专利名称：：一种检测细胞损伤修复能力的方法及其专用芯片的制作方法
技术领域：
：本发明涉及细胞损伤修复测定技术，特别提供了一种检测细胞损伤修复能力的方法及其专用芯片。
背景技术：
：生物体生存的环境是一个不断变化的、存在细菌、病毒、过敏原等多种致病因素的环境。连续的细胞层在病理因素的持续作用下易于受损，细胞脱落形成缺损，而受损后的组织重建和功能重建过程则依赖于细胞的损伤修复能力。损伤修复的过程首先是伤口周围细胞向伤口部位发生极化，并伸出突触，然后细胞开始迁移增殖并逐步愈合伤口。上述过程无论在整个组织还是在单个细胞水平上都是类似的。损伤修复实验已经被作为研究细胞极化、组织基质重排、预测细胞在不同细胞和不同培养环境下细胞的增殖及迁移能力的重要手段。临床上，细胞损伤修复能力的下降是胃、十二指肠溃疡、气道高反应性、血栓形成等众多病理过程发生发展的重要因素，而提高细胞损伤修复的能力也是许多细胞因子、神经递质以及药物发挥作用的重要途径。对于细胞损伤修复能力的考察也是细胞学研究常用实验之一。传统的损伤修复分析按照造成缺损的方法分为机械损伤和化学损伤两种，实际应用中以划痕法为主，即在体外培养的单层细胞上采用机械刮擦的方法形成物理刮痕，然后使用显微镜观察相应时间段内划痕的愈合情况，具体的愈合时间随不同的细胞类型、培养条件以及伤口的区域大小而变化。划痕法依赖于手工操作，其伤口区域的大小及宽度变化较大，初始损伤面积不易控制，拍照时缺损难以准确定位，而且划痕可能会对周围的细胞造成损伤从而影响其迁移的效率，因此这种"划痕"伤口愈合试验结果由于细胞间相互的多因素作用而不够理想，往往导致实验重复性不佳，更为重要的是，在实际应用中，这种定性的观察(而非定量测量)难以被应用到高通量的研究中。因此，开发操作简便、缺损一致、拍照方便、通量高的损伤修复定量检测方法，已成为实验室技术发展的必然。微流控芯片实验室又称芯片实验室(Lab-on-a-Chip)或微流控芯片(Microfluidic)，指的是把化学和生物等领域中所涉及的样品制备、反应、分离、检测、细胞培养、分选、裂解等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统，用以取代常规化学或生物实验室的各种功能的一种技术。由于微流控芯片的多维网络特征和功能集成特征，已经有可能使常规的细胞培养、细胞受激、细胞标记和检测等过程集成在一块很小的芯片上完成。因此，微流控芯片技术与细胞损伤修复检测方法发展的需求相吻合，有望成为损伤修复新检测方法的突破口。
发明内容本发明的目的是提供了一种检测细胞损伤修复能力的方法及其专用芯片。本发明提供了一种集成化微流控芯片，该芯片由299个相同的细胞培养结构单元构成，这些结构单元之间通过一个公共细胞进样池相连接；每个结构单元含有299个柱形结构、2~99个挡板结构和一个废液池。本发明提供的集成化微流控芯片，所述的柱形结构大小和形状均相同，柱形结构之间间隔相同的距离，沿细胞进样通路两侧均匀分布；柱形结构的作用是形成相同的细胞缺损区，缺损区大小在显微镜拍照视野内。本发明提供的集成化微流控芯片，所述的挡板结构由299个板状结构组成，主要起分流作用，使细胞在灌注时均匀分布于柱形结构周围。本发明还提供了一种利用集成化微流控芯片进行检测细胞损伤修复能力的方法，方法过程为将细胞悬液加入位于芯片中央的公共细胞进样池中，静置5-30分钟，芯片置于显微镜下观察，当芯片中细胞不再流动停驻于细胞培养室中时，加入细胞培养基，使其液面略高于芯片高度；将接种了细胞的微流控芯片放入细胞培养箱中培养，然后将芯片置于显微镜下观察细胞的贴壁及生长情况；待细胞贴壁且细胞密度大于80%后，轻轻将微流控芯片揭去，分别加入含不同药物的细胞培养基，立即在显微镜下寻找损伤区域并拍照；拍照后继续放置于培养箱中培养，其后每隔412小时对缺损区拍照一次，连续动态观察24~72小时；收集所有时间点的缺损区域图像，采用图像分析软件勾画缺损边缘并测算缺损面积，以Oh缺损面积为百分之百，计算各时间点缺损面积占Oh缺损面积的百分比，以反映缺损愈合情况；绘制时间与缺损面积的直线回归图，作出直线回归方程，Y=a+bX，损伤修复指数(Woundrepairindex,RI)等于回归方程中b的绝对值，即RI=|b|，以此反映不同处理组中细胞愈合速度的快慢。本发明具有如下优点1.本发明所述微流控芯片将细胞培养、缺损区域形成、损伤修复过程启动等功能单元集成于一块芯片上，待细胞贴壁且密度较高时，只需将芯片揭去既可自动形成缺损区并启动损伤修复过程。2.本发明只需向细胞进样池滴加高浓度的细胞悬液，无需额外人为操作，通过柱形结构对细胞的阻挡作用即可形成形状、大小均相同的细胞缺损区域。与传统划痕法相比，可避免由于缺损的大小和形状不同产生的实验误差。3.本发明一次滴加细胞既可形成12个细胞缺损区，通量高且细胞用量少，每三个缺损在一个显微镜视野内(x40)，拍照易于定位，使用方便快捷。4.本发明采用的芯片材料底面粘性大，易于与培养皿可逆封接，溶液无渗漏，具有生物相容性，无荧光吸附，且价格低廉，适合大规模生产。图l集成化微流控芯片示意图，其中l为细胞进样池，2为废液池；图2集成化微流控芯片示意图中一个结构单元的放大图，其中1为细胞进样通路，2为挡板结构，3为柱形结构，4通往废液池；图3集成化微流控芯片细胞灌注过程示意图，其中A为细胞灌注前，B为灌注细胞，C为细胞贴壁生长至密度大于80%，D为揭去芯片后，形成三个完全相同的细胞缺损；图4人胃粘膜上皮细胞(GES-1)损伤修复过程图(X40);图5人胃粘膜上皮细胞(GES-1)在重组人表皮生长因子(EGF90ng/ml)作用下的损伤修复过程图(X40);图6人胃粘膜上皮细胞(GES-1)在重组人表皮生长因子(EGF90ng/ml)作用下的损伤修复能力统计分析图。具体实施例方式以下实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。实施例l将图1所示的芯片(共有4个结构单元，每个结构单元有3个柱形结构，因此可以同时生成12个大小、形状均相同的细胞缺损区)接种高浓度(约107/ml)人胃粘膜上皮细胞(GES-1)后置于37。C、5%C02培养箱中过夜，待细胞贴壁且密度大于80%后，轻轻将微流控芯片揭去，对照组加入含12%新生牛血清的高糖DMEM培养基，EGF组加入含90ng/mlEGF及12n/。新生牛血清的高糖DMEM培养基，立即在显微镜下寻找损伤区域并拍照。拍照后继续放置于培养箱中培养，其后每隔8小时拍照一次，连续动态观察24小时。可见EGF(90ng/ml)可显著促进GES-1的损伤修复速度(见图4，图5)。收集所有时间点的缺损区域图像，采用图像分析软件勾画缺损边缘并测算缺损面积，以Oh缺损面积为百分之百，计算各时间点缺损面积占Oh缺损面积的百分比，以反映缺损愈合情况。绘制时间与缺损面积的直线回归图，作出直线回归方程Y-a+bX(见表l)，损伤修复指数(Woundrepairindex,RI)等于回归方程中b的绝对值，即RI叫bl，以此反映不同处理组中细胞愈合速度的快慢。可见EGF(90ng/ml)可显著提高GES-1的损伤修复指数(见图6，表l)。表l对照组和EGF组的回归方程<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例2将图1所示的芯片接种高浓度(约107/ml)体外培养的人晶状体上皮细胞后置于37。C、5。/。C02培养箱中过夜，待细胞贴壁且密度大于80%后，轻轻将微流控芯片揭去，分别加入含不同浓度碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor,b-FGF)的细胞培养基，立即在显微镜下寻找损伤区域并拍照。拍照后继续放置于培养箱中培养，其后每隔8小时拍照一次，连续动态观察24小时。可见5^g/L的bFGF可显著促迸人晶状体上皮细胞的损伤修复速度，随着b-FGF浓度的增加，促进作用逐渐增强。权利要求1、一种集成化微流控芯片，其特征在于该芯片由2～99个相同的细胞培养结构单元构成，这些结构单元之间通过一个公共细胞进样池相连接；每个结构单元含有2～99个柱形结构、2～99个挡板结构和一个废液池。2、按照权利要求1所述集成化微流控芯片，其特征在于所述的柱形结构大小和形状均相同，柱形结构之间间隔相同的距离，沿细胞进样通路两侧均匀分布。3、按照权利要求1所述集成化微流控芯片，其特征在于所述的挡板结构由2~99个板状结构组成。4、一种利用权利要求1所述芯片进行检测细胞损伤修复能力的方法，其特征在于方法过程为将细胞悬液加入位于芯片中央的公共细胞进样池中，静置5-30分钟，芯片置于显微镜下观察，当芯片中细胞不再流动停驻于细胞培养室中时，加入细胞培养基，使其液面略高于芯片高度；将接种了细胞的微流控芯片放入细胞培养箱中培养，然后将芯片置于显微镜下观察细胞的贴壁及生长情况；待细胞贴壁且细胞密度大于80%后，轻轻将微流控芯片揭去，分别加入含不同药物的细胞培养基，立即在显微镜下寻找损伤区域并拍照；拍照后继续放置于培养箱中培养，其后每隔412小时对缺损区拍照一次，连续动态观察24~72小时；收集所有时间点的缺损区域图像，采用图像分析软件勾画缺损边缘并测算缺损面积，以0h缺损面积为百分之百，计算各时间点缺损面积占Oh缺损面积的百分比，以反映缺损愈合情况；绘制时间与缺损面积的直线回归图，作出直线回归方程，Y=a+bX，损伤修复指数RI等于回归方程中b的绝对值，即RI叫b卜以此反映不同处理组中细胞愈合速度的快慢。全文摘要一种检测细胞损伤修复能力的方法及其专用芯片，该芯片由2～99个相同的细胞培养结构单元构成，这些结构单元之间通过一个公共细胞进样池相连接；每个结构单元含有柱形结构、挡板结构和废液池。本发明创造性地将细胞培养、缺损区域形成、损伤修复过程启动等功能单元集成于一块芯片上，采用柱形结构对细胞的阻挡作用以形成形状、大小均相同的细胞缺损区域。与传统的划痕法相比，简化了人为操作，能提供完全相同的初始缺损区域，减少了细胞用量，通量高，且损伤修复过程易于定位拍照。文档编号C12Q1/02GK101586075SQ20091001240公开日2009年11月25日申请日期2009年7月8日优先权日2009年7月8日发明者敏张,李艳峰,林炳承,秦建华申请人:中国科学院大连化学物理研究所