专利名称：降低实时荧光pcr仪器定量分析系统误差的分析方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种分析方法及应用，更具体地说，涉及一种降低实时荧光PCR仪器定量分析系统误差的分析方法及应用。
背景技术：
在现有的聚合酶链反应(PCR)中，参与扩增反应的每种模板的初始拷贝数(X0)的对数(lnX0)与该模板累积达到某一设定的值所经历的循环次数(n)具有线性关系，这是定量PCR的基础(Higuchi et al.1993)。在此基础上发展起来的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)技术，在其反应体系中加入荧光探针，每扩增一对模板，产生一个荧光分子，当荧光信号的强度(Rn)累积达到某一设定的阈值时，模板所经历的扩增循环数为CT。在整个扩增反应过程中，每次循环检测一次荧光信号的强度，以测定CT值，CT值与lnX0具有下述线性定量关系lnX0＝-ln(1+E)CT+lnK…………(2)这是实时荧光定量PCR的原理(Christian et al.1996)(式中E为扩增效率，K为常数)。测定已知X0的标准品的CT，制作lnX0～CT的标准曲线；测定样品的CT，可从标准曲线上计算出样品模板的初始拷贝数。实时荧光定量PCR技术与常规PCR技术相比，具有特异性强，灵敏度高，PCR污染少和自动化程度高等优势，成为公认的最具应用前景的DNA定量分析技术。
现有的实时荧光定量PCR技术的主要缺陷是定量分析结果的误差大，该技术公认的系统误差达到了80％～100％，往往不能满足定量分析准确度的要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种降低实时荧光PCR仪器定量分析系统误差的分析方法和相应的计算方法，以及该分析方法的应用。该分析方法能大幅度提高定量分析结果的准确度、精确度和大幅度降低定量分析方法的检出限。
为了达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案研究出一种降低实时荧光PCR仪器定量分析系统误差的分析方法，分析过程中包括合成一对引物和一个荧光探针，和使用所述的引物、探针及其它聚合酶链式反应成份组成荧光聚合酶链式反应体系，从待测标本中提取DNA或是提取RNA然后逆转录成cDNA，加入前述的反应体系中，经混合后进行PCR扩增和荧光信号测定，具体方法是(1)用荧光强度Rn达到设定的阈值时模板的扩增时间tn为测量指标进行实时荧光定量分析，按式(1)计算X0值lnX0＝-ln(1+E)(tn/tc)+lnK(1)，式(1)中，E为扩增效率，K为常数，X0是参与扩增反应的每种模板的初始拷贝数，tc是设定的实时荧光PCR每次循环所用的时间；根据lnX0与tn间的线性定量关系，用式(1)计算X0值，测定已知X0的标准品的tn，制作lnX0～tn的标准曲线，并测定样品的tn，再从标准曲线上计算出样品模板的初始拷贝数；(2)测量tn值时，在实时荧光PCR仪器中设置连续扫描，对PCR反应管的荧光信号强度进行实时检测，设定在每次循环的模板延伸阶段中，在每0.01秒～10.00秒的范围内选用特定的任意时间间隔对反应管中的荧光信号强度Rn检测一次，得仪器自动记录的其与时间t的动力学曲线Rn～t，曲线上出现达到阈值的荧光信号所对应的时间，即为相应的tn值。
以下对本发明的分析方法和计算模型进行具体说明实时荧光定量PCR技术的系统误差来自于现有的实时荧光PCR商品仪器的测量程序。现有仪器设置的测量程序是直接根据式(2)的关系建立的，其测量指标是CT值，测量方式是在每次循环中，只检测一次荧光信号的强度，以Rn是否达到设定的阈值作为判定CT值的标准，即仪器能精确辨别CT的最小差值为1次。
以两个样品为例，其模板的初始拷贝数分别为X01和X02，测定其CT分别得到CT1和CT2，根据式(2)可以计算出当CT相差1次时，对应的初始拷贝数X0相差的倍数。
lnX01＝-ln(1+E)CT1+lnK………(3)lnX02＝-ln(1+E)CT2+lnK…………(4)式(3)-(4)，得ln(X01/X02)＝-ln(1+E)(CT1-CT2)＝-ln(1+E)………(5)E取其理论最大值为1，则式(5)为ln(X01/X02)＝-0.6931，即(X01/X02)＝0.5000，X01＝0.5000 X02X02-X01＝X02-0.5000X02＝(1-0.5000)X02＝0.5000 X02结果表明，两个样品的初始拷贝数相差1倍时，才可使测量的CT值相差1次。即当X01与X02间初始模板数的差异为0.5000倍的X02时，仪器才能精确辨别。当不同样品模板的初始拷贝数之差达不到1倍时，测量的CT值则不能精确地指示不同样品间模板初始拷贝数的差异，从而使定量测定结果存在着接近于100％的系统误差。
本发明应用tn进行实时荧光PCR定量分析的原理设实时荧光定量PCR每次循环所用的时间为tc，则tn与CT和tc间具有下述关系tn＝CT×tc即tn/tc＝CT…………(6)将式(6)代入式(2)，得到tn与X0的定量关系lnX0＝-ln(1+E)(tn/tc)+lnK…………(1)由于tc为可人为设定的常数，式(1)表明lnX0与tn间也具有线性定量关系。依据式(1)的定量关系，测定已知X0的标准品的tn，制作lnX0～tn的标准曲线；测定样品的tn，可从标准曲线上计算出样品模板的初始拷贝数。tn值的测量方法在实时荧光PCR仪器中设置连续扫描测量模式，对PCR反应管的荧光信号强度进行实时检测。设定在每次循环的模板延伸阶段中，在每0.01秒～10.00秒的范围内选用特定的任意时间间隔对反应管中的荧光信号强度Rn检测一次，仪器自动记录其与时间t的动力学曲线Rn～t，曲线上出现达到阈值的荧光信号所对应的时间，即为相应的tn值。如果每0.01秒的时间间隔检测一次荧光信号强度(Rn)，所以仪器能辨别tn最小差值的精确度为0.01sec。荧光信号的数学处理的模式连续扫描测量的荧光信号符合PCR扩增反应的动力学方程，具有更精确的Rn～t(时间)的动力学曲线，非常便于进行信号的数学处理，如信号的积分或微分处理。经积分处理后，可使其数值增大，更易于仪器的辨别和检出；信号经微分处理后，可使仪器能更好地分辨信号与噪音，并使测量的噪音降低。
本发明较好的技术方案是每0.01秒的时间间隔对反应管中的荧光信号强度Rn检测一次。由于准确测量tn值的最小单位为0.01sec，按目前模板延伸阶段经常选用的时间为1min计，改用时间标尺后，等同于将CT值的1个最小单位划分为6000个(60sec/0.01sec)更小的单位，可以更精确地确定测量值。
本发明的分析方法的应用该方法用于测定大豆内源基因Lectin的初始拷贝数与CT和tn的关系，用于测定植物样品中外源基因35S的初始拷贝数与CT和tn的关系，用于测定血液样本中乙肝病毒HBV的初始拷贝数与CT和tn的关系，用于测定植物样品中外源基因NOS的初始拷贝数与CT和tn的关系和用于测定玉米内源基因Zein的初始拷贝数与CT和tn的关系。通过测定Lectin基因的拷贝数，可以定量测定样品中大豆成份的含量；通过测定Zein基因的拷贝数，可以定量测定样品中玉米成份的含量；通过测定35S或NOS的拷贝数，可以定量测定样品中转基因成份的含量；通过测定HBV DNA片段的拷贝数，可以定量测定样本中HBV的载量。值得说明的是由于不同植物品种中的35S基因经提取后可采用相同的实时荧光PCR条件进行定量测定，因此，大豆中35S的仪器测定条件可代表各植物品种中35S的仪器测定条件；同样，由于不同植物品种中的NOS基因经提取后可采用相同的实时荧光PCR条件进行定量测定，因此，玉米中NOS的仪器测定条件可代表各植物品种中NOS的仪器测定条件。
与现有技术相比，本发明具有如下明显的优点和效果1、大幅度提高仪器测量的精确度准确测量CT值的最小单位为1次，准确测量tn值的最小单位为0.01sec，按目前模板延伸阶段经常选用的时间为1min计，改用时间标尺后，等同于将CT值的1个最小单位划分为6000个(60sec/0.01sec)更小的单位，可以更精确地确定测量值；2、大幅度提高定量结果的准确度改用tn作为测量指标后，仪器能辨别tn的最小差值为0.01sec。现有两个样品，其模板的初始拷贝数分别为X01和X02，测定其tn分别得到tn1和tn2，根据式(5)可以计算出当tn相差0.01sec时，对应的初始拷贝数X0相差的倍数
ln(X01/X02)＝-ln(1+E)(CT1-CT2)＝-0.6931×(0.01/60)＝-1.155×10-4，(X01/X02)＝0.9999，即X01＝0.9999 X02仪器能精确指示的两个样品间初始拷贝数的差异值为X02-X01＝X02-0.9999 X02＝(1-0.9999)X02＝0.0001 X02结果表明，当X01与X02间初始模板数的差异为0.0001倍的X02时，仪器就能精确辨别。新方法定量结果的准确度比现有方法提高5000倍；3、大幅度降低定量方法的检出限实时荧光定量PCR方法的检出限主要取决于信噪比，信噪比越大，检出限越低。信号经数学处理后，可有效地提高信号水平，降低噪音水平，从而降低仪器的检出限，使仪器的检测能力更强；4、适用范围广可广泛应用于研究基因表达、基因工程、药物疗效、病原体检测和转基因成分检测等领域。
具体实施例方式
以下通过具体的实施方式对本发明进行更加详细的描述实施例1测定大豆内源基因Lectin的初始拷贝数与CT和tn的关系A、原理概述Lectin为大豆专有的内源基因，其拷贝数与样品中大豆成分的含量具有定量关系。通过测定Lectin基因的拷贝数，可以定量测定样品中大豆成分的含量。在实时荧光PCR的扩增反应体系中，加入一对扩增大豆内源基因Lectin的引物和一条能与Lectin基因模板特异结合的TaqMan探针。该探针的两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，TaqDNA聚合酶的5′→3′外切酶活性将结合于模板上的探针酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，从而产生荧光信号，每一个荧光分子的形成对应于每一个Lectin基因双链的扩增。当荧光信号累积达到仪器设置的检测阈值时，对应的PCR扩增的循环数为CT，对应的PCR扩增的循环时间为tn。在一定条件下，PCR扩增反应管中内源基因Lectin的初始模板拷贝数与CT值或tn值成线性关系。
标准样品经提取DNA后，取一定量的DNA提取物于PCR反应管中，加入Lectin的扩增引物和相应的TaqMan探针，用实时荧光PCR仪在确定的反应体系中和扩增条件下进行扩增反应。分别用CT或tn测量程序检测荧光信号强度，记录Rn(荧光信号强度)～C(循环次数)的动力学曲线或Rn～t(时间)的动力学曲线。从曲线上确定相应的CT值或tn值，分别制作lnX0～CT和lnX0～tn的标准曲线，得到相应的标准曲线方程。
大豆样品经提取DNA后，取不同量的DNA提取物于PCR反应管中，制备成含Lectin基因模板初始拷贝数不同的溶液，按标准样品的测定条件，分别测定各溶液的CT值或tn值，分析模板初始拷贝数与CT值或tn值的关系，比较两者的差异。
B、实施详情1、材料1-1试剂样品DNA提取试剂盒Qiagen公司Dneasy Plant MiniKit；引物和探针扩增Lectin基因所采用的引物和探针列于表1表1 扩增内源Lectin基因的引物和探针序列
1-2仪器及反应体系PCR扩增仪美国Biorad公司iCycler实时荧光PCR仪。
PCR反应体系10×Buffer 2.5μL，MgCl2(25mmol/mL)2.0μL，dNTP(10mmol/mL)0.5μL，Primer-I(30μmol/mL)0.4μL，Primer-II(30μmol/mL)0.4μL，Probe(30μmol/mL)0.2μL，Taq酶(5U/μL)0.3μL，UNG酶(1U/μL)0.1μL，模板5μL，加水至25μL。
仪器测量条件50℃3min；95℃10min； 95℃ 15sec，60℃1min(测量CT时，每个循环检测一次荧光信号；测量tn时，每1.00秒检测一次荧光信号)，40cycles。
实时荧光PCR反应运行按预先设定的样品摆放顺序将PCR反应管依次摆放(上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器)，开始运行仪器进行实时荧光PCR反应。按照仪器的操作说明书运行仪器，最后计算和打印结果。
1-3样品包括大豆标准样品和大豆样品，其中大豆标准样品美国Fluka公司Roundup ready soya标准样品(大豆成分含量100％)，大豆样品采用转基因巴西大豆。
2、方法2-1样品制备称取约50g大豆样品，用湿热灭菌(121℃处理30min)或干热灭菌(180℃处理30h)的研钵或合适的粉碎装置将样品粉碎至约0.5mm左右。
2-2 DNA的提取及制备液氮研磨至粉末状，称取样品100.0mg，加入1.5mL或2.0mL离心管。采用Qiagen公司Dneasy Plant Mini Kit提取DNA，使用时按照操作说明书进行操作，最后定容至100μL。
2-3标准曲线的制作 以标准样品(100％)的DNA提取液作梯度稀释，制备系列浓度的标准溶液。分别测定各溶液的CT值或tn值。分别制作lnX0～CT和lnX0～tn的标准曲线，得到相应的标准曲线方程。
2-4样品测定 分别取样品DNA提取液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2μL，加入PCR反应管中。分别测定各溶液的CT值或tn值。
3 结果与分析3-1 标准曲线方程(1)Lectin基因模板的lnX0～CT标准曲线方程lnX0＝-0.7001CT+11.665(2)Lectin基因模板的lnX0～tn标准曲线方程lnX0＝-0.7001(tn/60.00)+11.6653-2 样品测定结果分别测定各样品溶液的CT值或tn值的结果列于表2
表2 样品溶液的测定结果编号1 23 4 567 8 910DNA0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2溶液CT2423 2323 22 22 22 22 22 21tn1458 1424 1399 13801364 1351 133913301320 1312注DNA溶液体积单位为μl，CT的单位为次数，tn的单位为秒。
3-3结果的分析与比较从表2可见，测量样品的CT值时，样品2～4得到同一测量值，样品5～9得到同一测量值，即用CT值无法分辨以上样品中Lectin初始模板数的变化；而测量样品的tn值时，以上样品均得到差值显著的测量结果，可以从tn值的变化精确地指示不同样品中Lectin初始模板数的变化。因此，测量样品的tn值可以得到较准确的定量分析结果。
实施例2测定植物样品中外源基因35S的初始拷贝数与CT和tn的关系A 原理概述35S为转基因植物常用的外源启动子，其拷贝数与样品中转基因成分的含量具有定量关系。通过测定35S的拷贝数，可以定量测定样品中转基因成分的含量。在实时荧光PCR的扩增反应体系中，加入一对扩增外源基因35S的引物和一条能与35S模板特异结合的TaqMan探针。35S与上述Lectin基因的测定原理及步骤基本相同。
B 实施详情1、材料
1-1试剂及样品 DNA提取试剂盒Qiagen公司Dneasy PlantMini Kit，引物和探针扩增35S所采用的引物和探针列于表3表3 扩增外源基因35S的引物和探针序列
1-2仪器 同实施例1Lectin基因的仪器，测量条件50℃ 3min；95℃10min；95℃15sec，60℃1min(测量CT时，每个循环检测一次荧光信号；测量tn时，每0.10秒检测一次荧光信号)40cycles。
1-3样品 转基因大豆标准样品美国Fluka公司Roundupready soya标准样品(转基因大豆成分含量5.0％)，大豆样品为转基因巴西大豆。
2、方法2-1 样品制备 同实施例1Lectin基因的样品制备方法。
2-2 DNA的提取及制备 同实施例1Lectin基因的DNA提取方法。
2-3 标准曲线的制作 以标准样品(GM％＝5％)的DNA提取液作梯度稀释，制备系列浓度的标准溶液。分别测定各溶液的CT值或tn值。分别制作lnX0～CT和lnX0～tn的标准曲线，得到相应的标准曲线方程。
2-4样品测定 分别取样品DNA提取液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0μL，加入PCR反应管中。分别测定各溶液的CT值或tn值。
3、结果与分析3-1标准曲线方程(1)35S模板的lnX0～CT标准曲线方程lnX0＝-0.6988CT+12.051(2)35S模板的lnX0～tn标准曲线方程lnX0＝-0.6988(tn/60.00)+12.0513-2样品测定结果分别测定各样品溶液的CT值或tn值的结果列于表4表4 样品溶液的测定结果编号 123 4 5 6 7 8 910DNA0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0溶液CT26 25 25 25 24 24 24 24 23 23tn1618.8 1559.4 1524.6 1500.0 1480.8 1465.2 1452.0 1440.0 1430.4 1421.4注DNA溶液体积单位为μl，CT的单位为次数，tn的单位为秒。
3-3结果的分析与比较从表4可见，测量样品的CT值时，样品2～4得到同一测量值，样品5～8得到同一测量值，即用CT值无法分辨以上样品中35S初始模板数的变化；而测量样品的tn值时，以上样品均得到差值显著的测量结果，可以从tn值的变化精确地指示不同样品中35S初始模板数的变化。因此，测量样品的tn值可以得到较准确的定量分析结果。
实施例3 测定血液样本中乙肝病毒(HBV)的初始拷贝数与CT和tn的关系A原理概述乙型肝炎病毒(HBV)DNA片段的拷贝数与样本中HBV的载量具有定量关系。通过测定HBV DNA片段的拷贝数，可以定量测定样本中HBV的载量。采用购买的HBV PCR荧光定量检测试剂盒，按其操作流程进行测定。
B实施详情1、材料1-1 试剂及样品HBV PCR荧光定量检测试剂盒(国药准字S20020033)深圳市匹基生物工程股份有限公司产品。
1-2仪器 PCR扩增仪美国Biorad公司iCycler实时荧光PCR仪。按检测试剂盒操作流程进行测定。
仪器测量条件37℃ 5min；94℃ 1min；95℃ 5sec，60℃ 30sec(测量CT时，每个循环检测一次荧光信号；测量tn时，每0.01秒检测一次荧光信号)，42cycles。
1-3样品 1～4号标准品(1～5)×104～(1～5)107copies/mL，随试剂盒配发；对照品阴性对照、强阳性对照、临界阳性对照样品，随试剂盒配发。
2、方法2-1 样品DNA的提取及制备 取强阳性对照品100μL，按检测试剂盒操作流程进行裂解，提取和分离DNA，制备样品DNA提取液100μL。
2-2标准曲线的制作 分别取1～4号标准品各2μL于PCR反应管中，按检测试剂盒操作流程测定各溶液的CT值或tn值。分别制作lnX0～CT和lnX0～tn的标准曲线，得到相应的标准曲线方程。
2-3样品测定 分别取样品DNA提取液1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3.0μL，加入PCR反应管中。分别测定各溶液的CT值或tn值。
3、结果与分析3-1 标准曲线方程(1)HBV模板的lnX0～CT标准曲线方程lnX0＝-0.3396 CT+14.918(2)HBV模板的lnX0～tn标准曲线方程lnX0＝-0.3396(tn/30.00)+14.9183-2 样品测定结果分别测定各样品溶液的CT值或tn值的结果列于表5表5样品溶液的测定结果编号 1 2 34 56 78 9 10DNA溶液 1.21.4 1.6 1.8 2.0 2.22.4 2.6 2.8 3.0HBV264.4 308.5 352.6396.6 440.7484.8 528.8572.9 617.0 661.0模板数CT27 27 26 26 26 25 25 25 25 24tn825.03 810.06 799.52 789.34 780.07 771.60 763.85 756.61 750.04 744.08注DNA溶液体积单位为μl，HBV模板数单位为copies/ml，CT的单位为次数，tn的单位为秒。
3-3 结果的分析与比较从表5可见，测量样品的CT值时，样品3～5得到同一测量值，样品6～9得到同一测量值，即用CT值无法分辨以上样品中HBV初始模板数的变化；而测量样品的tn值时，以上样品均得到差值显著的测量结果，可以从tn值的变化精确地指示不同样品中HBV初始模板数的变化。因此，测量样品的tn值可以得到较准确的定量分析结果。
实施例4测定植物样品中外源基因NOS的初始拷贝数与CT和tn的关系A原理概述NOS为转基因植物常用的外源终止子，其拷贝数与样品中转基因成分的含量具有定量关系。通过测定NOS的拷贝数，可以定量测定样品中转基因成分的含量。在实时荧光PCR的扩增反应体系中，加入一对扩增外源基因NOS的引物和一条能与NOS模板特异结合的TaqMan探针。NOS与上述Lectin基因的测定原理及步骤基本相同。
B实施详情1、材料1-1试剂及样品DNA提取试剂盒Qiagen公司Dneasy PlantMini Kit，引物和探针扩增NOS所采用的引物和探针列于表6表6 扩增外源基因NOS的引物和探针序列
1-2仪器 同实施例1Lectin基因的仪器，测量条件50℃ 3min；95℃ 10min；95℃ 15sec，60℃1min(测量CT时，每个循环检测一次荧光信号；测量tn时，每0.10秒检测一次荧光信号)，40cycles。
1-3 样品 转基因玉米标准样品美国Fluka公司Bt11 maize标准样品(转基因玉米成分含量2.0％)，转基因玉米样品美国Fluka公司。
2、方法2-1 样品制备 同实施例1Lectin基因的样品制备方法。
2-2 DNA的提取及制备 同实施例1Lectin基因的DNA提取方法。
2-3 标准曲线的制作 以标准样品(GM％＝2％)的DNA提取液作梯度稀释，制备系列浓度的标准溶液。分别测定各溶液的CT值或tn值。分别制作lnX0～CT和lnX0～tn的标准曲线，得到相应的标准曲线方程。
2.4 样品测定 分别取样品DNA提取液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0μL，加入PCR反应管中。分别测定各溶液的CT值或tn值。
3、结果与分析3-1 标准曲线方程(1)NOS模板的lnX0～CT标准曲线方程lnX0＝-0.7667CT+14.9752(2)NOS模板的lnX0～tn标准曲线方程lnX0＝-0.7667(tn/60.00)+14.97523-2 样品测定结果分别测定各样品溶液的CT值或tn值的结果列于表7表7 样品溶液的测定结果编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10DNA0.5 1.0 1.5 2.02.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0溶液CT25 24 23 23 23 22 22 22 2222tn1506.0 1451.7 1419.9 1397.4 1380.0 1365.6 1353.6 1342.8 1333.81326.0注DNA溶液体积单位为μl，CT的单位为次数，tn的单位为秒。
3-3结果的分析与比较从表7可见，测量样品的CT值时，样品3～5得到同一测量值，样品6～10得到同一测量值，即用CT值无法分辨以上样品中NOS初始模板数的变化；而测量样品的tn值时，以上样品均得到差值显著的测量结果，可以从tn值的变化精确地指示不同样品中NOS初始模板数的变化。因此，测量样品的tn值可以得到较准确的定量分析结果。
实施例5测定玉米内源基因Zein的初始拷贝数与CT和tn的关系A原理概述Zein为玉米专有的内源基因，其拷贝数与样品中玉米成分的含量具有定量关系。通过测定Zein基因的拷贝数，可以定量测定样品中玉米成分的含量。在实时荧光PCR的扩增反应体系中，加入一对扩增外源基因Zein的引物和一条能与Zein模板特异结合的TaqMan探针。Zein与上述Lectin基因的测定原理及步骤基本相同。
B实施详情1、材料
1-1试剂及样品 DNA提取试剂盒Qiagen公司Dneasy PlantMini Kit，引物和探针扩增Zein所采用的引物和探针列于表8表8 扩增外源基因Zein的引物和探针序列
1-2仪器 同实施例1Lectin基因的仪器，测量条件50℃3min；95℃10min；95℃15sec，60℃1min(测量CT时，每个循环检测一次荧光信号；测量tn时，每10.00秒检测一次荧光信号)，40cycles。
1-3样品 玉米标准样品美国Fluka公司(玉米成分含量100％)。玉米样品采用转基因玉米样品。
2、方法2-1 样品制备 同实施例1Lectin基因的样品制备方法。
2-2 DNA的提取及制备 同实施例1Lectin基因的DNA提取方法。
2-3 标准曲线的制作 以标准样品(玉米成分含量＝100％)的DNA提取液作梯度稀释，制备系列浓度的标准溶液。分别测定各溶液的CT值或tn值。分别制作lnX0～CT和lnX0～tn的标准曲线，得到相应的标准曲线方程。
2-4 样品测定 分别取样品DNA提取液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2μL，加入PCR反应管中。分别测定各溶液的CT值或tn值。
3 结果与分析3-1 标准曲线方程(1)Zein基因模板的lnX0～CT标准曲线方程lnX0＝-0.5685CT+12.973(2)Zein基因模板的lnX0～tn标准曲线方程lnX0＝-0.5685(tn/60.00)+12.9733-2 样品测定结果分别测定各样品溶液的CT值或tn值的结果列于表9表9 样品溶液的测定结果编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10DNA0.40.60.81.01.2 1.41.61.8 2.0 2.2溶液CT22 22 21 21 2120 20 202019tn1370 1330 1300 1270 1260 1240 1220 1210 1200 1190注DNA溶液体积单位为μl，CT的单位为次数，tn的单位为秒。
3-3结果的分析与比较从表7可见，测量样品的CT值时，样品1～2得到同一测量值，样品3～5得到同一测量值，样品6～9得到同一测量值，即用CT值无法分辨以上样品中NOS初始模板数的变化；而测量样品的tn值时，以上样品均得到差值显著的测量结果，可以从tn值的变化精确地指示不同样品中NOS初始模板数的变化。因此，测量样品的tn值可以得到较准确的定量分析结果。
权利要求
1.一种降低实时荧光PCR仪器定量分析系统误差的分析方法，分析过程中包括合成一对引物和一个荧光探针，和使用所述的引物、探针及其它聚合酶链式反应成份组成荧光聚合酶链式反应体系，从待测标本中提取DNA或是提取RNA然后逆转录成cDNA，加入前述的反应体系中，经混合后进行PCR扩增和荧光信号测定，其特征在于(1)用荧光强度Rn达到设定的阈值时模板的扩增时间tn为测量指标进行实时荧光定量分析，按式(1)计算X0值lnX0＝-ln(1+E)(tn/tc)+lnK………(1)式(1)中，E为扩增效率，K为常数，X0是参与扩增反应的每种模板的初始拷贝数，tc是设定的实时荧光PCR每次循环所用的时间；根据lnX0与tn间的线性定量关系，用式(1)计算X0值，测定已知X0的标准品的tn，制作lnX0～tn的标准曲线，并测定样品的tn，再从标准曲线上计算出样品模板的初始拷贝数；(2)测量tn值时，在实时荧光PCR仪器中设置连续扫描，对PCR反应管的荧光信号强度进行实时检测，设定在每次循环的模板延伸阶段中，在每0.01秒～10.00秒的范围内选用特定的任意时间间隔对反应管中的荧光信号强度Rn检测一次，得仪器自动记录的其与时间t的动力学曲线Rn～t，曲线上出现达到阈值的荧光信号所对应的时间，即为相应的tn值。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于每0.01秒的时间间隔对反应管中的荧光信号强度Rn检测一次。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于该方法用于测定大豆内源基因Lectin的初始拷贝数与CT和tn的关系。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于该方法用于测定植物样品中外源基因35S的初始拷贝数与CT和tn的关系。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于该方法用于测定血液样本中乙肝病毒HBV的初始拷贝数与CT和tn的关系。
6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于该方法用于测定植物样品中外源基因NOS的初始拷贝数与CT和tn的关系。
7.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于该方法用于测定玉米内源基因Zein的初始拷贝数与CT和tn的关系。
全文摘要
本发明公开了一种降低实时荧光PCR仪器定量分析系统误差的分析方法及应用，用荧光强度R
文档编号G01N21/84GK1588002SQ20041005155
公开日2005年3月2日 申请日期2004年9月16日 优先权日2004年9月16日
发明者邓平建, 杨冬燕 申请人:邓平建, 杨冬燕