专利名称：利用aflp指纹技术鉴定家蚕和桑树品种的方法
技术领域：
本发明涉及利用AFLP指纹技术鉴定家蚕和桑树品种的方法。
背景技术：
蚕业生产上，常常要进行家蚕和桑树品种的鉴别。传统的家蚕和桑树品种鉴定是以形态学标记为依据的。但该鉴定方法存在着以下主要几方面的缺点(一)大多数性状易受环境条件的影响，地区间、年份间也会表现出一定程度的变化，对于基因型的准确鉴定较为困难，从而影响了品种遗传性和品种间遗传变异的描述和评价的准确性；(二)形态学性状常常局限于某一生命时期，品种鉴定的时效性较差。近年来，DNA指纹技术的迅速发展为在DNA分子水平上鉴定家蚕和桑树品种提供了崭新的手段。其中AFLP(Amplified FragmentLength Polymorphism)技术为新发展起来的被认为是最有效的分子标记方法。AFLP分析的基本原理是选择性扩增基因组DNA酶切片段。由于不同基因组DNA的酶切位点存在差异，因而产生了扩增片段长度的多态性。用AFLP方法得到的指纹图谱具有稳定可靠且多态性丰富等优点，非常适合于品种鉴定等方面的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用AFLP指纹技术鉴定家蚕和桑树品种的方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案是(1)基因池DNA的来源从同一品种不同个体的家蚕或不同植株的桑树的任何组织器官提取DNA，混合成品种的基因池；(2)AFLP接头和二次扩增(预扩增、选择性扩增)的引物AFLP分析所用的EcoRI和MseI接头的核苷酸顺序如下EcoRI接头5′-CTCGTAGACTGCGTACCCTGACGCATGGTTAA-5′MseI接头5′-GACGATGAGTCCTGAGTACTCAGGACTCAT-5′EcoRI和MseI预扩增引物分别为
5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′5′-GATGAGTCCTGAGTAAC-3′EcoRI和MseI选择性扩增引物为
(3)AFLP反应条件A.模板DNA的酶切每个反应总体积为25μl，其中包括DNA 250ng，EcoRI(TaKaRa)和MseI(BioLabs)各2.5U，BSA 2.5μg，1×RL Bufter(500mmol/LNaCl，100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，pH7.9)，20～50℃保温20min～8h；B.DNA片段接头的连接酶切后，每个DNA样品中加入10μl的连接混合液EcoRI adaptor 5pmol，MseI adaptor 50pmol，T4DNA Ligase(TaKaRa)1.2U，1×T4DNA Ligase Buffer(66mmol/L Tris-HCl pH7.6，6.6mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，0.1mmol/L ATP)。10～40℃连接1～6h；C.DNA片段的预扩增取2.5μl连接后的DNA样品，加入22.5μl的预扩增混合液EcoRI预扩增引物和MseI预扩增引物各35ng，dNTP Mixture各5mmol/L，Taq DNA Polymerase(TaKaRa)0.625U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)，混匀后，按如下PCR程序扩增94℃ 20～60sec，56℃ 0.5～2min，72℃ 0.5～2min，20～40个循环，预扩增产物稀释20倍，-20℃保存备用；D.选择性AFLP扩增取5μl 20倍稀释的预扩增混合液，加入20μl选择性扩增混合液EcoRI选择性扩增引物和MseI选择性扩增引物各35ng，dNTPMixture各5mmol/L，Taq DNA polymerase(TaKaRa)1U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)，混匀后，按如下PCR程序扩增94℃ 20～60sec，65℃(每循环降低0.7℃)20～60sec，72℃ 0.5～2min，10～20个循环后变为94℃ 20～60sec，56℃ 20～60sec，72℃ 0.5～2min，20～30个循环，反应结束后，向选择性扩增产物中加入等体积的上样缓冲液(98％甲酰胺，10mmol/L EDTA pH8.0，0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯腈)，95℃变性5min，置于冰上冷却，待用；E.扩增产物的聚丙烯酰胺电泳分析经预电泳(55w恒功率)20～50min后，取3μl上样混合物在6％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析(50～100w恒功率)，电泳至二甲苯腈指示带距离底部2厘米处终止电泳；F.银染成像a.电泳结束后，取下胶板，放入2ml的固定/终止液(10％醋酸)中，轻摇10～30min或直到指示剂颜色消失为止；b.用双蒸水漂洗凝胶3次，每次1～5min；c.将凝胶放入1L的染色液(1g AgNO3，1.5ml 37％甲醛)中，轻摇20～40min；d.从染色液中取出凝胶，放入双蒸水中，稍作翻动，立即取出浸入预冷的1L显色液(30g NaCO3，1.5ml 37％甲醛，200μl 10mg/ml NaS2O3)中；从凝胶放入水中到其完全浸入显色液中的时间不能超过5～15sec，否则重复(c)步骤；e.凝胶浸入显色液后，轻轻摇动，出现主带后，将凝胶转入另一显色液中继续显色，直到出现全部清晰谱带；
f.待凝胶完全显色后，将固定/终止液倒入显色液中，中止反应；g.用双蒸水漂洗凝胶2次，每次1～5min；h.取出凝胶，室温下自然晾干、拍片、保存；(4)标准DNA指纹图谱的构建以上述特定引物对家蚕和桑树不同品种进行预扩增和选择性扩增，以二次扩增结果为依据，构建家蚕和桑树品种的标准DNA指纹图谱；(5)家蚕和桑树品种的鉴定将待测家蚕和桑树样本的指纹图谱与标准图谱相比较，以鉴定待测样本的品种真实性；以上述AFLP扩增结果为依据，构建桑树不同品种的标准DNA指纹图谱。
本发明与背景技术相比，具有的有益的效果是它建立一种客观、科学、准确的家蚕和桑树品种鉴定技术体系，为保护桑树育种产权、登录新品种、鉴定和检测苗木真实性和纯度、仲裁苗木纠纷和规范苗木市场提供技术保障。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1是引物GACTGCGTACCAATTCAGG/GATGAGTCCTGAGTAACTT扩增的7个桑树品种的AFLP指纹图谱；图2是引物GACTGCGTACCAATTCAGG/GATGAGTCCTGAGTAACAA扩增的7个桑树品种的AFLP指纹图谱；图3是引物GACTGCGTACCAATTCACA/GATGAGTCCTGAGTAACTT扩增的7个桑树品种的AFLP指纹图谱；图4是引物GACTGCGTACCAATTCAAC/GATGAGTCCTGAGTAACTT扩增的7个桑树品种的AFLP指纹图谱；图5是引物GACTGCGTACCAATTCAAC/GATGAGTCCTGAGTAACAC扩增的7个桑树品种的AFLP指纹图谱；图6是引物GACTGCGTACCAATTCAGG/GATGAGTCCTGAGTAACAA扩增的6个家蚕品种(包括正反交)的AFLP指纹图谱。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1(1)基因池DNA的制备分别从桐乡青、荷叶白、湖桑197、盛东一号、农桑8号、农桑12号、农桑14号6个桑树品种的不同株的桑叶(以嫩叶为佳)提取DNA，混合成品种的基因池。桑叶DNA的提取和纯化步骤如下A.称取1g叶片组织(去除中脉)，加液氮冰冻研磨成干粉，转入离心管后，加4ml抽提缓冲液(100mmol/L Tris-HCl pH8.0，50mmol/L EDTA pH8.0，500mmol/L NaCl，10mmol/L a-巯基乙醇)，混匀；B.加450μl 10％SDS，充分混匀，65℃保温1h；C.加入445μl 5mol/L KAc，充分混匀，-20℃放置1h；D.4℃下12000r/min离心15min；E.上清液转入新离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒离心管数次，放置片刻；F.于4℃下8000r/min离心10min；G.上清液转入另一离心管中，加入2/3体积、-20℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃放置1h；H.于4℃下8000r/min离心10min，去除上清液，用70％的乙醇洗涤沉淀2次，抽干；I.加入500μl TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0)溶解沉淀；J.加无DNase的RNase至终浓度100μg/ml，于37℃保温1h；K.加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，放置几分钟后，10000r/min离心10min，吸取上清液，重复1次；L.加入1/5体积的3mol/L NaAc，混匀，加入2.5倍体积的无水乙醇，轻缓混匀，-20℃放置1h；M.4℃下10000r/min离心20～30min，去除上清液，用70％的乙醇洗涤沉淀2～3次，抽干；N.加入50μl TE或dH2O溶解DNA，备用；(2)AFLP接头和二次扩增的引物AFLP分析所用的EcoRI和MseI接头的核苷酸顺序如下EcoRI接头5′-CTCGTAGACTGCGTACCCTGACGCATGGTTAA-5′MseI接头5′-GACGATGAGTCCTGAG
TACTCAGGACTCAT-5′EcoRI和MseI预扩增引物分别为5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′5′-GATGAGTCCTGAGTAAC-3′EcoRI和MseI选择性扩增引物为5′-GACTGCGTACCAATTCAGG/GATGAGTCCTGAGTAACTT-3′(3)AFLP反应条件A.模板DNA的酶切 每个反应总体积为25μl，其中包括DNA 250ng，EcoRI(TaKaRa)和MseI(BioLabs)各2.5U，BSA 2.5μg，1×RL Bufter(500mmol/LNaCl，100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，pH7.9)。37℃保温8h；B.DNA片段接头的连接酶切后，每个DNA样品中加入10μl的连接混合液EcoRT adaptor 5pmol，MseI adaptor 50pmol，T4DNA Ligase(TaKaRa)1.2U，1×T4DNA Ligase Buffer(66mmol/L Tris-HCl pH7.6，6.6mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，0.1mmol/L ATP)。16℃连接16h；C.DNA片段的预扩增 取2.5μl连接后的DNA样品，加入22.5μl的预扩增混合液EcoRI预扩增引物和MseI预扩增引物各35ng，dNTP Mixture各5mmol/L，Taq DNA Polymerase(TaKaRa)0.625 U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HClpH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)。混匀后，按如下PCR程序扩增94℃ 30sec，56℃ 1min，72℃ 1min，30个循环。预扩增产物稀释20倍，-20℃保存备用；D.选择性AFLP扩增 取5μl 20倍稀释的预扩增混合液，加入20μl选择性扩增混合液EcoRI选择性扩增引物和MseI选择性扩增引物各35ng，dNTPMixture各5mmol/L，Taq DNA polymerase(TaKaRa)1U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)，混匀后，按如下PCR程序扩增94℃ 30sec，65℃(每循环降低0.7℃)30sec，72℃ 1min，12个循环后变为94℃ 30sec，56℃ 30sec，72℃ 1min，23个循环，反应结束后，向选择性扩增产物中加入等体积的上样缓冲液(98％甲酰胺，10mmol/L EDTA pH8.0，0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯腈)，95℃变性5min，立即置于冰上冷却，待用。
E.扩增产物的聚丙烯酰胺电泳分析经预电泳(55w恒功率)30min后，取3μl上样混合物在6％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析(70w恒功率)，电泳至二甲苯腈指示带距离底部2厘米处终止电泳；F.银染成像a.电泳结束后，取下胶板，放入2ml的固定/终止液(10％醋酸)中，轻摇20min或直到指示剂颜色消失为止；b.用双蒸水漂洗凝胶3次，每次2min；c.将凝胶放入1L的染色液(1g AgNO3，1.5ml 37％甲醛)中，轻摇30min。
d.从染色液中取出凝胶，放入双蒸水中，稍作翻动，立即取出浸入预冷的1L显色液(30g NaCO3，1.5ml 37％甲醛，200μl 10mg/ml NaS2O3)中，注意，从凝胶放入水中到其完全浸入显色液中的时间不能超过10sec，否则重复(c)步骤；e.凝胶浸入显色液后，轻轻摇动，出现主带后，将凝胶转入另一显色液中继续显色，直到出现全部清晰谱带；f.待凝胶完全显色后，将固定/终止液倒入显色液中，中止反应；g.用双蒸水漂洗凝胶2次，每次2min；h.取出凝胶，室温下自然晾干、拍片、保存；(4)标准DNA指纹图谱的构建应用引物GACTGCGTACCAATTCAGG/GATGAGTCCTGAGTAACTT构建的7个桑树品种的AFLP指纹图谱如图1所示，A～G代表桑树品种，其中A为桐乡青，B为荷叶白，C为湖桑197，D为盛东一号，E为农桑8号，F为农桑12号，G为农桑14号.右列数字为多态性扩增带的编号；(5)桑树品种的鉴定将待测桑树样本的指纹图谱与标准图谱相比较，以鉴定待测样本的品种真实性。
实施例2(1)基因池DNA的制备分别从桐乡青、荷叶白、湖桑197、盛东一号、农桑8号、农桑12号、农桑14号6个桑树品种的不同株的桑叶(以嫩叶为佳)提取DNA，混合成品种的基因池。桑叶DNA的提取和纯化步骤如下A.称取1g叶片组织(去除中脉)，加液氮冰冻研磨成干粉，转入离心管后，加4ml抽提缓冲液(100mmol/L Tris-HCl pH8.0，50mmol/L EDTA pH8.0，500mmol/L NaCl，10mmol/L a-巯基乙醇)，混匀；
B.加450μl 10％SDS，充分混匀，65℃保温1h；C.加入445μl 5mol/L KAc，充分混匀，-20℃放置1h；D.4℃下12000r/min离心15min；E.上清液转入新离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒离心管数次，放置片刻；F.于4℃下8000r/min离心10min；G.上清液转入另一离心管中，加入2/3体积、-20℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃放置1h；H.于4℃下8000r/min离心10min，去除上清液，用70％的乙醇洗涤沉淀2次，抽干；I.加入500μl TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0)溶解沉淀；J.加无DNase的RNase至终浓度100μg/ml，于37℃保温1h；K.加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，放置几分钟后，10000r/min离心10min，吸取上清液，重复1次；L.加入1/5体积的3mol/L NaAc，混匀，加入2.5倍体积的无水乙醇，轻缓混匀，-20℃放置1h；M.4℃下10000r/min离心20～30min，去除上清液，用70％的乙醇洗涤沉淀2～3次，抽干；N.加入50μl TE或dH2O溶解DNA，备用；(2)AFLP接头和二次扩增的引物AFLP分析所用的EcoRI和MseI接头的核苷酸顺序如下EcoRI接头5′-CTCGTAGACTGCGTACCCTGACGCATGGTTAA-5′MseI接头5′-GACGATGAGTCCTGAGTACTCAGGACTCAT-5′EcoRI和MseI预扩增引物分别为5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′5′-GATGAGTCCTGAGTAAC-3′EcoRI和MseI选择性扩增引物为5′-GACTGCGTACCAATTCAGG/GATGAGTCCTGAGTAACAA-3′
(3)AFLP反应条件A.模板DNA的酶切每个反应总体积为25μl，其中包括DNA 250ng，EcoRI(TaKaRa)和MseI(BioLabs)各2.5U，BSA 2.5μg，1×RL Bufter(500mmol/LNaCl，100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，pH7.9)，37℃保温8h；B.DNA片段接头的连接酶切后，每个DNA样品中加入10μl的连接混合液EcoRI adaptor 5 pmol，MseI adaptor 50pmol，T4DNA Ligase(TaKaRa)1.2U，1×T4DNA Ligase Buffer(66mmol/L Tris-HCl pH7.6，6.6mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，0.1mmol/L ATP)。16℃连接16h；C.DNA片段的预扩增 取2.5μl连接后的DNA样品，加入22.5μl的预扩增混合液EcoRI预扩增引物和MseI预扩增引物各35ng，dNTP Mixture各5mmol/L，Taq DNA Polymerase(TaKaRa)0.625 U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2，混匀后，按如下PCR程序扩增94℃ 30sec，56℃ 1min，72℃ 1min，30个循环，预扩增产物稀释20倍，-20℃保存备用；D.选择性AFLP扩增 取5μl 20倍稀释的预扩增混合液，加入20μl选择性扩增混合液EcoRI选择性扩增引物和MseI选择性扩增引物各35ng，dNTPMixture各5mmol/L，Taq DNA polymerase(TaKaRa)1U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)。混匀后，按如下PCR程序扩增94℃ 30sec，65℃(每循环降低0.7℃)30sec，72℃ 1min，12个循环后变为94℃ 30sec，56℃ 30sec，72℃ 1min，23个循环。反应结束后，向选择性扩增产物中加入等体积的上样缓冲液(98％甲酰胺，10mmol/L EDTA pH8.0，0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯腈)，95℃变性5min，立即置于冰上冷却，待用；E.扩增产物的聚丙烯酰胺电泳分析经预电泳(55w恒功率)30min后，取3μl上样混合物在6％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析(70w恒功率)，电泳至二甲苯腈指示带距离底部2厘米处终止电泳；F.银染成像a.电泳结束后，取下胶板，放入2ml的固定/终止液(10％醋酸)中，轻摇20min或直到指示剂颜色消失为止；b用双蒸水漂洗凝胶3次，每次2min；c.将凝胶放入1L的染色液(1g AgNO3，1.5ml 37％甲醛)中，轻摇30min。
d.从染色液中取出凝胶，放入双蒸水中，稍作翻动，立即取出浸入预冷的1L显色液(30g NaCO3，1.5ml 37％甲醛，200μl 10mg/ml NaS2O3)中。注意，从凝胶放入水中到其完全浸入显色液中的时间不能超过10sec，否则重复(c)步骤；e.凝胶浸入显色液后，轻轻摇动，出现主带后，将凝胶转入另一显色液中继续显色，直到出现全部清晰谱带；f.待凝胶完全显色后，将固定/终止液倒入显色液中，中止反应；g.用双蒸水漂洗凝胶2次，每次2min；h.取出凝胶，室温下自然晾干、拍片、保存；(4)标准DNA指纹图谱的构建应用引物GACTGCGTACCAATTCAGG/GATGAGTCCTGAGTAACAA构建的7个桑树品种的AFLP指纹图谱如图2所示，A～G代表桑树品种，其中A为桐乡青，B为荷叶白，C为湖桑197，D为盛东一号，E为农桑8号，F为农桑12号，G为农桑14号.右列数字为多态性扩增带的编号；(5)桑树品种的鉴定将待测桑树样本的指纹图谱与标准图谱相比较，以鉴定待测样本的品种真实性。
实施例3(1)基因池DNA的制备分别从桐乡青、荷叶白、湖桑197、盛东一号、农桑8号、农桑12号、农桑14号6个桑树品种的不同株的桑叶(以嫩叶为佳)提取DNA，混合成品种的基因池。桑叶DNA的提取和纯化步骤如下A.称取1g叶片组织(去除中脉)，加液氮冰冻研磨成干粉，转入离心管后，加4ml抽提缓冲液(100mmol/L Tris-HCl pH8.0，50mmol/L EDTA pH8.0，500mmol/L NaCl，10mmol/L a-巯基乙醇)，混匀；B.加450μl 10％SDS，充分混匀，65℃保温1h；C.加入445μl 5mol/L KAc，充分混匀，-20℃放置1h；D.4℃下12000r/min离心15min；E.上清液转入新离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒离心管数次，放置片刻；F.于4℃下8000r/min离心10min；
G.上清液转入另一离心管中，加入2/3体积、-20℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃放置1h；H.于4℃下8000r/min离心10min，去除上清液，用70％的乙醇洗涤沉淀2次，抽干；I.加入500μl TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0)溶解沉淀；J.加无DNase的RNase至终浓度100μg/ml，于37℃保温1h；K.加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，放置几分钟后，10000r/min离心10min，吸取上清液，重复1次；L.加入1/5体积的3mol/L NaAc，混匀，加入2.5倍体积的无水乙醇，轻缓混匀，-20℃放置1h；M.4℃下10000r/min离心20～30min，去除上清液，用70％的乙醇洗涤沉淀2～3次，抽干；N.加入50μl TE或dH2O溶解DNA，备用；(2)AFLP接头和二次扩增的引物AFLP分析所用的EcoRI和MseI接头的核苷酸顺序如下EcoRI接头5′-CTCGTAGACTGCGTACCCTGACGCATGGTTAA-5′MseI接头5′-GACGATGAGTCCTGAGTACTCAGGACTCAT-5′EcoRI和MseI预扩增引物分别为5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′5′-GATGAGTCCTGAGTAAC-3′EcoRI和MseI选择性扩增引物为5′-GACTGCGTACCAATTCACA/GATGAGTCCTGAGTAACTT-3′(3)AFLP反应条件A.模板DNA的酶切 每个反应总体积为25μl，其中包括DNA 250ng，EcoRI(TaKaRa)和MseI(BioLabs)各2.5U，BSA 2.5μg，1×RL Bufter(500mmol/LNaCl，100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，pH7.9)，37℃保温8h；B.DNA片段接头的连接 酶切后，每个DNA样品中加入10μl的连接混合液EcoRI adaptor 5pmol，MseI adaptor 50pmol，T4DNA Ligase(TaKaRa)1.2U，1×T4DNA Ligase Buffer(66mmol/L Tris-HCl pH7.6，6.6mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，0.1mmol/L ATP)。16℃连接16h；C.DNA片段的预扩增 取2.5μl连接后的DNA样品，加入22.5μl的预扩增混合液EcoRI预扩增引物和MseI预扩增引物各35ng，dNTP Mixture各5mmol/L，Taq DNA Polymerase(TaKaRa)0.625 U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)，混匀后，按如下PCR程序扩增94℃ 30sec，56℃ 1min，72℃、1min，30个循环。预扩增产物稀释20倍，-20℃保存备用；D.选择性AFLP扩增取5μl 20倍稀释的预扩增混合液，加入20μl选择性扩增混合液EcoRI选择性扩增引物和MseI选择性扩增引物各35ng，dNTPMixture各5mmol/L，Taq DNA polymerase(TaKaRa)1U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)。混匀后，按如下PCR程序扩增94℃ 30sec，65℃(每循环降低0.7℃)30sec，72℃ 1min，12个循环后变为94℃ 30sec，56℃ 30sec，72℃ 1min，23个循环。反应结束后，向选择性扩增产物中加入等体积的上样缓冲液(98％甲酰胺，10mmol/L EDTA pH8.0，0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯腈)，95℃变性5min，立即置于冰上冷却，待用；E.扩增产物的聚丙烯酰胺电泳分析经预电泳(55w恒功率)30min后，取3μl上样混合物在6％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析(70w恒功率)，电泳至二甲苯腈指示带距离底部2厘米处终止电泳；F.银染成像a.电泳结束后，取下胶板，放入2ml的固定/终止液(10％醋酸)中，轻摇20min或直到指示剂颜色消失为止；b.用双蒸水漂洗凝胶3次，每次2min；c.将凝胶放入1L的染色液(1g AgNO3，1.5ml 37％甲醛)中，轻摇30min。
d.从染色液中取出凝胶，放入双蒸水中，稍作翻动，立即取出浸入预冷的1L显色液(30g NaCO3，1.5ml 37％甲醛，200μl 10mg/ml NaS2O3)中，注意，从凝胶放入水中到其完全浸入显色液中的时间不能超过10sec，否则重复(c)步骤；e.凝胶浸入显色液后，轻轻摇动，出现主带后，将凝胶转入另一显色液中继续显色，直到出现全部清晰谱带；
f.待凝胶完全显色后，将固定/终止液倒入显色液中，中止反应；g.用双蒸水漂洗凝胶2次，每次2min；h.取出凝胶，室温下自然晾干、拍片、保存；(4)标准DNA指纹图谱的构建应用引物GACTGCGTACCAATTCACA/GATGAGTCCTGAGTAACTT构建的7个桑树品种的AFLP指纹图谱如图3所示，A～G代表桑树品种，其中A为桐乡青，B为荷叶白，C为湖桑197，D为盛东一号，E为农桑8号，F为农桑12号，G为农桑14号.右列数字为多态性扩增带的编号。
(5)桑树品种的鉴定将待测桑树样本的指纹图谱与标准图谱相比较，以鉴定待测样本的品种真实性。
实施例4(1)基因池DNA的制备分别从桐乡青、荷叶白、湖桑197、盛东一号、农桑8号、农桑12号、农桑14号6个桑树品种的不同株的桑叶(以嫩叶为佳)提取DNA，混合成品种的基因池。桑叶DNA的提取和纯化步骤如下A.称取1g叶片组织(去除中脉)，加液氮冰冻研磨成干粉，转入离心管后，加4ml抽提缓冲液(100mmol/L Tris-HCl pH8.0，50mmol/L EDTA pH8.0，500mmol/L NaCl，10mmol/L a-巯基乙醇)，混匀；B.加450μl 10％SDS，充分混匀，65℃保温1h；C.加入445μl 5mol/L KAc，充分混匀，-20℃放置1h；D.4℃下12000r/min离心15min；E.上清液转入新离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒离心管数次，放置片刻；F.于4℃下8000r/min离心10min；G.上清液转入另一离心管中，加入2/3体积、-20℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃放置1h；H.于4℃下8000r/min离心10min，去除上清液，用70％的乙醇洗涤沉淀2次，抽干；I.加入500μl TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0)溶解沉淀；
J.加无DNase的RNase至终浓度100μg/ml，于37℃保温1h；K.加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，放置几分钟后，10000r/min离心10min，吸取上清液，重复1次；L.加入1/5体积的3mol/L NaAc，混匀，加入2.5倍体积的无水乙醇，轻缓混匀，-20℃放置1h。
M.4℃下10000r/min离心20～30min，去除上清液，用70％的乙醇洗涤沉淀2～3次，抽干；N.加入50μl TE或dH2O溶解DNA，备用；(2)AFLP接头和二次扩增的引物AFLP分析所用的EcoRI和MseI接头的核苷酸顺序如下EcoR I接头5′-CTCGTAGACTGCGTACCCTGACGCATGGTTAA-5′MseI接头5′-GACGATGAGTCCTGAGTACTCAGGACTCAT-5′EcoRI和MseI预扩增引物分别为5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′5′-GATGAGTCCTGAGTAAC-3′EcoRI和MseI选择性扩增引物为5′-GACTGCGTACCAATTCAAC/GATGAGTCCTGAGTAACTT-3′(3)AFLP反应条件A.模板DNA的酶切每个反应总体积为25μl，其中包括DNA 250ng，EcoRI(TaKaRa)和MseI(BioLabs)各2.5U，BSA 2.5μg，1×RL Bufter(500mmol/LNaCl，100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，pH7.9)，37℃保温8h；B.DNA片段接头的连接酶切后，每个DNA样品中加入10μl的连接混合液EcoRI adaptor 5pmol，MseI adaptor 50pmol，T4DNA Ligase(TaKaRa)1.2U，1×T4DNA Ligase Buffer(66mmol/L Tris-HCl pH7.6，6.6mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，0.1mmol/L ATP)。16℃连接16h；C.DNA片段的预扩增 取2.5μl连接后的DNA样品，加入22.5μl的预扩增混合液EcoRI预扩增引物和MseI预扩增引物各35ng，dNTP Mixture各5mmol/L，Taq DNA Polymerase(TaKaRa)0.625 U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)。混匀后，按如下PCR程序扩增94℃ 30sec，56℃ 1min，72℃ 1min，30个循环。预扩增产物稀释20倍，-20℃保存备用；D.选择性AFLP扩增 取5μl 20倍稀释的预扩增混合液，加入20μl选择性扩增混合液EcoRI选择性扩增引物和MseI选择性扩增引物各35ng，dNTPMixture各5mmol/L，Taq DNA polymerase(TaKaRa)1U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)。混匀后，按如下PCR程序扩增94℃ 30sec，65℃(每循环降低0.7℃)30sec，72℃ 1min，12个循环后变为94℃ 30sec，56℃ 30sec，72℃ 1min，23个循环。反应结束后，向选择性扩增产物中加入等体积的上样缓冲液(98％甲酰胺，10mmol/L EDTA pH8.0，0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯腈)，95℃变性5min，立即置于冰上冷却，待用；E.扩增产物的聚丙烯酰胺电泳分析经预电泳(55w恒功率)30min后，取3μl上样混合物在6％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析(70w恒功率)，电泳至二甲苯腈指示带距离底部2厘米处终止电泳；F.银染成像a.电泳结束后，取下胶板，放入2ml的固定/终止液(10％醋酸)中，轻摇20min或直到指示剂颜色消失为止；b.用双蒸水漂洗凝胶3次，每次2min；c.将凝胶放入1L的染色液(1g AgNO3，1.5ml 37％甲醛)中，轻摇30min；d.从染色液中取出凝胶，放入双蒸水中，稍作翻动，立即取出浸入预冷的1L显色液(30g NaCO3，1.5ml 37％甲醛，200μl 10mg/ml NaS2O3)中。注意，从凝胶放入水中到其完全浸入显色液中的时间不能超过10sec，否则重复(c)步骤；e.凝胶浸入显色液后，轻轻摇动，出现主带后，将凝胶转入另一显色液中继续显色，直到出现全部清晰谱带；f.待凝胶完全显色后，将固定/终止液倒入显色液中，中止反应；g.用双蒸水漂洗凝胶2次，每次2min；h.取出凝胶，室温下自然晾干、拍片、保存；(4)标准DNA指纹图谱的构建应用引物GACTGCGTACCAATTCAAC/GATGAGTCCTGAGTAACTT构建的7个桑树品种的AFLP指纹图谱如图4所示，A～G代表桑树品种，其中A为桐乡青，B为荷叶白，C为湖桑197，D为盛东一号，E为农桑8号，F为农桑12号，G为农桑14号.右列数字为多态性扩增带的编号。
(5)桑树品种的鉴定将待测桑树样本的指纹图谱与标准图谱相比较，以鉴定待测样本的品种真实性。
实施例5(1)基因池DNA的制备分别从桐乡青、荷叶白、湖桑197、盛东一号、农桑8号、农桑12号、农桑14号6个桑树品种的不同株的桑叶(以嫩叶为佳)提取DNA，混合成品种的基因池。桑叶DNA的提取和纯化步骤如下A.称取1g叶片组织(去除中脉)，加液氮冰冻研磨成干粉，转入离心管后，加4ml抽提缓冲液(100mmol/L Tris-HCl pH8.0，50mmol/L EDTA pH8.0，500mmol/L NaCl，10mmol/L a-巯基乙醇)，混匀；B.加450μl 10％SDS，充分混匀，65℃保温1h；C.加入445μl 5mol/L KAc，充分混匀，-20℃放置1h；D.4℃下12000r/min离心15min；E.上清液转入新离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻轻颠倒离心管数次，放置片刻；F.于4℃下8000r/min离心10min；G.上清液转入另一离心管中，加入2/3体积、-20℃预冷的异丙醇，混匀，-20℃放置1h；H.于4℃下8000r/min离心10min，去除上清液，用70％的乙醇洗涤沉淀2次，抽干；I.加入500μl TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0)溶解沉淀；J.加无DNase的RNase至终浓度100μg/ml，于37℃保温1h；K.加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，放置几分钟后，10000r/min离心10min，吸取上清液，重复1次；L.加入1/5体积的3mol/L NaAc，混匀，加入2.5倍体积的无水乙醇，轻缓混匀，-20℃放置1h；M.4℃下10000r/min离心20～30min，去除上清液，用70％的乙醇洗涤沉淀2～3次，抽干。
N.加入50μl TE或dH2O溶解DNA，备用；(2)AFLP接头和二次扩增的引物AFLP分析所用的EcoRI和MseI接头的核苷酸顺序如下EcoRI接头5′-CTCGTAGACTGCGTACCCTGACGCATGGTTAA-5′MseI接头5′-GACGATGAGTCCTGAGTACTCAGGACTCAT-5′EcoRI和MseI预扩增引物分别为5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′5′-GATGAGTCCTGAGTAAC-3′EcoRI和MseI选择性扩增引物为5′-GACTGCGTACCAATTCAAC/GATGAGTCCTGAGTAACAC-3′(3)AFLP反应条件A.模板DNA的酶切 每个反应总体积为25μl，其中包括DNA 250ng，EcoRI(TaKaRa)和MseI(BioLabs)各2.5U，BSA 2.5μg，1×RL Bufter(500mmol/LNaCl，100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，pH7.9)，37℃保温8h；B.DNA片段接头的连接 酶切后，每个DNA样品中加入10μl的连接混合液EcoRI adalptor 5pmol，MseI adaptor 50pmol，T4DNA Ligase(TaKaRa)1.2U，1×T4DNA Ligase Buffer(66mmol/L Tris-HCl pH7.6，6.6mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，0.1mmol/L ATP)。16℃连接16h；C.DNA片段的预扩增 取2.5μl连接后的DNA样品，加入22.5μl的预扩增混合液EcoRI预扩增引物和MseI预扩增引物各35ng，dNTP Mixture各5mmol/L，Taq DNA Polymerase(TaKaRa)0.625U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)，混匀后，按如下PCR程序扩增94℃ 30sec，56℃ 1min，72℃ 1min，30个循环。预扩增产物稀释20倍，-20℃保存备用；D.选择性AFLP扩增取5μl 20倍稀释的预扩增混合液，加入20μl选择性扩增混合液EcoRI选择性扩增引物和MseI选择性扩增引物各35ng，dNTPMixture各5mmol/L，Taq DNA polymerase(TaKaRa)1U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)。混匀后，按如下PCR程序扩增94℃ 30sec，65℃(每循环降低0.7℃)30sec，72℃ 1min，12个循环后变为94℃ 30sec，56℃ 30sec，72℃ 1min，23个循环，反应结束后，向选择性扩增产物中加入等体积的上样缓冲液(98％甲酰胺，10mmol/L EDTA pH8.0，0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯腈)，95℃变性5min，立即置于冰上冷却，待用；E.扩增产物的聚丙烯酰胺电泳分析经预电泳(55w恒功率)30min后，取3μl上样混合物在6％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析(70w恒功率)，电泳至二甲苯腈指示带距离底部2厘米处终止电泳；F.银染成像a.电泳结束后，取下胶板，放入2ml的固定/终止液(10％醋酸)中，轻摇20min或直到指示剂颜色消失为止；b.用双蒸水漂洗凝胶3次，每次2min；c.将凝胶放入1L的染色液(1g AgNO3，1.5ml 37％甲醛)中，轻摇30min。
d.从染色液中取出凝胶，放入双蒸水中，稍作翻动，立即取出浸入预冷的1L显色液(30g NaCO3，1.5ml 37％甲醛，200μl 10mg/ml NaS2O3)中，注意，从凝胶放入水中到其完全浸入显色液中的时间不能超过10sec，否则重复(c)步骤；e.凝胶浸入显色液后，轻轻摇动，出现主带后，将凝胶转入另一显色液中继续显色，直到出现全部清晰谱带；f.待凝胶完全显色后，将固定/终止液倒入显色液中，中止反应；g.用双蒸水漂洗凝胶2次，每次2min；h.取出凝胶，室温下自然晾干、拍片、保存；(4)标准DNA指纹图谱的构建应用引物GACTGCGTACCAATTCAAC/GATGAGTCCTGAGTAACAC构建的7个桑树品种的AFLP指纹图谱如图5所示，A～G代表桑树品种，其中A为桐乡青，B为荷叶白，C为湖桑197，D为盛东一号，E为农桑8号，F为农桑12号，G为农桑14号.右列数字为多态性扩增带的编号。
(5)桑树品种的鉴定将待测桑树样本的指纹图谱与标准图谱相比较，以鉴定待测样本的品种真实性。
实施例6(1)基因池DNA的制备称取秋丰×白玉、丰一×54A、菁松×皓月、春·蕾×镇·珠、薪杭×白云、夏7×夏6(包括正反交)的六个家蚕品种的蚕卵0.5g，加2ml DNA提取缓冲液(50mmol/L Tris-HCl pH8.0，100mmol/L NaCl，20mmol/L EDTA，100μg/mlProtease K)于冰浴中研磨，加200μl 10％SDS充分混匀，转入离心管后于50℃保温2h。于4℃下10000r/min离心10min，取上清，加等体积氯仿-异戊醇(24∶1)，轻轻颠倒离心管10min使成乳状，于4℃下10000r/min离心10min，吸出水相，用氯仿-异戊醇重抽一次后加2～2.5倍体积-20℃预冷的无水乙醇和1/10体积的3mol/L NaAc，混匀，-20℃中放置1h。于4℃下10000r/min离心20～30min沉淀DNA，沉淀用70％乙醇洗2次，抽干并用1ml TE缓冲液(10mmol/LTris-HCl pH8.0，1mmol/L EDTA pH8.0)溶解，加无DNase的RNase至终浓度100μg/ml，37℃保温1h。按上述方法用氯仿-异戊醇抽提2次，乙醇沉淀DNA，沉淀用70％乙醇洗2次后抽干，加TE溶解；(2)AFLP接头和二次扩增的引物AFLP分析所用的EcoRI和MseI接头的核苷酸顺序如下EcoRI接头5′-CTCGTAGACTGCGTACCCTGACGCATGGTTAA-5′MseI接头5′-GACGATGAGTCCTGAGTACTCAGGACTCAT-5′EcoRI和MseI预扩增引物分别为5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′5′-GATGAGTCCTGAGTAAC-3′EcoRI和MseI选择性扩增引物为5′-GACTGCGTACCAATTCAGG/GATGAGTCCTGAGTAACAA-3′(3)AFLP反应条件A.模板DNA的酶切 每个反应总体积为25μl，其中包括DNA 250ng，EcoRI(TaKaRa)和MseI(BioLabs)各2.5U，BSA 2.5μg，1×RL Bufter(500mmol/LNaCl，100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，pH7.9)，37℃保温8h；B.DNA片段接头的连接酶切后，每个DNA样品中加入10μl的连接混合液EcoRI adaptor 5pmol，MseI adaptor 50pmol，T4DNA Ligase(TaKaRa)1.2U，1×T4DNA Ligase Buffer(66mmol/L Tris-HCl pH7.6，6.6mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，0.1mmol/L ATP)，16℃连接16h；C.DNA片段的预扩增 取2.5μl连接后的DNA样品，加入22.5μl的预扩增混合液EcoRI预扩增引物和MseI预扩增引物各35ng，dNTP Mixture各5mmol/L，Taq DNA Polymerase(TaKaRa)0.625U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)，混匀后，按如下PCR程序扩增94℃ 30sec，56℃1min，72℃ 1min，30个循环，预扩增产物稀释20倍，-20℃保存备用；D.选择性AFLP扩增取5μl 20倍稀释的预扩增混合液，加入20μl选择性扩增混合液EcoRI选择性扩增引物和MseI选择性扩增引物各35ng，dNTPMixture各5mmol/L，Taq DNA polymerase(TaKaRa)1U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)。混匀后，按如下PCR程序扩增94℃ 30sec，65℃(每循环降低0.7℃)30sec，72℃ 1min，12个循环后变为94℃ 30sec，56℃ 30sec，72℃ 1min，23个循环，反应结束后，向选择性扩增产物中加入等体积的上样缓冲液(98％甲酰胺，10mmol/L EDTA pH8.0，0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯腈)，95℃变性5min，立即置于冰上冷却，待用；E.扩增产物的聚丙烯酰胺电泳分析经预电泳(55w恒功率)30min后，取3μl上样混合物在6％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析(70w恒功率)，电泳至二甲苯腈指示带距离底部2厘米处终止电泳；F.银染成像a.电泳结束后，取下胶板，放入2ml的固定/终止液(10％醋酸)中，轻摇20min或直到指示剂颜色消失为止；b.用双蒸水漂洗凝胶3次，每次2min。
c.将凝胶放入1L的染色液(1g AgNO3，1.5ml 37％甲醛)中，轻摇30min。
d.从染色液中取出凝胶，放入双蒸水中，稍作翻动，立即取出浸入预冷的1L显色液(30g NaCO3，1.5ml 37％甲醛，200μl 10mg/ml NaS2O3)中，注意，从凝胶放入水中到其完全浸入显色液中的时间不能超过10sec，否则重复(c)步骤；e.凝胶浸入显色液后，轻轻摇动，出现主带后，将凝胶转入另一显色液中继续显色，直到出现全部清晰谱带；
f.待凝胶完全显色后，将固定/终止液倒入显色液中，中止反应；g.用双蒸水漂洗凝胶2次，每次2min；h.取出凝胶，室温下自然晾干、拍片、保存；(4)标准DNA指纹图谱的构建应用引物GACTGCGTACCAATTCAGG/GATGAGTCCTGAGTAACAA构建的7个桑树品种的AFLP指纹图谱如图6所示，A～L代表家蚕品种，其中A为秋丰×白玉，B为白玉×秋丰，C为丰一×54A，D为54A×丰一，E为菁松×皓月，F为皓月×菁松，G为春·蕾×镇·珠，H为镇·珠×春·蕾，I为薪杭×白云，J为白云×薪杭，K为夏7×夏6，L为夏6×夏7。
(5)家蚕品种的鉴定将待测家蚕样本的指纹图谱与标准图谱相比较，以鉴定待测样本的品种真实性。
权利要求
1.利用AFLP指纹技术鉴定家蚕和桑树品种的方法，其特征在于其步骤如下(1)基因池DNA的来源从同一品种不同个体的家蚕或不同植株的桑树的任何组织器官提取DNA，混合成品种的基因池；(2)AFLP接头和二次扩增即预扩增、选择性扩增的引物AFLP分析所用的EcoRI和MseI接头的核苷酸顺序如下EcoRI接头5′-CTCGTAGACTGCGTACCCTGACGCATGGTTAA-5′MseI接头5′-GACGATGAGTCCTGAGTACTCAGGACTCAT-5′EcoRI和MseI预扩增引物分别为5′-GACTGCGTACCAATTCA-3′5′-GATGAGTCCTGAGTAAC-3′EcoRI和MseI选择性扩增引物为
(3)AFLP反应条件A.模板DNA的酶切每个反应总体积为25μl，其中包括DNA 250ng，EcoRI(TaKaRa)和MseI(BioLabs)各2.5U，BSA 2.5μg，1×RL Bufter(500mmol/LNaCl，100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT，pH7.9)，20～50℃保温20min～8h；B.DNA片段接头的连接酶切后，每个DNA样品中加入10μl的连接混合液EcoRI adaptor 5 pmol，MseI adaptor 50pmol，T4DNA Ligase(TaKaRa)1.2U，1×T4DNA Ligase Buffer(66mmol/L Tris-HCl pH7.6，6.6mmol/L MgCl2，10mmol/LDTT，0.1mmol/L ATP)，10～40℃连接1～16h；C.DNA片段的预扩增取2.5μl连接后的DNA样品，加入22.5μl的预扩增混合液EcoRI预扩增引物和MseI预扩增引物各35ng，dNTP Mixture各5mmol/L，Taq DNA Polymerase(TaKaRa)0.625U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)，混匀后，按如下PCR程序扩增94℃ 20～60sec，56℃ 0.5～2min，72℃ 0.5～2min，20～40个循环，预扩增产物稀释20倍，-20℃保存备用；D.选择性AFLP扩增取5μl 20倍稀释的预扩增混合液，加入20μl选择性扩增混合液EcoRI选择性扩增引物和MseI选择性扩增引物各35ng，dNTPMixture各5mmol/L，Taq DNA polymerase(TaKaRa)1U，1×PCR Buffer(10mmol/LTris-HCl pH8.3，50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl2)，混匀后，按如下PCR程序扩增94℃ 20～60sec，65℃(每循环降低0.7℃)20～60sec，72℃ 0.5～2min，10～20个循环后变为94℃ 20～60sec，56℃ 20～60sec，72℃ 0.5～2min，20～30个循环，反应结束后，向选择性扩增产物中加入等体积的上样缓冲液(98％甲酰胺，10mmol/L EDTA pH8.0，0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯腈)，95℃变性5min，置于冰上冷却，待用；E.扩增产物的聚丙烯酰胺电泳分析经预电泳(55w恒功率)20～50min后，取3μl上样混合物在6％聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分析(50～100w恒功率)，电泳至二甲苯腈指示带距离底部2厘米处终止电泳；F.银染成像a.电泳结束后，取下胶板，放入2ml的固定/终止液(10％醋酸)中，轻摇10～30min或直到指示剂颜色消失为止；b.用双蒸水漂洗凝胶3次，每次1～5min；c.将凝胶放入1L的染色液(1g AgN03，1.5ml 37％甲醛)中，轻摇20～40min；d.从染色液中取出凝胶，放入双蒸水中，稍作翻动，立即取出浸入预冷的1L显色液(30gNaCO3，1.5ml 37％甲醛，200μl 10mg/ml NaS2O3)中；从凝胶放入水中到其完全浸入显色液中的时间不能超过5～15sec，否则重复(c)步骤；e.凝胶浸入显色液后，轻轻摇动，出现主带后，将凝胶转入另一显色液中继续显色，直到出现全部清晰谱带；f.待凝胶完全显色后，将固定/终止液倒入显色液中，中止反应；g.用双蒸水漂洗凝胶2次，每次1～5min；h.取出凝胶，室温下自然晾干、拍片、保存；(4)标准DNA指纹图谱的构建以上述特定引物对家蚕和桑树不同品种进行预扩增和选择性扩增，以二次扩增结果为依据，构建家蚕和桑树品种的标准DNA指纹图谱；(5)家蚕和桑树品种的鉴定将待测家蚕和桑树样本的指纹图谱与标准图谱相比较，以鉴定待测样本的品种真实性。
全文摘要
本发明公开了一种利用AFLP指纹技术鉴定家蚕和桑树品种的方法。是在AFLP指纹技术的基础，以特定家蚕和桑树不同品种的基因池DNA为模板，以限制性内切酶EcoR I和Mse I酶解，然后酶切片段跟含有与其共同粘性末端的人工接头连接，连接后的粘性末端顺序和接头顺序就作为以后PCR反应的引物结合位点来设计引物，并以特定引物对家蚕和桑树不同品种的预扩增、选择性扩增共二次扩增结果为依据，构建家蚕和桑树品种的标准DNA指纹图谱，将待测家蚕和桑树样本的指纹图谱与标准图谱相比较，以鉴定待测样本的品种真实性。本发明为保护桑树育种产权、登录新品种、鉴定和检测苗木真实性和纯度、仲裁苗木纠纷和规范苗木市场提供技术保障。
文档编号G01N33/00GK1553182SQ200310108380
公开日2004年12月8日 申请日期2003年10月30日 优先权日2003年10月30日
发明者钟伯雄, 丁农, 张金卫 申请人:浙江大学, 浙江省湖州蚕桑科学研究所