专利名称：一种红细胞渗透脆性的测定方法
技术领域：
本发明属一种临床上红细胞渗透脆性的测定方法。
背景技术：
人体红细胞约占血液总体积的40％，红细胞内含量最多的水分和血红蛋白分别占红细胞的65％和32％，红细胞在低渗溶液中，水分透过细胞膜进入细胞内，使红细胞逐渐胀大破裂，细胞内血红蛋白溢出即称为低渗性溶血。红细胞对低渗液溶血作用的抵抗能力称为红细胞的渗透脆性。地中海贫血、缺铁性贫血患者红细胞内血红蛋白生成减少，细胞体积较小，渗透脆性比正常人明显减小，因此红细胞渗透脆性是临床上常用于地中海贫血、缺铁性贫血等小细胞性贫血的辅助诊断指标。
现有对红细胞渗透脆性的测定方法主要是通过比色分析法测定红细胞在低渗液作用后反应液中游离血红蛋白的有或无、多或少，也就是溶血率，来判断低渗性溶血是否发生及其程度。具体测定方法有如下两种1、细胞渗透脆性试验，本法是测定红细胞渗透脆性的常规方法，其原理是测定细胞在不同浓度的低渗盐水中，开始溶血和完全溶血的界限，以开始溶血和完全溶血测定管的盐水浓度为测定值，来评价红细胞的渗透脆性，如果开始溶血和完全溶血的盐浓度升高即脆性增高；反之，脆性减低。测定时结果判定的方法是当红细胞发生溶血时，细胞内红色的血红蛋白溢出到溶液中，可见溶液变红色，判定为有溶血；若混匀液静置一段时间后血细胞下沉，试管底可见红色的红细胞沉淀，且上清液为无色，判定为无溶血；若管底无红细胞沉淀，溶液上清液为红色，判定为完全溶血。2、改良一管法，本方法是在常规红细胞渗透脆性试验的基础上进行改良的测定法。其原理是红细胞在某一特定低渗浓度的溶液中，在一定温度条件下，经过一定时间作用后，测定红细胞发生溶血后产生的血红蛋白在溶液中的浓度占全溶血血红蛋白浓度的百分率，来反映红细胞渗透脆性。测定得出的溶血率越高，红细胞数量减少越多，表明红细胞渗透脆性越高，反之越低。此法测定时判断结果的方法是应用分光光度计进行比色分析，用血红蛋白最大吸收波长530nm，测定反应液的吸光度，该吸光度的大小与反应液中血红蛋白的浓度成正比。上述方法需手工加样、离心、比色等，测定步骤多，程序复杂；常规法需要两个多小时，改良一管法需要十多分钟；因全过程都是手工操作，而且操作步骤多，反应条件难以控制，因此导致结果的重复性差和准确性差；同时由于反应体系复杂，需要离心等步骤，难以实现自动化分析。常规法需要用肉眼判断结果，很容易受人为的主观因素影响，导致结果的准确性差。此外由于反应液中同时存在未溶解的红细胞和游离血红蛋白及血液中的其它成分，比色分析法必须要离心后才能对结果进行准确的测定，所以无法实现对反应过程作动态测定分析。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种准确度高，测定重复性好，操作程序简单，测定速度快，能够实现动态测定分析，并易于实现全自动化分析的红细胞渗透脆性的测定方法。
解决上述问题的技术方案是采用比浊分析法测定红细胞渗透脆性将血液样品与特定渗透压的低渗液混合，所述特定渗透压是指具有该渗透压的低渗液应对渗透脆性高的红细胞容易发生低渗性溶血，对渗透脆性低的红细胞不易发生低渗性溶血；将未溶血红细胞作为构成该混合液浊度的主要颗粒，选用一种未溶红细胞对其有较高的吸光度，从红细胞溶出的游离血红蛋白、血液中的胆色素等可溶性有色物质对其有较弱吸光度的特定波长作为测定波长，在分光光度计上对混合液进行比浊分析通过比较相同测定条件下血红细胞在所述特定渗透压低渗液中不同时段的不同吸光度，或者是血红细胞在所述特定渗透压低渗液中和在等渗溶液中的不同吸光度，计算出与血红细胞渗透脆性成正比的溶血率值。
所述溶血率，是指在特定低渗溶液中，发生低渗性溶血的红细胞数量占发生低渗性溶血前的红细胞总数的百分比，溶血率与红细胞的渗透脆性成正比，所以测出溶血率，就可用于临床评价红细胞的渗透脆性。
比浊分析的测定原理是某一波长的入射光通过含颗粒性物质的液体，由于颗粒对入射光产生的反射、吸收或散射，引起了入射光通量的衰减，用分光光度计测定液体吸光度的大小，即可反映液体中颗粒性物质的浓度，也就是浊度，液体的吸光度与浊度成正比。本发明将血红细胞混入低渗液，将未溶于反应液的血红细胞当作构成反应液浊度的主要颗粒，当发生低渗性溶血时，未溶血红细胞数量减少，从溶血血红细胞溶出的游离血红蛋白增加，由于本发明采用了一种对未溶血红细胞吸光度高，对从红细胞溶出的游离血红蛋白和血液中的胆色素等可溶性有色物质吸光度弱的特定波长作为测定波长进行比浊分析，所以反应液的吸光度对未溶血红细胞的数量变化敏感，而对游离血红蛋白及胆红素等可溶性有色物质数量变化不敏感，根据不同吸光度数值的对比，也就是浊度的对比，即可算出溶解的红细胞数量，进而换算出与红细胞渗透脆性成正比的溶血率值。
本发明进一步技术方案之一是动态测定法在有自动恒温和自动记录的分光光度计的比色杯中，加入一定量的所述低渗液，待比色杯内溶液恒定在预定的温度后，加入一定量血液样品，快速混匀后，马上开始记录在所述特定测定波长测定下每一单位时间的吸光度值，以吸光度值不再继续下降为反应终点，从而得到吸光度的动态变化值，进而计算出与血红细胞脆性成正比的动态溶血率值。
本发明进一步技术方案之二是终点测定法在两个容器中分别放入等渗液和所述特定渗透压的低渗液，并分别放入相同比例的血液样品，混匀，在相同的温度条件下，经过一定作用时间，在分光光度计上，用所述特定测定波长分别测出等渗液容器混合液的吸光度和低渗液容器混合液的吸光度，即可算出终点溶血率。
本发明方法不需比色法所要进行的离心、比色等繁琐的步骤，操作简单，节省时间，最快能在2分钟内得到测定结果，易于实现进样、分析、计算的全自动快速分析，而且重复性好，准确度高，同时由于在发生低渗溶血的过程中，混合液中的游离血红蛋白对比浊测定的影响小，不需要经过离心操作，因此能够在低渗溶血的进行过程中即时测定吸光度的动态值，通过动态反应曲线分析获得更多诊断信息。
具体实施例方式
实施例1本例为动态分析法。
1、在有自动恒温和自动记录的分光光度计的比色杯中，加入3毫升0.4％NaCl溶液，待比色杯内溶液恒定在预定反应温度37℃；2、加入10微升血液样品，并立即在3～5秒钟内混匀，马上开始记录用700nm波长测得的每秒钟的吸光度值，以吸光度不再继续下降为反应终点(一般为3～5分钟)，第1秒、第2秒、第3秒…至终点所测得的吸光度值依次表示为a1、a2、a3…aZ；3、通过计算分析可得出以下参数第i秒至第x秒的相对溶血率＝(ai-ax)/ai×100％第一分钟相对溶血率＝(al-a60)/a1×100％4、作图分析以时间为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制出可反映溶血变化的动态曲线图，根据图形的变化特征可对样品的红细胞渗透脆性进行相关分析。
实施例2本例为终点分析法1、取两支试管A和T2、在T管中加入10微升血液样品和3毫升0.9％NaCl溶液，混匀，在A管中加入10微升血液样品和3毫升0.4％NaCl溶液，混匀；将两管同时置于37℃水浴5分钟，在分光光度计上，用700nm波长，测得T管吸光度为t，A管吸光度为a；3、计算终点溶血率＝(t-a)/t×100％t在等渗液中的吸光度(相当于无溶血发生时的吸光度)a发生低渗性溶血后的吸光度对本发明比浊分析法测定条件的说明1、关于低渗液对于血红细胞来说，渗透压等于红细胞内渗透压280～320mOsm/L的溶液为等渗液，低于红细胞内渗透压280mOsm/L的溶液为低渗液。在等渗液里，血红细胞不会发生溶血反应，而在低渗液里，血红细胞即会出现低渗性溶血反应。
通常血红细胞在渗透压越接近280mOsm/L时越不容易发生低渗性溶血反应，在溶液中发生的溶血率越接近于零，在低渗液渗透压越接近零时，越容易发生低渗性溶血，溶血率越接近100％，因此在低渗液渗透压越接近280mOsm/L和0mOsm/L时，反映血红细胞渗透脆性高与低的血液样品的溶血率差距就越小，也就是说用溶血率评价血红细胞渗透脆性的敏感度越低。另外在PH＜7.3和PH＞7.5时，血红细胞容易发生酸碱性的溶血。
因此，本发明所采用的特定渗透压的低渗液，最佳情况是指渗透压为60～200mOsm/L、PH值为7.3～7.5的氯化钠或其它盐溶液。
2、关于在分光光度计上所使用的测定波长由于红细胞溶出的血红蛋白对波长为520～550nm的入射光吸光率最高，最敏感，而本发明对测定波长的要求是使未溶红细胞对其有较高的吸光度，从红细胞溶出的血红蛋白及血液中可溶性有色物质对其有较弱的吸光度，所以本发明的测定波长要选用600～2500nm，而800～2500nm的光波进入近红外光区，该波长段的入射光也能实现本发明目的，但因对设备仪器的要求较高，提高了测试成本。
通过目前已作试验能够确认用600～800nm作为测定波长即能很好实现本发明目的，而且易于实施。
3、本发明血液样品与低渗液的混合比例可选定在1∶50～500，因为在该混合比例范围内，吸光度与浊度最接近正比线性关系。
4、关于低渗液反应过程的温度，可选定在15～45℃之间，以保持适当的溶血速度和避免温度过高或过低而导致的溶血。
权利要求
1.一种红细胞渗透脆性的测定方法，其特征在于，采用比浊分析法测定红细胞渗透脆性将血液样品与特定渗透压的低渗液混合，所述特定渗透压是指具有该渗透压的低渗液应对渗透脆性高的红细胞容易发生低渗性溶血，对渗透脆性低的红细胞不易发生低渗性溶血；将未溶血红细胞作为构成该混合液浊度的主要颗粒，选用一种未溶红细胞对其有较高的吸光度，从红细胞溶出的游离血红蛋白、血液中的胆色素等可溶性有色物质对其有较弱吸光度的特定波长作为测定波长，在分光光度计上对混合液进行比浊分析通过比较相同测定条件下血红细胞在所述特定渗透压低渗液中不同时段的不同吸光度，或者是血红细胞在所述特定渗透压低渗液中和在等渗溶液中的不同吸光度，计算出与血红细胞渗透脆性成正比的溶血率值。
2.根据权利要求1所述的红细胞渗透脆性的测定方法，其特征在于，在有自动恒温和自动记录的分光光度计的比色杯中，加入一定量的所述低渗液，待比色杯内溶液恒定在预定的温度后，加入一定量血液样品，快速混匀后，马上开始记录在所述特定测定波长测定下每一单位时间的吸光度值，以吸光度值不再继续下降为反应终点，从而得到吸光度的动态变化值，进而计算出与血红细胞脆性成正比的动态溶血率值。
3.根据权利要求1所述的红细胞渗透脆性的测定方法，其特征在于，在两个容器中分别放入等渗液和所述特定渗透压的低渗液，并分别放入相同比例的血液样品，混匀，在相同的温度条件下，作用一定时间后，在分光光度计上用所述特定测定波长，分别测出等渗液容器混合液的吸光度和低渗液容器混合液的吸光度，则可算出终点溶血率。
4.根据权利要求1、2或3所述的红细胞渗透脆性的测定方法，其特征在于，所述低渗液是渗透压为60～200mOsm/L、PH值为7.3～7.5的氯化钠或其它盐溶液。
5.根据权利要求1、2或3所述的红细胞渗透脆性的测定方法，其特征在于，所述入射光的波长为600～800nm。
6.根据权利要求4所述的红细胞渗透脆性的测定方法，其特征在于，所述入射光的波长为600～800nm。
7.根据权利要求1、2或3所述的红细胞渗透脆性的测定方法，其特征在于，所述血液样品与低渗液的混合比例为1∶50～500。
8.根据权利要求4所述的红细胞渗透脆性的测定方法，其特征在于，所述血液样品与低渗液的混合比例为1∶50～500。
9.根据权利要求5所述的红细胞渗透脆性的测定方法，其特征在于，所述血液样品与低渗液的混合比例为1∶50～500。
10.根据权利要求6所述的红细胞渗透脆性的测定方法，其特征在于，所述血液样品与低渗液的混合比例为1∶50～500。
全文摘要
一种红细胞渗透脆性的测定方法，采用比浊分析法进行测定将血液样品与特定渗透压的低渗液混合，将未溶血红细胞作为构成该混合液浊度的主要颗粒，选用一种未溶红细胞对其有较高的吸光度，从红细胞溶出的游离血红蛋白等可溶性有色物质对其有较弱吸光度的特定波长作为测定波长，在分光光度计上对混合液进行比浊分析通过比较相同测定条件下血红细胞在所述特定渗透压低渗液中不同时段的不同吸光度，或者是血红细胞在等渗溶液中和在所述特定渗透压低渗液中的不同吸光度，计算出与红细胞渗透脆性成正比的溶血率值。本发明方法具有准确度高、测定重复性好，操作程序简单，测定速度快，能实现动态测定分析，且易于实现全自动化分析的优点。
文档编号G01N21/31GK1588062SQ20041005166
公开日2005年3月2日 申请日期2004年9月29日 优先权日2004年9月29日
发明者潘干华 申请人:潘干华