专利名称：光热变换分光分析方法及执行该方法的光热变换分光分析装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种光热变换分光分析方法及装置，向试件聚光照射激励光，形成热透镜，同时，照射检测光，感光透过试件的检测光，测定导致热透镜引起的折射的检测光的强度变化，尤其是涉及在关于微小空间的测定中可进行高精度的超微量分析、同时可在任意场所进行简便测定的光热变换分光分析方法及装置。
背景技术：
近年来，作为进行半导体或生物试件、或各种液体试件等的分析或测定的方法，广泛利用分光分析方法。但是，在现有的分光分析方法中，在分析微小空间中的微量物质或微小物质的情况下，必需在真空环境内进行测定。另外，利用电子束或离子束产生试件破坏或损坏等问题。
另外，在处理溶液或生物组织中等超微量的试件的情况下，必需使用具有高的空间分辨率并可以高精度进行分析的光学区域的显微镜。实际用作这种显微镜的限于激光荧光显微镜。因此，分析的对象也自然限于激光荧光显微镜荧光分子。
基于这种情况，要求如下分析方法，即不必真空环境，可非接触进行非损坏的无担心的分析，且分析对象也不限于荧光分子，具有高的空间分辨率并可以高精度进行分析。
作为满足这些要求的分析方法，利用光热变换现象产生的热透镜效应的光热变换分光分析法引人注意。
该光热变换分光分析法是如下分析方法，即利用所谓光热变换效应，当向试件聚光照射光时，由于试件中的溶质吸收的光所放出的热能，溶媒局部温度上升，从而折射率变化，形成热透镜。
图3是热透镜的原理说明图。
图3中，若经显微镜的物镜向极微小试件聚光照射激励光，则感应光热变换效应。大部分物质中，伴随温度上升，折射率变小。因此，聚光照射激励光的试件越接近温度上升程度大的聚光中心，折射率下降越大，越接近远离聚光中心的周边部，温度上升的程度因热扩散而越小，所以折射率下降越小。光学上该折射率的分布正好发挥与凹透镜一样的效应，所以将该效应称为热透镜效应。该热透镜效应的大小、即凹透镜的度数与试件的光吸收度成正比。另外，在折射率与温度成正比变大的情况下，相反产生与凸透镜一样的效应。
这样，上述光热变换分光分析法观察试件中的热扩散、即试件的折射率变化，所以适于检测极微小试件的浓度。
作为执行上述光热变换分光分析法的光热变换分光分析装置，例如记载于特开平10-232210号公报中。
在这种光热变换分光分析装置中，将试件配置在显微镜的物镜下方，从激励光用光源输出的规定波长的激励光入射到显微镜，由物镜聚光照射到试件中的极微量区域。将聚光照射后的激励光的焦点位置作为中心，形成热透镜。
另一方面，从检测光源放射波长与激励光不同的检测光，在入射到显微镜后，从显微镜射出。该射出的检测光聚光照射到由激励光形成于试件中的热透镜上。透过试件的检测光因热透镜的效应而发散或聚光。从该试件发散或聚光后射出的光作为信号光，经聚光透镜及过滤器、或仅经过滤器，由检测器感光、检测。检测到的信号光的强度对应于试件中形成的热透镜折射率。
检测光的频率可以是与激励光相同的频率，另外，激励光也可兼用检测光。一般在设激励光与检测光的频率不同的情况下，得到良好的灵敏度。
但是，上述光热变换分光分析装置由于光源、测定部或检测部(光电变换部)的光学系统等的结构复杂，所以大型，缺乏可搬运性。因此，当利用该光热变换分光分析装置来进行分析或化学反应时，存在装置的设置场所或装置的操作被限定的问题，进而存在用户的作业效率差的问题。
在使用利用热透镜的光热变换分光分析法时，多数情况下激励光的焦点位置与检测光的焦点位置必需不同。图4A、B是涉及激励光的行进方向的热透镜的形成位置与检测光的焦点位置的说明图，图4A表示物镜中有色差的情况，图4B表示物镜中无色差的情况。
在物镜130中有色差的情况下，如图4A所示，热透镜131形成于激励光的焦点位置132上，同时，检测光的焦点位置133偏离激励光的焦点位置132△L，所以可由该检测光来检测热透镜131的折射率变化，作为检测光的焦距变化。另一方面，在物镜130中无色差的情况下，如图4B所示，检测光的焦点位置133与激励光的焦点位置132、即热透镜131的位置大致一致。结果，检测光不会引起热透镜131的折射，所以不能检测热透镜131的折射率变化但是，显微镜的物镜通常被无色差地制造，所以由于上述理由，检测光的焦点位置133与形成于激励光的焦点位置132上的热透镜131的位置大致一致(图4B)。因此，不能检测热透镜131的折射率变化。从而，必然如图5A及图5B所示，每次测定时，形成热透镜的试件的位置都偏离检测光的焦点位置133，或如图6所示，使用未图示的透镜，使检测光多少发散或聚光后入射到物镜130，由此检测光的焦点位置133偏离热透镜131，花费手续，存在用户的作业效率差的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可进行高灵敏度测定的光热变换分光分析方法及执行该方法的小型光热变换分光分析装置。
为了实现上述目的，根据本发明的第1形态，提供一种光热变换分光分析方法，具有聚光照射工序，由聚光透镜将激励光与检测光聚光照射到试件上；和测定工序，测定透过所述激励光的聚光照射生成的热透镜的检测光的偏向所伴随的强度变化，其特征在于所述聚光照射工序中聚光照射的所述激励光与所述检测光的频率不同，所述聚光透镜中，所述检测光的焦点位置偏离所述激励光的焦点位置的长度是所述激励光的频率下共焦点长度的2倍以上、30倍以下。
为了实现上述目的，根据本发明的第2形态，提供一种光热变换分光分析方法，具有聚光照射工序，由聚光透镜将激励光与检测光聚光照射到试件上；和测定工序，测定透过所述激励光的聚光照射生成的热透镜的检测光偏向所伴随的强度变化，其特征在于所述激励光与所述检测光的频率不同，所述聚光透镜中，检测光的焦点位置相对激励光的焦点位置的偏离是激励光的频率下共焦点长度的2倍以上、25倍以下。
根据本发明的第1及第2形态，所述聚光透镜最好是棒状透镜。
为了实现上述目的，根据本发明的第3形态，提供一种光热变换分光分析装置，具备聚光透镜，将激励光与检测光聚光照射到试件上；和测定部件，测定透过所述激励光的聚光照射生成的热透镜的检测光的偏向所伴随的强度变化，其特征在于所述聚光照射的激励光与检测光的频率不同，所述聚光透镜中，所述检测光的焦点位置偏离所述激励光的焦点位置的长度是所述激励光的频率下共焦点长度的2倍以上、30倍以下。
为了实现上述目的，根据本发明的第4形态，提供一种光热变换分光分析装置，具备聚光透镜，将激励光与检测光聚光照射到试件上；和测定部件，测定透过所述激励光的聚光照射生成的热透镜的检测光的偏向所伴随的强度变化，其特征在于所述聚光照射的激励光与所述检测光的频率不同，所述聚光透镜中，所述检测光的焦点位置相对所述激励光的焦点位置的偏离长度是所述激励光的频率下共焦点长度的2倍以上、25倍以下。
根据本发明的第3及第4形态，所述聚光透镜最好是棒状透镜。
图1是表示本发明实施形态的光热变换分光分析装置的示意结构图。
图2是表示△L与光热变换分光分析方法下的信号强度的关系一例的图。
图3是热透镜的原理说明图。
图4A是关于激励光的行进方向的热透镜的形成位置与检测光的焦点位置的说明图，表示物镜中有色差的情况。
图4B是关于激励光的行进方向的热透镜的形成位置与检测光的焦点位置的说明图，表示物镜中无色差的情况。
图5A是关于激励光的行进方向的热透镜的形成位置与检测光的焦点位置的说明图，表示热透镜关于检测光的焦点位置形成于物镜侧的情况。
图5B是关于激励光的行进方向的热透镜的形成位置与检测光的焦点位置的说明图，表示热透镜关于检测光的焦点位置形成于物镜的相反侧的情况。
图6是现有光热变换分光分析装置中检测热透镜的折射率变化的方法说明图。
具体实施例方式
下面，参照附图来详细说明本发明实施形态的光热变换分光分析方法及执行该方法的光热变换分光分析装置。
图1是表示本发明实施形态的光热变换分光分析装置的示意结构图。
图1中，在从激励光用光源111射出的激励光的光路上，在激励光用光源111附近，配置调制激励光并使后述的热透镜信号S/N比提高的截光器(chopper)112。调制后的激励光在由反射镜114改变行进方向后，透过分色镜113。在该分色镜113的两个面中与激励光入射的面相反的面，入射来自检测光用光源120的检测光。检测光被分色镜113反射，与激励光同轴后，导入具有适当色差的透镜10。
透镜10由可动的保持部15保持。在本实施形态中，透镜10是折射率分布型棒状透镜。另外，透镜10只要具有规定的色差，则不限于折射率分布型棒状透镜。
该棒状透镜10由折射率从中心向周边部连续变化的例如玻璃或塑料制的圆柱状透明体构成(例如特开昭63-63502号公报)。
棒状透镜10已知作为集束性光传导体，设轴上折射率为n0，2次分布常数为g，则从中心轴向半径方向位于r距离位置上的折射率n(r)近似地由关于r的2次方程式n(r)＝n0{1-(g2/2)·r2}表示。
棒状透镜10在0＜z0＜π/2g的范围内选择其长度z0时，其成像特性两端面平坦，与通常的凸透镜相同，通过平行入射光线，在射出端的s0＝cot(gz0)/n0g的位置上形成焦点。
另外，棒状透镜10例如通过以下方法制造。
即，在以摩尔百分率SiO257-63％、B2O317-23％、Na2O5-17％、Tl2O3-15％为主要成分的玻璃形成棒后，在硝酸钙盐浴等离子交换媒体中处理该玻璃棒，将玻璃中的铊离子及钠离子与媒体中的钙离子进行离子交换，在玻璃棒内提供从中心向周边连续降低的折射率分布。
棒状透镜10的光轴在圆柱状棒状透镜10的两端面垂直交叉，所以可使激励光及检测光双方的光轴容易地重合在棒状透镜10的光轴上。并且，该棒状透镜10与显微镜用物镜相比小的多，所以可以使装置整体小型化。
在X-Y试件台125上配置在棒状透镜10的下方流过用于检测的试件的带流路板状部件20。X-Y试件台125可动的区域是图1的纸面上与纸面正交的平面内。
流过用于检测的试件的带流路板状部件20由重叠3层粘接的玻璃基板201、202、203构成，在中间的玻璃基板202中，形成用于混合、或搅拌、或合成、或分离、或抽取、或检测试件等的流路204。
该带流路板状部件20的材料从持久性、耐药性方面，期望是玻璃。尤其是若考虑细胞等生物试件、例如作为DNA分析用的用途，则最好是耐酸性、耐碱性高的玻璃，具体而言，最好是硼硅酸玻璃、硷石灰玻璃、铝硼硅酸玻璃、石英玻璃等。但是，通过限定用途，可使用由塑料等有机物质制造的物质。
棒状透镜10的激励光的焦点位置必需位于带流路板状部件20的流路204中。但是，棒状透镜10不必接触带流路板状部件20，在接触的情况下，可由板状部件20的上部玻璃板201的厚度来调整棒状透镜10的焦距。在上部玻璃板201的厚度不够的情况下，也可在棒状透镜10与上部玻璃板201之间加入用于调整焦距的隔板。在这些情况下，因为也不必调整焦距，所以可进一步小型化装置。
以下说明激励光的焦点位置与检测光的焦点位置的偏差(ΔL)为多大合适。在测定对象物是非常薄的薄膜的情况下，得到用于聚光照射激励光的物镜的共焦点长度的√3倍最佳的结果(Analyst，August1995，Vol.120，2053)。共焦点长度(Icnm)由Ic＝π·(d/2)2/λ1来计算。这里，d是由d＝1.22×λ1/NA计算的爱里盘，λ1是激励光的波长(nm)，NA是所用的棒状透镜10的数值孔径。ΔL的值表示激励光的焦点位置与检测光的焦点位置的差，所以检测光的焦距不会因比激励光的焦距长还是短而不同。
但是，上述ΔL的最佳值是在激励光与检测光为相同频率、试件相对物镜的共焦点长度不厚的情况下得到的。
当前，在微小空间中进行化学反应的集成化技术从化学反应的高速性、微小量的反应、在位(on site)分析等观点看引人注意，世界上潜心进行研究。
作为上述集成化技术之一，有在小的玻璃基板等中制作的细微流路中进行全部试件的混合、反应、分离、抽取、检测。这既可以仅将分离作为目的的单一功能下使用，也可复合使用。
作为仅将分离作为目的，提议分析极微量的蛋白或核酸等的电泳装置。具备由彼此接合的两块玻璃基板构成的带流路板状部件(例如特开平8-178897号公报)。
形成于其中使用的板状部件的流路必需边维持作为液体的特性边流过溶液，所以深度通常为50-100微米左右。在该流路中作为测定对象物的溶液流过的状态下，实施光热变换分光分析，意味着测定对象物的厚度(深度)比激励光的共焦点长度大得多。例如，由NA(数值孔径)0.4的物镜聚光波长为532nm的激励光情况下的共焦点长度为3.9微米，流路的厚度是其10倍以上。将测定对象的厚度比共焦点长度大的情况与上述薄膜相比，生成热透镜的薄膜与在厚度方向上层叠多数的状态相同，最终变为其积分值，所以可以预想激励光与检测光的焦点位置偏差的最佳值比薄膜的情况还大。但是，若激励光与检测光的焦点位置偏差过大，则透过激励光生成的热透镜的检测光量变得过少，检测灵敏度降低。因此，光热变换分光分析方法中使用的物镜具有的色差、即激励光的焦点位置与检测光的焦点位置的差(ΔL)期望是激励光的共焦点长度的2倍-30倍，更期望是2倍-25倍。进一步期望是3倍-25倍。
在用于光热变换分光分析方法中的激励光的强度小的情况或测定对象物的浓度低的情况等，由于离开激励光的焦点位置的部分中热透镜的度数变小，所以预想积分测定对象物的厚度整体的热透镜效应变小。在这种情况下，期望ΔL比上述值小。从而，期望ΔL为2倍-25倍，较期望是3倍-25倍、更期望是3倍-20倍。
这里，示例使用折射率分布型棒状透镜得到何种程度色差。在所用的折射率分布型棒状透镜中，使用日本板硝子株式会社的SELFOC透镜目录中记载的SLH透镜。该目录中记载了直径为1.8mm透镜的特性，所以将其换算成直径1mm后使用。
在设带流路板状部件的材质为パィレツクス(注册商标)玻璃、比流路靠上的部分的厚度(上部玻璃201的厚度)为0.18mm、流路深度为0.1mm、折射率分布型棒状透镜SLH的直径为1mm、该透镜中光实际透过的有效直径为0.7mm、棒长为1.7mm、激励光波长为488nm、检测光波长为633nm、激励光的焦点位置位于流路正中的情况下，激励光与检测光的焦点位置差(ΔL)为45微米。此时的焦点位置中的NA为0.46，激励光下的共焦点长度为2.7微米。因此，△L为共焦点长度的约17倍。
图2是表示ΔL与光热变换分光分析方法下的信号强度的关系一例的图。图2所示信号强度是在下述条件下测定的。
使用无色差、NA为0.4的显微镜物镜来作为物镜。激励光原样导入物镜，在检测光入射到物镜以前，通过发散或聚光，使焦点位置变化。试件是以10-4摩尔的浓度来溶解落日黄的水溶液，流入0.1mm厚度的流路中。激励光的波长为532nm，检测光的波长为633nm。图2在这种条件下使激励光的焦点位置位于沟的中心，从该位置向光轴方向偏离检测光的焦点位置，测定由光热变换分光分析方法得到的信号强度并绘制。
图2中，信号强度最高是ΔL约为60微米的情况，是激励光的共焦点长度的约15倍(相对激励光的共焦点长度为3.9微米)。在得到的信号强度为最高强度的1/2以上的区域中，ΔL为从激励光的共焦点长度的4倍到27倍。
在作为面向上述带流路板状部件20的流路204的位置、夹持带流路板状部件20并面对棒状透镜10的位置上，配置激励光与检测光分离、仅使检测光选择透过的波长过滤器116及检测透过该波长过滤器116的检测光的光电变换器117。在光电变换器117之前也可插入仅使检测光的部分透过的针孔。由光电变换器117得到、由前置放大器121放大的信号被发送到锁定放大器122，与截光器112同步，之后，由计算机123进行分析。
根据本发明的实施形态，由于棒状透镜10具有使用的激励光及检测光的波长及适于测定用的带流路板状部件20的流路204的尺寸等的色差量，所以可高灵敏度测定，同时，不必在外部设置调整激励光或检测光的焦点位置的光学系统，所以可小型化装置。
产业上的可利用性如上详细所述，根据本发明，激励光与检测光的频率不同，聚光透镜中检测光的焦点位置偏离激励光的焦点位置的长度为激励光的频率下共焦点长度的2倍以上30倍以下，所以提供足够的信号强度，结果，可高灵敏度测定。
在本发明中，激励光与检测光的频率不同，聚光透镜中检测光的焦点位置偏离激励光的焦点位置的长度为激励光的频率下共焦点长度的2倍以上25倍以下，所以信号强度更大，结果，可更高灵敏度测定。
在本发明中，因为聚光透镜是棒状透镜，所以可省略调整激励光及检测光的焦点位置用的光学系统，因此可小型化装置。
权利要求
1.一种光热变换分光分析方法，具有聚光照射工序，由聚光透镜将激励光与检测光聚光照射到试件上；和测定工序，测定透过所述激励光的聚光照射生成的热透镜的检测光的偏向所伴随的强度变化，其特征在于所述聚光照射工序中聚光照射的所述激励光与所述检测光的频率不同，所述聚光透镜中，所述检测光的焦点位置偏离所述激励光的焦点位置的长度是所述激励光的频率下共焦点长度的2倍以上、30倍以下。
2.一种光热变换分光分析方法，具有聚光照射工序，由聚光透镜将激励光与检测光聚光照射到试件上；和测定工序，测定透过所述激励光的聚光照射生成的热透镜的检测光的偏向所伴随的强度变化，其特征在于所述聚光照射的激励光与检测光的频率不同，所述聚光透镜中，所述检测光的焦点位置偏离所述激励光的焦点位置的长度是所述激励光的频率下共焦点长度的2倍以上、25倍以下。
3.根据权利要求1或2所述的光热变换分光分析方法，其特征在于所述聚光透镜是棒状透镜。
4.一种光热变换分光分析装置，具备聚光透镜，将激励光与检测光聚光照射到试件上；和测定部件，测定透过所述激励光的聚光照射生成的热透镜的检测光的偏向所伴随的强度变化，其特征在于所述聚光照射的激励光与检测光的频率不同，所述聚光透镜中，所述检测光的焦点位置偏离所述激励光的焦点位置的长度是所述激励光的频率下共焦点长度的2倍以上、30倍以下。
5.一种光热变换分光分析装置，具备聚光透镜，将激励光与检测光聚光照射到试件上；和测定部件，测定透过所述激励光的聚光照射生成的热透镜的检测光的偏向所伴随的强度变化，其特征在于所述聚光照射的激励光与所述检测光的频率不同，所述聚光透镜中，所述检测光的焦点位置偏离所述激励光的焦点位置的长度是所述激励光的频率下共焦点长度的2倍以上、25倍以下。
6.根据权利要求4或5所述的光热变换分光分析装置，其特征在于所述聚光透镜是棒状透镜。
全文摘要
本发明提供一种可进行高灵敏度测定的光热变换分光分析方法及执行该方法的光热变换分光分析装置，光热变换分光分析装置包括在从激励光用光源(111)的激励光的光路上配置在激励光用光源(111)附近的截光器(112)、改变激励光的行进方向的反射镜(114)、入射来自检测光用光源(120)的检测光、使激励光与检测光变为同轴的分色镜(113)、具有适当色差的透镜(10)、将该透镜(10)调整到3轴进行保持的保持部(15)。
文档编号G01N25/16GK1516809SQ0281203
公开日2004年7月28日 申请日期2002年6月7日 优先权日2001年6月13日
发明者山口淳, 服部明彦, 北森武彦, 渡庆次学, 学, 彦 申请人:日本板硝子株式会社, 财团法人神奈川科学技术研究院