检测方法、微阵列的分析方法及荧光读取装置的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及检测微阵列的表面的凹凸形状的高度的差异的检测方法、微阵列的分 析方法W及巧光读取装置。
【背景技术】
[0002] 1990年W来，在生物学、医学、药学方面被称为微阵列的技术的开发进展，逐渐被 利用。微阵列在玻璃、塑料等基板上固定有数十~数万探针，将被巧光分子等标记了的样品 (祀）应用于该基板，W巧光等检测探针与样品的结合反应。微阵列能够一次进行网罗性测 定，今后期待成为定制医疗所需。
[000引 W主，已知将DNA作为探针而固定于基板的DNA微阵列（W下，DNA巧片）、将蛋白 质作为探针而固定于基板的蛋白质微阵列、将多个微小标本作为探针而固定化于基板的组 织微阵列、将多个低分子化合物作为探针固定化于基板的化合物微阵列等。
[0004] 其中，DNA巧片的实用化最发展，与疾病相关的基因的探索、使用该基因进行检查、 诊断的研究活跃地进行，一部分已实用化。
[000引 W下对作为微阵列的一方式的DNA巧片，进行详细地说明。
[0006] DNA巧片在由玻璃、树脂等构成的基板上网格状地点样（固定化）有DNA。在DNA 巧片上，作为能够与被标记的DNA样品特异性反应的探针，点样有单链的DNA值NA探针）。另 外，DNA探针使用序列已知的探针。另一方面，对于应当分析的未知序列的DNA样品（单链 DNA)，预先附上能够进行光学检测的发光或巧光标记。该样一来，在将应当分析的未知序列 的DNA样品注入至DNA巧片上的情况下，如果该DNA样品的序列与DM探针的序列存在互 补关系，则DNA探针与DNA样品结合而成为双链的DNA。因此，如果将未与DNA探针结合的 DNA样品全部洗掉，使残存于DNA巧片上的想要判定的DNA样品发光，通过读取装置（扫描 仪）来读取该发光，则能够作为图像来观察成为了双链的DNA的状况。目P，通过分析在DNA 巧片上发光的标记的分布，可W分析所寻求的基因的存在、是否表达某基因、或W何种程度 表达某基因。该样，通过在DNA巧片上构成具有已知序列的DNA探针组，将各自不同的序列 的DNA探针搭载于DNA巧片上，从而可W检测基因的变异、基因的表达量等。
[0007] W下，图13中示出DNA巧片分析的一系列处理工序的详细内容。
[000引在图13所示的前处理工序中，将从检体提取的DNA样品中所包含的未知的DNA扩 增，对该些DNA附与巧光标记（例如，切3、切5等）（步骤S201)。
[0009] 接下来在杂交工序中，在搭载有多种DNA探针的DNA巧片的基板上，滴加附与了巧 光标记的DNA样品。该里，如果DNA样品与被点样了的DNA探针存在互补关系，则结合而成 为双链（步骤S202)。
[0010] 接下来，在洗漆工序中，利用规定的洗漆液，将被杂交了的DNA巧片进行洗漆（步 骤S203)。由此，未与网格状地配置的DNA探针结合的DNA样品全部被洗掉。
[001U接着，对洗漆后的DNA巧片照射光进行扫描（步骤S204)。在扫描工序中，将适于 激发巧光标记的波长的激光照射至DNA巧片，取得来自与各DNA探针分别结合了（杂交了） 的DM样品的巧光作为电信号。由此，可W测定对与被点样了的各DM探针（基因）结合 了的DNA样品附与的巧光标记的发光量，基于此进行分析处理，获得巧光图像数据。
[0012]在分析工序中，对于所得的巧光图像数据，利用模板来算出各点的巧光强度，执行 各种分析（步骤S205)。
[001引该里，图14显示DNA巧片分析所使用的DNA巧片100的一例。图14所示的DNA巧片100形成具有凹凸形状的矩形板状。DNA巧片100具有板面被分割成格子状的多个块 101。在该块101的上面形成有多个点102,所述多个点102形成大致圆柱状或平截头台状 地进行设置，固定多个与各个基因对应的DNA探针，在行方向和列方向上W规定数、矩阵状 地排列。此外，多个块101形成于棱柱状地凹陷而成的凹部103的底部。另外，点102上所 配置的DNA探针分别对应于已经破译了其碱基序列的彼此不同的基因，块101上的其配置 位置已预先确定。
[0014] 此外，图15显示对于DNA巧片的巧光图像数据适用的模板的一例。如图15所示， 模板分割成多个（例如，在图15中为32个）块（与块101对应），在各块内设置有m行n 列（在图15中为22X22)的配置成矩阵状的检测区域（与DM巧片100的各个点102对 应）。
[0015] 在上述分析工序中，对读取到的DNA巧片的巧光图像数据中的各个点102,拟合 (对准）分析工具所提供的模板的检测区域，算出在该检测区域中各点102的巧光强度。此 时，为了执行准确的分析，需要准确地执行对准处理，对图像上的各个点102正确地设定模 板的各个检测区域。
[0016] 作为该对准的方法，有W块单元进行对准的图案匹配法、投影法等。而且，也可如 专利文献1所公开的技术那样，尝试使用点样有被称为阳性对照的巧光物质、任何检体中 都包含的持家基因的巧片，准确地进行对准。
[0017] 进一步，还考察了如专利文献2所公开的技术那样，W来自基板的反射光、散射光 将凹凸形状图像化，由该图像进行对准的方法。
[0018] 现有技术文献
[0019] 专利文献
[0020] 专利文献1 ;日本特开2005-172840号公报
[0021] 专利文献2 ;日本特开2005-24532号公报
【发明内容】
[0022] 发明所要解决的课题
[002引然而，W块单元进行对准的典型的图案匹配法、投影法中，都是杂交了的样品DNA的量多，如果各块101中发出充分强度的巧光的点102不存在1/4至半数左右，则不能正确 地对准。因此，在由检体提取的样品中所包含的DNA量少的情况下，有时不能正常地进行对 准。
[0024] 另一方面，在将巧光物质进行点样来配置的方法中，虽然有即使发出充分强度的 巧光的点少也可进行对准该样的优点，但有可在点102上配置的DNA数减少，巧片制造时的 成本上升等问题。此外，在将巧光物质进行点样的情况下，在杂交中它们游离，会将阳性对 照的周边污染，有可能得不到数据。
[0025] 本发明是鉴于上述情况而提出的，其目的在于提供能够取得准确地检测基板的高 度的差异的图像的检测方法、微阵列的分析方法W及巧光读取装置。
[0026] 用于解决课题的方法
[0027] 为了解决上述课题，实现目的，本发明所设及的检测方法的特征在于，是将通过透 镜而被聚光后的激光照射于具有凹凸形状的基板，取得来自该基板的反射光和/或散射光 的光强度作为图像数据，检测上述凹凸形状的高度的差异的检测方法，在与上述透镜的焦 点位置相比靠近上述透镜的位置配置上述基板的光照射面，接收来自该光照射面的反射光 和/或散射光作为检测光，基于该接收到的光的强度的变化，检测上述基板的高度的差异。 [002引此外，本发明所设及的检测方法的特征在于，在上述发明中，使用在将上述基板的 光照射面配置于上述焦点位置的情况下，将来自该光照射面的正反射光从上述检测光中分 离的光学系统，进行上述基板的高度的检