞毒性化学治疗和/或造血细胞移植相关的疾病、失调或并发症的高危性，(ii)与高剂量细胞毒性化学治疗和/或造血细胞移植相关的疾病、失调或并发症的中危性或(iii)与高剂量细胞毒性化学治疗和/或造血细胞移植相关的疾病、失调或并发症的低危性的哺乳动物。
甚至更优选地，所述哺乳动物为人。更优选地，所述标记为T细胞相关标记，或者B细胞相关标记。在本发明范围内的标记在例如实施例7中详细说明。
最后，本发明包括治疗如此处特定的受试者中与高剂量细胞毒性化学治疗和/或造血细胞移植或因此的易感性相关的疾病、失调或并发症的方法，该方法包括此处特定的方法的步骤和其他步骤对所述患者施用(i)有效量的适宜的抗微生物预防或治疗剂，(ii)有效量的预防或治疗嗜中性粒细胞减少性发热的预防或治疗的适宜的药剂，(iii)有效量的造血干细胞，优选CD34+细胞，或(iv)有效量的造血生长因子。
上面作出的定义和解释已作必要的修正后应用。
所述施用的药剂、细胞或生长因子的剂量方案将由主治医生和其他临床因素决定优选地按照上述方法的任一种。如在医学领域中熟知的，任一病人的剂量取决于许多因素，包括病人的身体大小、身体表面面积、年龄、施用的特定化合物、施用时间和途径、总体健康状况以及同时施用的其他药物。可通过定期评估监控进展。
本发明包括从受试者得到的淋巴细胞的用途，用于制备诊断在所述受试者中高剂量细胞毒性化学治疗和/或造血细胞移植相关的疾病、失调或并发症的易感性的诊断组合物，其中所述受试者已经被施用一剂G-CSF并且已维持一定时间，该时间足以允许白细胞从造血和贮藏组织以及边集部位动员或释放到血液。
上面作出的定义和解释已作必要的修正后应用。
如根据本发明所用的术语“诊断组合物”指从所述受试者得到的白细胞实体，这些白细胞可用于确定所述白细胞的治疗或诊断值，优选地为在血样的给定体积中白细胞的绝对或相对数。根据白细胞数的确定方法，所述细胞可以被预处理，例如用于荧光激活的细胞分选(FACS)分析或可被应用于适宜的计数设备，如计数载玻片。这些预处理方法是本领域中公知的。
根据前面所述，在本发明方法或用途的一个优选实施方案中，所述与高剂量化学治疗和/或造血细胞移植相关的疾病、失调或并发症为嗜中性粒细胞减少性发热、微生物感染、延迟的造血细胞恢复、出血、免疫抑制、针对宿主的免疫学影响、支持治疗的高水平、发病和死亡。
在本发明方法和用途的另一个优选的实施方案中，所述受试者为人。
在本发明方法和用途的另一个优选的实施方案中，所述受试者已经受到高剂量化学治疗。
术语“高剂量化学治疗”指当显著的骨髓抑制伴随着显著减少的外周血白细胞和血小板数以及增加的感染危险时被认为是“高剂量”的化学治疗剂量和强度。取决于化学治疗物质的剂量，可需要或不需要PBSC的移植。经常，在高剂量化学治疗后应用G-CSF或GM-CSF并且需要血红细胞或血小板的输入。
最优选地，所述高剂量化学治疗包括施用美法仑、白消安、环磷酰胺、卡氯芥、依托泊苷(etoposide)和阿糖胞苷或者其他化学治疗物质。在高剂量化学治疗中，可以应用逐步上升的剂量。高剂量方案可由逐步上升剂量的物质和常规剂量的物质组合组成。对于高剂量化学治疗中的额外的免疫抑制，在方案中可包括抗胸腺细胞球蛋白(ATG)或抗淋巴细胞球蛋白(ALG)。
在本发明的方法或用途的另一个更优选的实施方案中，所述受试者已经受到骨髓抑制化学治疗。
术语“骨髓抑制化学治疗”指化学治疗对骨髓功能的效果。当外周血白细胞数和可能的血小板数在一定时间内减少并且之后自发恢复或者在造血生长因子刺激下恢复时，化学治疗是骨髓抑制的。根据骨髓抑制的程度，感染的危险可以增加。
更优选地，所述骨髓抑制疗法包括施用环磷酰胺、依托泊苷、卡氯芥、阿糖胞苷、美法仑、白消安、阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多西他塞、噻替呱、氟达拉滨、长春新碱、宾达氮芥、顺铂、碳铂、柔红霉素、氟尿嘧啶、吉西他滨、去甲柔毛霉素、异环磷酰胺、伊立替康、氨甲蝶呤、米托蒽醌、草酸铂、苏消安、长春碱或长春烯碱。也可以施用其他化学治疗物质。
在本发明的方法或用途更加优选的实施方案中，所述受试者已经受到放射治疗，患者患有原发或继发性骨髓疾病、自身免疫疾病、遗传疾病或失调或者感染。
术语“放射治疗”指离子放射的任何治疗应用。所述放射可以是放射活性放射，包括快电子、中子、质子或Pi-介子、微波、IR和UV辐射。优选地，所述放射被用于治疗癌症或恶性造血疾病。
术语“原发性骨髓疾病”包括原发性影响骨髓细胞的那些疾病或失调。所述疾病或失调的实例为急性或慢性白血病、脊髓发育不良、再生障碍性贫血、先天性嗜中性白血球减少症、周期性嗜中性白血球减少症、先天性和自身免疫嗜中性白血球减少症。
术语“继发性骨髓疾病”包括其中骨髓继发性被牵涉到，如在癌症的骨髓转移的那些疾病和失调。
术语“自身免疫疾病”指与病人中自身抗体的存在相关的那些疾病。所述疾病或失调的实例为类风湿性关节炎或红斑狼疮。
术语“遗传疾病或失调”包括通过遗传缺陷导致的所有疾病或失调，这些遗传缺陷将通过种系遗传。最优选地，本发明范围内的所述遗传疾病或失调为周期性嗜中性白血球减少症、Kostmann综合症、Shwachman综合症和高歇病。
术语“感染”优选包括可导致受试者生命危险状况的感染。感染可导致骨髓抑制的宿主中严重的器官功能失调和器官衰竭。这些感染可由细菌、病毒、真菌、原生动物和寄生虫像葡萄球菌、链球菌、肠球菌、大肠杆菌、克雷伯菌属、绿脓假单胞菌、假丝酵母属、曲霉菌属、肺炎肺囊虫、巨细胞病毒、疱疹病毒、呼吸道病毒和许多其他微生物引起。本领域技术人员可以理解对于骨髓抑制的患者，任何感染都可以是潜在的威胁生命的。然而，应该进一步理解通过本发明也有相关的实施方案，当将要治疗、改善和/或防止的感染可能不是生命威胁的或者不导致生命威胁的情况时。然而，在受试者中细胞能力检验的应用可使得主治医生考虑任何这种感染的治疗、防止和/或改善。
按照上面所说的，本发明提供了确定受试者造血的细胞能力的方法，该方法包括步骤(a)确定从受试者得到的血样中存在的白细胞的量，其中所述受试者已经被施用单剂量G-CSF并且已维持了一定时间，该时间足以允许白细胞从造血和贮藏组织以及边集部位动员或释放到血液；和(b)通过用对照受试者动员或释放的白细胞的量评估步骤(a)中确定的白细胞的量来确定造血的细胞能力。
本发明优选提供了还包括步骤(c)的上面的方法，其中(c)包括基于步骤(b)所得结果为所述受试者选择适宜的抗微生物预防或治疗或造血生长因子治疗。
上面的对照受试者可以是健康的对照受试者。优选地，对照受试者选自具有(i)与高剂量细胞毒性化学治疗和/或造血细胞移植相关的疾病、失调或并发症的高危性，(ii)与高剂量细胞毒性化学治疗和/或造血细胞移植相关的疾病、失调或并发症的中危性或(iii)与高剂量细胞毒性化学治疗和/或造血细胞移植相关的疾病、失调或并发症的低危性的受试者。
在本发明的方法或用途的另一个更优选的实施方案中，所述G-CSF为非格司亭(filgrastim)(NeupogenTM；Amgen Inc.，Thousand Oaks，CA，USA)或雷诺司替(lenograstim)(GranocyteTM；Chugai，日本)。
所述G-CSF制品是商业途径可得到的并且得到药物管理局的批准用于医学治疗的目的。从而，本发明的方法和用途优选应用所述制剂。
优选地，G-CSF的所述剂量选自约1到约100μg/kg所述受试者的体重。更优选地，G-CSF的剂量选自约1到约20μg/kg所述受试者的体重。
同样更优选地，G-CSF的所述剂量为1.0、2.5、5、7.5、10或15μg/kg所述受试者的体重。
更优选地，G-CSF的剂量选自约15到约30、60和约100μg/kg所述受试者的体重。仍然更优选地，G-CSF的剂量选自约20到约30、60和约100μg/kg所述受试者的体重。不被理论所束缚，本发明人认为较高剂量的G-CSF(约15μg/kg所述受试者的体重)导致病人更显著的区别从而可提高细胞能力检验的预测值。这对于没有经历高剂量治疗的患者或者对于健康受试者尤其正确。如果施用备选的剂量例如基于身体表面面积给药，打算使用G-CSP的相似绝对量。
在本发明的方法和用途的更优选的实施方案中，所述足以允许白细胞动员或释放的时间为1到120小时。
同样更优选地，所述足以允许白细胞动员或释放的时间为至少1小时、至少2小时、至少6小时、至少10小时、至少12小时、至少14小时或至少18小时。
在本说明书的正文中引用了一些文献。在说明书末尾和权利要求书前面可发现完整的文献目录引用。此处应用的每篇文献(包括任何生产商的说明书、用法指导等)在此处被引用作为参考。


图1单剂量G-CSF施用后白细胞峰和白细胞时程。在受到高剂量美法仑治疗的患有多发性骨髓瘤系列的患者中观察到(第0天)G-CSF诱导的白细胞峰。在白细胞峰测定后约1小时进行自体PBSC移植。
HDT，高剂量化学治疗图2在嗜中性粒细胞和血小板恢复的预测中细胞能力检验相对于CD34+细胞数的独立性。为分别的CD34+细胞水平显示了嗜中性粒细胞(绝对嗜中性粒细胞数，ANC)(左)和血小板(PLT)恢复(右)的动力学。在各自的CD34+细胞水平中，进行了细胞能力检验的分层(≤中位值，＞中位值)。使用分层的log-rank检验在三个所指的CD34+细胞水平上通过细胞能力检验研究而独立性预测造血恢复。
图3通过细胞能力检验对＞38.0℃的发热和抗微生物治疗的预测。细胞能力检验的分类基于已建立的相对尺度，其中白细胞峰分布的中位数设为1.0。给出了类别中没有＞38.0℃发热(A)的病例和相应的静脉内抗微生物治疗(B)的天数的中位数的比例。在左边，显示数据为病例的全部数目，在右边为接受CD34+细胞数≤2.5×106/kg的病例被排除。
图4G-CSF反应的释放。高剂量化学治疗完成后约30小时给予高剂量G-CSF(5μg/kg)。12-14小时后测定5个不同患者显示的诱导白细胞峰。之后进行自体血干细胞移植。
图5根据幅度(A)以及G-CSF反应与记载的感染率(B)的相关性排列的代表G-CSF反应的WBC峰的分布。
通过参考下面的生物学实施例阐明本发明，这些实施例仅仅是阐明性的而不应被理解为对本发明范围的限制。
实施例1细胞能力检验患者患有多发性骨髓瘤(MM)和复发的非-何杰金淋巴瘤(NHL)或何杰金病(HD)的87名患者，他们在一个研究所中受到标准方案的高剂量治疗(Philip1995；Barlogie 1997；Weaver 1998；Linch 1993，Palumbo 1999)，然后是单剂量G-CSF，之后是自体外周血干细胞(PBSC)移植。患者给予知情同意。患者的特征在表1中给出。
PBSC动员、收获、处理和冷冻保存在大多数患者中，使用G-CSF的IEV方案被用于动员。IEV方案由1-3天静脉内2500mg/m2异环磷酰胺、1天静脉内100mg/m2表阿霉素、1-3天静脉内150mg/m2依托泊苷之后从第5天起每天皮下5μg/kg G-CSF(非格司亭；Amgen，Thousand Oaks，CA，USA)直到PBSC收获完成组成。除了个体剂量减少，年龄≥60岁的MM患者从2000年开始接受75％剂量的IEV。当最低点后G-CSF刺激的白细胞数上升到5000-10000/μL或以上，使用COBE Spectra(COBE，Heimstetten，德国)或AS104(Fresenius，St.Wendel，德国)细胞分离器和标准程序收获PBSCs。在患有MM或低等级NHL的20名患者(23％)中，从单个白细胞除去法得到的经收获PBSC在收集后立即进行免疫磁性B细胞清洗(MaxSep，Baxter Immunotherapy，Unterschleissheim，德国)。将PBSCs与等体积的用5％HSA和100％DMSO(Cryoserv，Tera Pharmaceuticals，Midvale，UT，USA)(4∶1)制备的冰冻溶液混合。最终DMSO浓度为10％。以计算机控制速率的冰冻后，含有PBSCs的包被保存在液氮的蒸汽相中。
CD34+细胞计数和PBSC剂量根据ISHAGE(Sutherland 1993)的方法，使用装备用氩激光的FACScan(BD，Mountain View，CA，USA)或EPICS XL-MCL(Electronics，Miami，FL，USA)进行CD34+细胞的确定。全血在4℃黑暗中与PE偶联的单克隆抗-CD34抗体和FITC偶联的单克隆抗-CD45抗体孵育30分钟，然后洗涤并进行血红细胞裂解(BD)。在1998年以前，分析了20000个细胞，之后分析了75000个细胞。为排除细胞碎片、血小板、剩余的红细胞和所有CD45阴性细胞，使用向前散射对CD45荧光点图。然后定义双阳性CD34+/CD45+细胞群体并保留(backgate)低CD45表达和低侧向散射性质。如此定义的CD34+细胞的百分数与血液净化(apheresis)产物的总有核细胞含量相乘得到收获的CD34+细胞的绝对数目。使用Coulter STKS(Coulter，Miami，FL，USA)通过自动化细胞计数确定有核细胞含量。所用的抗-CD34抗体(HPCA-2)、抗-CD45抗体(2D1)和同种型对照来自BD。
高剂量治疗和自体移植或者根据Barlogie的“总治疗”概念(Barlogie 1997)对患有MM的58个患者(67％)进行治疗并且这些患者将受到3-6个月内的一前一后的美法仑200mg/m2(MEL200)治疗，或者根据Palumbo(Palumbo 1999)，对年龄在60到70岁的患者用一前一后的美法仑100mg/m2(MEL100)治疗。第一轮美法仑200mg/m2后达不到部分好转的较年轻MM患者将接受白消安12-16mg/kg和环磷酰胺120mg/kg作为第二轮高剂量治疗(BUCY)。具有复发的NHL或HD的29个患者(33％)或者被用白消安16mg/kg和环磷酰胺120mg/k(BUCY)治疗或者被用卡氯芥300mg/m2、依托泊苷800mg/m2、阿糖胞苷800mg/m2和环磷酰胺140mg/kg(BEAC)(Philip 1995)或者用卡氯芥300mg/m2、依托泊苷800mg/m2、阿糖胞苷1600mg/m2和美法仑140mg/m2(BEAM)(Linch 1993)治疗。高剂量方案的分布在表1中显示。最后一剂化学治疗后48-60小时进行自体PBSC移植。PBSC产物在床边的37℃水浴融化并在加入20mL ACD-A后通过中央静脉导管回灌注。
G-CSF的应用和血细胞计数如所推荐的(Ozer 2000)，总是在最后化学治疗灌注后24小时以上给予G-CSF。高剂量化学治疗后皮下施用的重组人G-CSF在113例中为非格司亭(Amgen，Thousand Oaks，CA，USA)，在9例中为雷诺司替(Chugai，日本)。在PBSC自体移植前的晚上以5μg/kg的剂量给予评估的单一G-CSF注射。在第二天早上，单G-CSF剂后约14小时用常规血试验检测诱导的白细胞峰。常规血试验后约1小时进行自体PBSCs的移植。从PBSC移植后的那天开始，每天以5μg/kg的剂量给予G-CSF直到白细胞数在发育不全后达到5000/μL到10000/μL。包括差别的常规血细胞计数每天在Coulter STKS(Coulter，Miami，FL，USA)上进行，从高剂量治疗开始直到患者离开医院。
支持治疗在高剂量治疗、自体移植和移植后期间所有患者都住院。抗微生物预防由下面方案组成从自体移植到嗜中性粒细胞恢复每天给予卷须霉素2×250mg。在整个医院停留期间给予口服两性霉素B悬浮剂4×1mL，或者备选地，对于口服两性霉素不耐受时，每天给予氟康唑1×100mg。在用一天两次的甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲基异噁唑160mg/800mg的高剂量化学治疗期间开始卡氏肺囊虫(Pneumocystis carini)局限性肺炎的预防，并且以每周连续2天一天2次继续治疗6个月直到嗜中性粒细胞恢复。对于甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲基异噁唑不耐受时，备选地从自体移植开始每4周进行300mg喷他脒吸入治疗6个月。从高剂量治疗开始以2×500mg剂量给予静脉内无环鸟苷直到嗜中性粒细胞恢复。血红细胞产物和单供体血小板被代替以保持血红蛋白水平高于80g/L和血小板数高于10000/μL。所有血细胞产物都是CMV阴性的，用30Gy辐射并通过白细胞减少过滤器注入。在中性白细胞减少期间单次口服治疗中温度＞38.5℃或者当发热＞38.0℃存在至少一小时后开始经验性的静脉内抗微生物治疗，并且该治疗根据以前出版的方针(Hughes 1997)进行。最初的治疗用氧哌嗪青霉素/唑巴克坦加庆大霉素进行。用美罗培南/万古霉素进行逐步增加。如果在第5-7天发热持续，那么加入静脉内两性霉素B。继续抗微生物治疗直到嗜中性粒细胞恢复和发热消退后至少24小时。嗜中性粒细胞和血小板恢复后抗微生物治疗停止时病人出院。
造血恢复、发热和支持治疗的评估嗜中性粒细胞恢复被定义为从自体移植当天开始嗜中性粒细胞数高于500/μL的第一天。血小板恢复被定义为从自体移植当天开始未被代替的血小板数高于20000/μL的第一天。记录发热＞38.0℃的发生率、发热＞38.0℃的天数和静脉内抗微生物治疗的天数直到患者出院。
目的和统计分析本研究的目的是将G-CSF诱导的白细胞峰和嗜中性粒细胞和血小板恢复、嗜中性粒细胞减少性发热的发生率和静脉内抗微生物治疗的持续时间相关联并将这些相关性和为PBSC自体移植的CD34+细胞含量所得值的相关性相比较。给出的所有分析(除了人口统计学和疾病基线特征之外)都基于作为观察单位的移植过程。
使用根据Kaplan和Meier(1958)的产物-极限方法评估随时间嗜中性粒细胞和血小板的恢复速率，并且使用log-rank检验(Peto 1972)比较预后小组。根据组数，通过Wilcoxon-Mann-Whitney或Kruskal-Wallis分析检验预后组之间的连续变量中的差异。对于命名类别或规则类别，应用对趋势的Fisher’s精确检验或卡方检验。用各自的检验或Cox模型(Cox 1972)的多层次进行多变量分析以便检查预测因子对不同末点的独立影响。所有报道的p-值来自双侧检验。
细胞能力检验的执行在患有多发性骨髓瘤或淋巴瘤的87个患者中122高剂量化学治疗过程后研究单一皮下G-CSF注射(5μg/kg)。约14小时后用常规血试验检测诱导的外周血淋巴细胞峰。这些淋巴细胞峰(图1)由约90％嗜中性粒细胞组成。患者和治疗特征在表1中给出，诱导的白细胞峰、嗜中性粒细胞和血细胞恢复、发热＞38℃的缺乏和对静脉内抗微生物治疗的需要在表2中给出。开始静脉内化学治疗和单G-CSF注射之间的时间间隔对诱导的白细胞峰的中位值有影响。然而，在环磷酰胺的2天静脉内施用之前的BUCY方案中为期4天的白消安的经口施用与为期2天的美法仑的静脉内施用的MEL方案相比并不减小白细胞峰。
对于BUCY和MEL高剂量治疗(在静脉内化学治疗的开始和高剂量G-CSF之间有2.5天的间隔)，中位值白细胞峰为16200/μL。对于BEAM和BEAC高剂量治疗(6.5天的间隔)，中位值白细胞峰为4100/μL，是前者的1/4。然而，该分析的观察到的目标在BUCY/MEL和BEAC/BEAM组之间是可比较的表2)。这建议在相对尺度上评价白细胞峰，该相对尺度通过分布的中位值(设为1.0)定义并且应用于BUCY/MEL和BEAC/BEAM组。为了统计分析，使用低于(≤50.百分位数)和高于(＞50百分位数)中位值和随后使用的≤25.百分位数、＞25.-≤50.百分位数和＞50.百分位数的白细胞峰的分类。相应于最小值、25.百分位数、50.百分位数和最大值的相对尺度上的全部的相对中位值分别为0.15、0.77、1.0和3.66。该检验被称作细胞能力检验。
实施例2造血恢复的预测嗜中性粒细胞(＞500/μL)和血小板(＞20000/μL)恢复的中位值时间分别是9天和10天。细胞能力检验预测了嗜中性粒细胞(p＝0.001)和血小板恢复(p＜0.0001)(表3)。有趣的是，对于检验前的白细胞数，发现与嗜中性粒细胞恢复具有边界显著相关性(p＝0.06)，而与血小板恢复无相关性(p＝0.4)。自体PBSC移植中CD34+的数目也预测了嗜中性粒细胞恢复(p＜0.0001)和血小板恢复(p＜0.0001)(表3)，如所预期的那样。
细胞能力检验自身独立于PBSC自体移植，因为检验在冷冻保藏的自体PBSCs被注入之前进行。诱导的白细胞峰和CD34+细胞数之间的相关性较弱(r＝0.226；p＝0.01)。在多元分析(以分层次的log-rank检验进行)中，在嗜中性粒细胞恢复(p＝0.03)和血小板恢复(p＝0.01)的预测中细胞能力检验的独立影响(＜＝中位值，＞中位值)可以通过不同CD34水平(随着较低的CD34+细胞数增加并改变PBSC自体移植物的CD34+细胞剂量效应)跟踪。在Cox模型(其中自体移植物的CD34+细胞数被作为数量变量包括)中，确证了细胞能力检验对嗜中性粒细胞恢复(p＝0.05)和血小板恢复(p＝0.0007)的独立影响。
实施例3移植有利的CD34+细胞阈值的确定细胞能力检验自身独立于PBSC移植，因为检验在冷冻保藏的PBSCs注入之前进行。在多元分析中，独立于PBSC CD34+细胞剂量效应的细胞能力检验预测了造血恢复。这对为移植选择CD34+细胞的阈值剂量具有实际的结果。由于细胞能力检验＞1.0，＞2.5×106CD34+细胞/kg的移植足以达到有利的嗜中性粒细胞和血小板恢复，分别在10天和12天内完成。对于细胞能力检验＜1.0，延迟的造血恢复的危险增加将建议使用更多数量的CD34+细胞。
实施例4嗜中性粒细胞减少性发热和静脉内抗微生物治疗的预测在122个操作中有55个(45％)无发热＞38℃。具有发热＞38℃的天数的中位值为1天，静脉内抗微生物治疗的中位值为4天。细胞能力检验与发热的缺乏(p＝0.03)和静脉内抗微生物治疗(p＝0.03)持续时间的中位值相关。寻找PBSC自体移植中CD34+细胞数和缺乏发热＞38.0℃的相关性显示了趋势(p＝0.07)但是没有发现与静脉内抗微生物治疗的相关性(p＝0.3)。细胞能力检验和CD34+细胞数都与白细胞减少＜1000/μL的持续时间相关(p＜0.0001)而仅仅细胞能力检验和白细胞减少的严重性相关(p＝0.02)。观察到细胞能力检验和发热缺乏之间的连续直接关系和细胞能力检验与需要静脉内抗微生物治疗之间的相反关系(图3)。对于具有低细胞能力检验＜0.6的小组，发热的缺乏仅仅为21％，而对于具有高细胞能力检验＞2.0的小组，发热的缺乏为80％。接受具有低CD34+细胞数(＜＝2.5×106/kg)的自体移植并因此通过分析代表不利组的病例的排除不改变该相关性(图3)。发生三例与治疗相关的死亡。这些死亡由脓毒症导致。三例治疗相关的死亡中的细胞能力检验为0.15、0.77和1.0。
实施例5门诊病人治疗的可能性高剂量化学治疗后使用动员的PBSCs的快速造血恢复和相关的良好耐受性和低于5％的低治疗相关的死亡率已经激起了对门诊病人进行自体移植的兴趣。细胞能力检验＞1.0联合CD34+细胞的标准剂量(＞2.5×106/kg)，建议可能进行门诊病人的治疗。该格局和最佳的造血恢复(图2)和感染的降低危险(图3)相关。
实施例6影响细胞能力检验和CD34+细胞数的因素发现细胞能力检验或PBSC自体移植中CD34+细胞数与年龄、性别、诊断和用化学治疗和放疗的预治疗没有显著相关性。

表1患者的特征以及高剂量化学治疗和外周血干细胞(PBSC)自体移植的说明


表2单剂G-CSF之前和之后血中的白细胞数、白细胞减少＜1000/μL的持续时间和研究的目标。绝对嗜中性粒细胞数(ANC)的恢复和血小板(PLT)恢复、发热＞38℃的缺乏和静脉内(i.v.)抗微生物治疗的持续是本研究的目标。


表3细胞能力检验和PBSC自体移植中CD34+细胞数与本发明目标的相关性实施例7与造血恢复相关的因素根据上面所描述的细胞能力检验包括哺乳动物的参数或来自哺乳动物的样品的参数的测量，这些参数与造血恢复相关，其中哺乳动物已经被施用造血生长因子。这些参数优选白血细胞数，或白细胞数。所测量的参数的绝对值如上述优选在相对尺度上评估，该相对尺度通过治疗组内—即接受相似或相同治疗的哺乳动物的组内—的分布的中位值(设为1.0)定义。术语“相似或相同的治疗”优选涉及包括放疗和化学治疗剂量、施用时间和其中所用药物的种类的治疗方案。参数优选在来自哺乳动物的样品，如体液或活组织中测量。活组织优选取自健康哺乳动物含有免疫活性细胞的位置。细胞优选T细胞、B细胞、粒细胞、血小板、单核细胞、NK细胞，等等。细胞可来自细胞发育和/或分化的早期或晚期。体液优选为血或来自血。哺乳动物优选为人。生长因子优选G-CSF或在刺激造血系统中具有类似活性的生长因子。例如，血管紧张肽和/或衍生自血管紧张肽的肽(Rodgers等，Cancer Chemother Pharmacol 49(5)403-11，2002)、白介素-1β(Lebedev等，Radiats Biol Radioecol 42(1)60-4，2002)、白介素-8(Terashima等，Blood 92(3)1062-69，1998；Laterveer等，Blood85(8)2269-75，1995；Laterveer等，Blood 87(2)781-88，1996)和白介素-11(Saitoh等，Cytokine 13(5)287-94 2001)可显示出这种活性。对造血系统的刺激活性可随不同因子而不同。例如，白介素-11优选作用于巨核生成(megakaryopoiesis)。非肽因子，如PGG-葡聚糖，可通过刺激造血作用而发挥作用(Turnbull等，Acta Haematol 102(2)66-71，1999)。
可测量的因素包括细胞数。这优选在来自哺乳动物，优选人的样品中测量，样品优选为血样或来自血的样品。来自血的样品优选含有血细胞，还优选含有白细胞。计数的细胞优选为T细胞、NK细胞、粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、凝血细胞、淋巴细胞、B细胞，等等。计数的细胞优选为造血来源，更优选为来自前体和/或干细胞的细胞。
参数也可能来自标记，优选细胞表面标记的测量。这些标记包括CD3、CD4、CD8、CD20、B7、CD45、CD34、CD36、CD56、CD19、CD20-24、CD25、CD 37、CD79α和/或β、CD2、CD5、CD7、CD43、CD45(白细胞共同抗原LAK)CD45R0、CD56、流式细胞仪侧向散射、流式细胞仪前向散射、与所有淋巴样细胞反应的S-100标记、CD30、CD45RA、CD74、CDw75、CDw76、CD79、κ轻链、λ轻链。其他的标记为与细胞增殖相关的标记，例如Ki-67标记。其他标记与细胞死亡，优选与凋亡或坏死相关。用于检测凋亡的许多标记或方法是本领域技术人员公知的。例如，annexin V、DNA梯形带、核凝聚、核碎裂、单链DNA标记、细胞色素c释放和通过caspase的底物(例如PARP)的切割是与凋亡相关的标记。优选地，可以使用annexin V-标记或caspase3/7活性试验。
上面参数的确定和/或测量是本领域技术人员熟知的。例如，上面提到的表面和细胞内部蛋白标记的测定法可通过商业途径从Dako Cytomation丹麦A/S，Produktionsvej 42，2600 Glostrup，丹麦，或其子公司得到。
因此，通过进行如上面的实施例1中所描述的细胞能力检验，上面标记的任何一种参数都可相关，并将如上述的标记用作额外参数。然后所述额外参数以与白细胞数类似的方式与造血恢复相关，白细胞数与造血恢复的相关性在上面的实施例1中描述。优选比白细胞数与造血恢复具更好的相关性，和/或比白细胞数与如在此处的实施例中描述的治疗-和结果-相关的因子的相关性更好。
实施例8患有多发性骨髓瘤或复发的淋巴瘤的患者组中的细胞能力检验患者和方法患者研究在86个多发性骨髓瘤(MM)患者或复发的淋巴瘤(LYM)患者中进行。49名患者(57％)为男性，37名患者(43％)为女性。中位值年龄为53岁(从18-68岁)。高剂量治疗前，患者已经受到中位值为6轮的化学治疗(范围为0-25轮)。对29名患者(34％)给予放疗。患者对他们的治疗给予知情同意。这一群患者部分与实施例1-6中的患者部分重叠。
血干细胞动员、收获、处理和冷冻保存在大多数患者中，使用G-CSF的IEV方案用于干细胞动员。IEV方案由1-3天静脉内2500mg/m2异环磷酰胺、1天静脉内100mg/m2表阿霉素、1-3天静脉内150mg/m2依托泊苷之后从第5天起每天皮下5μg/kgG-CSF(非格司亭；Amgen，Thousand Oaks，CA，USA)直到血干细胞收获完成组成。除了个体剂量减少，年龄≥60岁的MM患者从2000年开始接受75％剂量的IEV。当最低点后，G-CSF刺激的白细胞数上升到5000-10000/μL或以上，使用COBE Spectra(COBE，Heimstetten，德国)或AS104(Fresenius，St.Wendel，德国)细胞分离器和标准程序收获PBSCs。在一些病例中，从单个白细胞除去法收获的血干细胞在收集后立即进行免疫磁性B细胞清洗(MaxSep，Baxter Immunotherapy，Unterschleissheim，德国)。将血干细胞与等体积的用5％HSA和100％DMSO(Cryoserv，Tera Pharmaceuticals，Midvale，UT，USA)(4∶1)制备的冰冻溶液混合。最终DMSO浓度为10％。计算机控制速率的冰冻后，含有血干细胞的包被保存在液氮的蒸汽相中。
血干细胞自体移植中CD34+细胞计数根据ISHAGE(Sutherland等，1996)的方法，使用装备有氩激光的FACScan(BD，Mountain View，CA，USA)或EPICS XL-MCL(Electronics，Miami，FL，USA)进行CD34+细胞的确定。全血在4℃黑暗中与PE偶联的单克隆抗-CD34抗体和FITC偶联的单克隆抗-CD45抗体孵育30分钟，然后洗涤并进行血红细胞裂解(BD)。在1998年以前，分析了20000个细胞，之后分析了75000个细胞。为排除细胞碎片、血小板、剩余的红细胞和所有CD45阴性细胞，使用向前散射对CD45荧光点图。然后限定双阳性CD34+/CD45+细胞群体并保留(backgate)低45CD表达和低侧向散射性质。如此限定的CD34+细胞的百分数与脱落(apheresis)产物的总的有核细胞含量相乘得到收获的CD34+细胞的绝对数目。使用Coulter STKS(Coulter，Miami，FL，USA)通过自动化细胞计数确定有核细胞含量。所用的抗-CD34抗体(HPCA-2)、抗-CD45抗体(2D1)和同种型对照来自BD。
高剂量治疗和血干细胞移植研究了86名患者中128个高剂量化学治疗过程。在88个过程(69％)中应用美法仑200mg/m2(MEL200)(Barlogie等1997)，18个过程(14％)中应用美法仑100mg/m2(MEL100)(Palumbo等1999)，22个过程(17％)中使用BUCY(Schiller等1994；Weaver等1999)。最后一剂化学治疗后48小时进行自体血干细胞移植。
G-CSF的应用和血细胞计数高剂量化学治疗后皮下施用的重组人G-CSF在121例中为非格司亭(Amgen，Thousand Oaks，CA，USA)，在7例中为雷诺司替(Chugai，日本)。在自体血干细胞移植前的晚上——最后的化学治疗输注后约30小时——以5μg/kg的剂量给予评估的单剂G-CSF注射。在第二天早上，单剂G-CSF后12-14小时用常规血试验检测诱导的WBC峰。常规血试验后约2小时进行自体血干细胞的移植。从移植后的当天开始，每天以5μg/kg的剂量给予G-CSF直到最低点后白细胞数在5000/μL到10000/μL之间。包括差别的常规血细胞计数每天在Coulter STKS(Coulter，Miami，FL，USA)上进行，从高剂量治疗开始直到患者离开医院。
支持治疗在高剂量治疗、自体移植和移植后期间所有患者都住院并接受相同的支持治疗。抗微生物预防由下面的方案组成从自体移植到嗜中性粒细胞恢复每天给予卷须霉素2×250mg。在整个医院停留期间给予口服两性霉素B悬浮剂4×1mL，或者备选地，对于口服两性霉素不耐性，每天给予氟康唑1×100mg。在用一天两次的甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲基异噁唑160mg/800mg的高剂量化学治疗期间开始卡氏肺囊虫局限性肺炎的预防，在移植前中止并且以每周连续2天，一天2次继续治疗6个月直到嗜中性粒细胞恢复。对于甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲基异噁唑不耐受时，备选地从自体移植开始每4周进行300mg喷他脒吸入治疗6个月。从高剂量治疗开始以2×500mg剂量给予静脉内无环鸟苷直到嗜中性粒细胞恢复。血红细胞产物和单供体血小板被代替以保持血红蛋白水平高于80g/L和血小板数高于10000/μL。所有血细胞产物都是CMV阴性的，用30Gy辐射并通过白细胞减少过滤器注入。在中性白细胞减少期间单次口服治疗中温度＞38.5℃或者当发热＞38.0℃存在至少一小时后开始经验性的静脉内抗微生物治疗，并且该治疗根据以前出版的方针(Hughes等1997)进行。最初的治疗用氧哌嗪青霉素/唑巴克坦加庆大霉素进行。用美罗培南/万古霉素进行逐步增加。如果在第5-7天发热持续，那么加入静脉内两性霉素B。继续抗微生物治疗直到嗜中性粒细胞恢复和发热消退后至少24小时。嗜中性粒细胞和血小板恢复后和抗微生物治疗停止后病人出院。
造血恢复和感染的评估嗜中性粒细胞恢复被定义为从自体移植那天开始嗜中性粒细胞数高于500/μL为第一天。血小板恢复被定义为从自体移植当天开始未被代替的血小板数高于20000/μL的第一天。观察期间为从高剂量治疗直到患者出院。感染的评估根据以前出版的标准(Link等，1994)进行。
目的和统计分析本研究的目的是将作为G-CSF反应的指示剂的白细胞峰和嗜中性粒细胞和血小板恢复和感染率和感染类型向关联并将这些相关性和为自体血干细胞移植中CD34+细胞数所得值的相关性相比较。给出的所有分析(除了人口统计学和疾病基线特征之外)都基于作为观察单位的移植过程。
使用根据Kaplan和Meier(Kaplan和Meier，1958)的产物-极限方法评估随时间嗜中性粒细胞和血小板的恢复速率，并且使用log-rank检验(Peto和Peto 1972)比较预后小组。根据组数，通过Wilcoxon-Mann-Whitney或Kruskal-Wallis分析检验预后组之间的连续变量中的差异。对于命名类别或规则类别，应用对趋势的Fisher’s精确检验或卡方检验。为了检查预测因子对不同末点的独立影响，根据结果变量的性质，用各自检验的多层次、Cox模型(Cox 1972)或逻辑回归模型进行多元分析。所有报道的p-值来自双侧检验。
宿主G-CSF反应在患有多发性骨髓瘤或淋巴瘤的86名患者中的128个高剂量化学治疗过程后较早地施用皮下单一G-CSF注射(5μg/kg)。在该时间点，中位值WBC为4100/μL(范围1800-10700/μL)，中位值血小板数为197000/μL(范围24000-640000/μL)。12-14小时后测量G-CSF诱导的WBC峰。这些短暂的WBC峰具有不同幅度(图4)并且由约90％嗜中性粒细胞组成。中位值WBC峰为17400/μL(范围3300-60600/μL)。WBC峰的分布在图5A中显示。在这些WBC峰中没有检测到集落形成细胞或CD34+细胞。WBC峰后，在所有病例中WBC数减少并出现严重嗜中性粒细胞减少(＜200/μL)。
造血恢复的预测在测量G-CSF反应(中位值3.92×106CD34+细胞/kg(范围0.9-21.2))后进行自体血干细胞移植。嗜中性粒细胞移植(＞500/μL)的时间中位值为9天(范围8-12)，血小板移植(＞20000/μL)的时间中位值是10天(范围8-25)。G-CSF反应预测了嗜中性粒细胞(p＜0.0001)和血小板移植(p＜0.0001)(表4)。移植的CD34+细胞数也预测了嗜中性粒细胞移植(p＜0.0001)和血小板移植(p＜0.0001)，如所预期的那样。其他患者或治疗特征和G-CSF前的WBC数不与造血恢复相关(表4)。G-CSF反应和CD34+细胞数的相关性是弱的(r＝0.21；p＝0.02)。在Cox模型中的多元分析中，通过G-CSF反应的造血恢复的预测独立于移植的CD34+细胞的影响(表5)。
感染的预测发热＞38℃在128例中存在69例(54％)。在29例(23％)中记载有感染。G-CSF反应高度显著地预测了记载的感染率(p＜0.0001)。嗜中性粒细胞减少＜1000/μL持续了5天的中位值(范围3-11)。如可以预料的那样，嗜中性粒细胞减少也和记载的感染率相关(p＝0.003)。在如逻辑回归进行的多元分析中，G-CSF独立于感染预测中嗜中性粒细胞减少的持续时间并且作为主要的预后因子出现(p＜0.0001)(表5)。在记载的感染率和移植的CD34+细胞数或其他患者或治疗特征之间没有相关性(表4)。许多因素与发热的发生相关，但是这些因素没有一个在多元分析中保持独立的显著性。
大多数记载的感染(86％)在低G-CSF反应中发生(图5和表6)。从血流中分离的细菌分离物主要是凝固酶阴性葡萄球菌。多数肺炎(83％)和所有侵入性真菌感染和治疗相关的死亡与低G-CSF反应相关。
在39名患者(其中分析了第一和第二次高剂量化学治疗过程)中，G-CSF反应从第一次后WBC的中位值21700/μL(范围6400-59300/μL)降到第二次高剂量化学治疗后WBC的中位值15600/μL(范围3300-24800/μL)。同时，记载的感染的比例增加了38％。
移植感染ANC PLT记载的感染＞500/μL＞20.000/μL年龄 0.19 0.400.53(≤53vs.＞53岁)性别 0.96 0.530.68(男性vs.女性)诊断 0.96 0.830.76(MM vs.LYM)以前的化学治疗 0.14 0.810.40(≤6vs.＞6个周期)以前的放疗 0.52 1.000.65(是vs.否)移植的CD34+细胞＜0.0001 ＜0.00010.79(＜2.5vs.2.5-5.0vs.＞5.0)G-CSF反应 ＜0.0001 ＜0.0001＜0.0001(1.vs.2.vs.3./4.四分位)
G-CSF前的WBC计数 0.060.540.20(＜4000/μL vs.≥4000/μL)白细胞＜1000/μL的天- - 0.003数(≤5天vs.＞5天)p-值表4因素与干细胞移植和感染的危险相关的单变量分析。ANC＝绝对嗜中性粒细胞计数；PLT＝血小板计数；MM＝多发性骨髓瘤；LYM＝淋巴瘤。
移植ANC＞500/μlPLT＞20.000/μl移植的CD34+细胞＜0.0001＜0.0001G-CSF反应0.020.0006p-值记载的感染G-CSF反应＜0.0001白细胞＜1.000/μL的天＞0.2数p-值表5干细胞移植和记载的感染的相关因素的多变量分析。
G-CSF反应 四分位1 四分位2 四分位3 分位4N 3232 3232％％ ％％血流感染 2212 3 0·Coag.-neg.Staphyl. 199 3·链球菌 3·丙酸菌3肺炎 256 6 0侵入性真菌感染6 0 0 0严重小肠结肠炎3 6 0 0其他感染 126 6 0·窦炎 3 3·胆囊炎 3·软组织感染 6·脊髓炎 3·导管进入出感染3·Port-脓毒症 3总发生率 治疗相关的死亡率 6 0 0 0表6G-CSF反应和记载的感染类型的相关性。
在该研究中，我们发现宿主对骨髓抑制前的单剂量药物G-CSF的反应可以是过程中关键造血功能的预测者并且可用于克服骨髓抑制。这突出了G-CSF的潜力并表明G-CSF可被用于诊断性方法中。评估和预测宿主防御机制抗感染和在骨髓抑制显现前弥补血细胞减少的能力到目前还是不可能的。G-CSF反应通过靶向骨髓微环境而引起了白细胞动员并且直接代表效应细胞应答。这和测量细胞因子水平有概念上的不同。我们的研究表明宿主防御的微环境能力，其可被靶定并通过体内药理学G-CSF检验。
移植的CD34+细胞数是高剂量化学治疗后干细胞移植的主要相关因子(Bensinger等1995；Tricot等1995；Weaver等1995；Ketterer等1988)。这在我们的研究中被证实。然而，G-CSF反应预测了独立于所移植CD34+细胞数的干细胞移植。因此G-CSF反应代表造血恢复的重要独立的因素，造血恢复在自体干细胞移植后的功能性造血微环境重新形成中得到维持。
白细胞减少的持续时间是骨髓抑制的宿主中感染危险的主要公知的因素(Bodey等1966)。这可以在我们的研究中扼要重述。然而，G-CSF反应独立于感染预测中的白细胞减少的持续时间并作为主要的预后因子出现(p＜0.0001)。G-CSF是对嗜中性粒细胞减少和感染的宿主应答中的中心调节子(Watari等1989；Kawakami等1990)。被药学G-CSF激起的宿主白细胞应答可能是骨髓抑制中该G-CSF-可诱导的“紧急反应”潜能的早熟反映。对于移植的CD34+细胞数，没有发现与记载的感染率的相关性(p＝0.79)。只要常规嗜中性粒细胞移植发生，似乎CD34+细胞数对感染率就不再有影响。小鼠中的实验揭示了G-CSF对微环境功能性的影响。在组成性高水平表达人G-CSF的转基因小鼠中，骨髓中的巨核细胞生成(megakaryocytopoeisis)得以提高，尽管G-CSF在巨核细胞生成中还没有被赋予特定角色(Fujita等2001)。在移植实验中，表明这种巨核细胞生成的提高取决于转基因人G-CSF诱导的微环境改变。该质变的微环境允许造血移植后更快的血小板恢复。这符合我们的发现G-CSF反应是血小板恢复的独立预测子。在不表达G-CSF的G-CSF敲除小鼠中，发现了慢性嗜中性粒细胞减少、祖细胞减少、单药学剂量G-CSF导致的快速白细胞动员的减慢和对实验性感染的更高易感性(Lieschke等1994)。这些发现部分相对于我们在具有低G-CSF反应的病人中所观察到的。可以推测G-CSF对微环境的发育影响在G-CSF反应中反映。
高剂量化学治疗的设置因为高度骨髓抑制、相关的更高次数的感染事件和对医院中患者的密切监控而很可能有利于对G-CSF反应的预测潜力的鉴定。与化学治疗后骨髓抑制期间嗜中性粒细胞最低点的被动观察以对治疗的进一步过程中的嗜中性粒细胞减少症作出结论(Silber等1998)相反，G-CSF反应可在正常WBC数时评估并明显依赖于骨髓中可动员白细胞的存在。我们的研究中部分非常高的白细胞峰和它们的高度变化性暗示动员效果的最大值，其允许识别患者间的差异。稍前给予的高剂量化学治疗可能发挥对用G-CSF的动员的引发作用，因为在G-CSF剂量为5μg/kg时通常观察不到前面所观察到的强动员效果。药学G-CSF效果是剂量-依赖的。仅仅在G-CSF剂量为10μg/kg或以上时才观察到稳定状态造血作用期间或常规化学治疗后的强动员效果(Morstyn等1988；Morstyn等1989)。
世界上约三分之一自体血干细胞移植在多发性骨髓瘤中进行。在移植前大多数这些患者接受美法仑或白消安/环磷酰胺高剂量化学治疗，如在我们的研究中所应用的。在这些患者中，G-CSF反应可以提供基础以在受控的临床试验中施用危险-分层次的支持治疗(Meisenberg等1997；Herrmann等1999；Kern等1999；Freifeld等1999)。而且，G-CSF反应可以在其他领域像对实体瘤不进行干细胞移植的化学治疗中起作用。研究是否对药学G-CSF的实际需要可以在G-CSF反应的基础上确定是令人感兴趣的。G-CSF反应也可以对开发抗感染的新型预防策略作出贡献(Noursadeghi等2002)。
实施例9细胞能力检验预测白细胞缺少和嗜中性粒细胞缺少的持续时间下面的分析在实施例8的病例上进行。细胞能力检验(WBC峰)预测白细胞减少和嗜中性粒细胞减少的持续时间(表7)。
WBC峰 CD34+细胞×106/kg四分位 1 234＜2.52.5-5.0＞5.0白细胞减少p＜0.00 1 p＜0.001＜1.000/μL(天数)最小值 4 433 54 325.百分位数6 555 65 450.百分位数6 655 66 575.百分位数7 665 76 5最大值 11978 11 8 8嗜中性粒细胞 减 少 p＜0.001 p＜0.001＜500/μL(天数)最小值 4 433 43 325.百分位数5 544 65 450.百分位数6 555 65 575.百分位数7 665 76 5最大值 9 977 98 7表7白细胞减少和嗜中性粒细胞减少的持续时间与细胞能力检验(WBC峰)和移植的CD34+细胞数的相关性。
实施例10作为细胞能力检验结果的白细胞或白血细胞(WBC)峰与各自的嗜中性粒细胞峰非常相似。
下面的数据(表8)基于实施例8的病例。
WBC峰(/μL)嗜中性粒细胞峰(/μL)最小值 3.3003.10025.百分位数 12.800 12.10050.百分位数 17.400 16.70075.百分位数 23.300 22.400最大值60.600 56.300r＝0.998表8诱导的WBC和嗜中性粒细胞峰的相关性。
实施例11不进行造血干细胞移植的骨髓抑制化学治疗后细胞能力检验患有淋巴瘤或多发性骨髓瘤的48名患者受到IEV化学治疗，之后是用于肿瘤减少的G-CSF和如在实施例8中指述的干细胞动员。第一次G-CSF注射在方案的第五天给予并且将第6天诱导的白细胞峰用作细胞能力检验。白细胞数从中位值5.000/μL(范围1.500-8.200/μL)升高到中位值10.100/μl(范围300-46.700/μL)。白细胞峰的分级排列预示了接下来的骨髓抑制期发热和感染的危险性(p＜0.05)(表9)。没有进行造血移植。
白细胞峰(＝细胞检验)N 发热和感染＜＝中位值237(30％)p＜0.05＞中位值 231(4％)表9使用IEV方案的骨髓抑制化学治疗后细胞能力检验与发热和感染之间的相关性。
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Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser85 90 95Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp100 105 110Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro115 120 125Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe130 135 140Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe145 150 155 160Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro165 170
权利要求
1.确定受试者造血的细胞能力的方法，该方法包括以下步骤(a)确定从受试者得到的血样中存在的白细胞量，其中所述受试者已经被施与单剂量G-CSF并且已经维持了一定时间，该时间足够允许白细胞从造血和贮藏组织以及边集部位动员或释放到血液；和(b)通过用对照受试者动员或释放的白细胞量评估在步骤(a)中确定的白细胞量来确定造血的细胞能力，其中所述对照受试者选自具有(i)与高剂量细胞毒性化学治疗和/或造血细胞移植相关的疾病、失调或并发症的高危性，(ii)与高剂量细胞毒性化学治疗和/或造血细胞移植相关的疾病、失调或并发症的中危性或(iii)与高剂量细胞毒性化学治疗和/或造血细胞移植相关的疾病、失调或并发症的低危性的受试者。
2.为受试者选择适宜的抗微生物预防或治疗的方法，其中所述方法包括权利要求1的方法的步骤和另一步骤(c)基于步骤(b)中得到的结果为所述受试者选择适宜的抗微生物预防或治疗。
3.根据权利要求2的方法，其中所述预防或治疗是用于治疗、防止或改善感染的预防或治疗。
4.根据权利要求3的方法，其中所述感染选自真菌、病毒、原生动物、寄生虫和细菌感染。
5.根据权利要求3的方法，其中所述感染选自肺炎、侵入性真菌感染、小肠结肠炎、软组织感染和脓毒症。
6.为受试者发生的嗜中性粒细胞减少性发热选择适宜的预防或治疗的方法，其中所述方法包括权利要求1的方法的步骤和另一步骤(c)基于步骤(b)中得到的结果为所述受试者选择对嗜中性粒细胞减少性发热适宜的预防或治疗。
7.选择适宜量的用于治疗受试者而欲输入的造血干细胞优选CD34+细胞的方法，其中所述方法包括权利要求1的方法的步骤和另一步骤(c)基于步骤(b)中得到的结果选择将为所述受试者的治疗而欲输入的所述细胞的适宜量。
8.选择用于治疗受试者的造血生长因子或细胞因子的适宜量的方法，其中所述方法包括权利要求1的方法中的步骤和另一步骤(c)基于步骤(b)中得到的结果为所述受试者的治疗选择适宜量的造血生长因子或细胞因子。
9.从受试者得到的白细胞用于制备诊断组合物的用途，其中所述诊断组合物用于诊断所述受试者中的与高剂量细胞毒性化学治疗和/或造血细胞移植相关的疾病、失调或并发症的易感性，其中所述受试者已经被施与单剂量G-CSF并且维持了一定时间，该时间足以允许白细胞从造血和贮藏组织以及边集部位动员或释放到血液中。
10.权利要求1的方法或权利要求9的用途，其中所述与高剂量细胞毒性化学治疗和/或造血细胞移植相关的疾病、失调或并发症为嗜中性粒细胞减少性发热、微生物感染、延迟的造血细胞恢复、出血、免疫抑制、针对宿主的免疫学效应、支持治疗的高水平、发病和死亡。
11.权利要求1到8中任一项的方法或权利要求9或10的用途，其中所述受试者为人。
12.权利要求1到8中任一项的方法、权利要求9或10的用途或权利要求11的方法或用途，其中所述受试者已接受高剂量化学治疗。
13.权利要求12的方法或用途，其中所示高剂量化学治疗包括施用美法仑、白消安、环磷酰胺、卡氯芥、依托泊苷或阿糖胞苷。
14.权利要求1到8中任一项的方法、权利要求9或10的用途或权利要求11的方法或用途，其中所述受试者已接受骨髓抑制性化学治疗。
15.权利要求14的方法或用途，其中所述骨髓抑制性化学治疗包括施用环磷酰胺、依托泊苷、卡氯芥、阿糖胞苷、美法仑、白消安、阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多西他塞、噻替呱、氟达拉滨、长春新碱、宾达氮芥、顺铂、碳铂、柔红霉素、氟尿嘧啶、吉西他滨、去甲柔毛霉素、异环磷酰胺、伊立替康、氨甲蝶呤、米托蒽醌、草酸铂、苏消安、长春碱或长春烯碱。
16.权利要求1到8中任一项的方法、权利要求9或10的用途或权利要求11的方法或用途，其中所述受试者已经接受放射治疗、患有原发性或继发性骨髓疾病、自身免疫疾病、遗传疾病或失调或感染。
17.权利要求1到8中任一项的方法、权利要求9或10的用途或权利要求11到16中任一项的方法或用途，其中所述G-CSF为非格司亭(NeupogenTM；Amgen Inc.，Thousand Oaks，CA，USA)或雷诺司替(GranocyteTM；Chugai，日本)。
18.权利要求1到8中任一项的方法、权利要求9或10的用途或权利要求11到17中任一项的方法或用途，其中所述G-CSF的剂量选自1到20μg/kg所述受试者的体重。
19.权利要求1到8中任一项的方法、权利要求9或10的用途或权利要求11到17中任一项的方法或用途，其中所述G-CSF的剂量为1.0、2.5、5、7.5或10μg/kg所述受试者的体重。
20.权利要求1到8中任一项的方法、权利要求9或10的用途或权利要求11到19中任一项的方法或用途，其中所述足以允许白细胞动员或释放的时间为1到120小时。
21.权利要求1到8中任一项的方法、权利要求9或10的用途或权利要求11到19中任一项的方法或用途，其中所述足以允许白细胞动员或释放的时间为至少1小时、至少2小时、至少6小时、至少10小时、至少12小时、至少14小时或至少18小时。
全文摘要
本发明涉及确定受试者造血的细胞能力的方法，该方法包括以下步骤(a)确定从受试者得到的血样中存在的白细胞量，其中所述受试者已经被施与单剂量G－CSF；和(b)通过用对照受试者动员或释放的白细胞量评估在步骤(a)中确定的白细胞量来确定造血的细胞能力。
文档编号G01N33/569GK1643382SQ03806723
公开日2005年7月20日 申请日期2003年3月24日 优先权日2002年3月22日
发明者克里斯蒂安·施特拉卡 申请人:克里斯蒂安·施特拉卡