专利名称：以斑点部位亢进基因群为指标而预知皮肤斑点形成的方法、筛选皮肤斑点形成抑制物的方法
技术领域：
本发明涉及以预知皮肤斑点形成为目的的皮肤检查方法。
背景技术：
由于紫外线或激素的不平衡、精神紧张等引起黑素细胞(色素形成细胞)内酪氨酸酶的功能异常活化，从而黑色素连续不断地产生并递送至周围的表皮细胞。据认为当黑色素的产生速率加快，或者由于紫外线等的影响使得更新变得不正常时，黑色素不向外排出并残留在肌肤中，结果在肌肤中形成斑点。
如果产生了斑点，优选地尽可能尽早保养，为此最好由美容工作者通过视感(视觉)对斑点进行官能评价、使用皮肤状态的摄像装置、测色计等仪器对斑点进行定量评价，从而早期判定斑点的有无。
一旦产生了斑点，将其除去并非易事，因此有必要进行使肌肤的新陈代谢良好并尽早排出不需要的黑色素，不再产生多余的黑色素等的保养。因此，优选地在形成斑点前进行肌肤的保养。但是，是否容易形成斑点存在个体差异，并且成为其原因的条件也多种多样，因此一般来讲预知可形成斑点是困难的。由此可见，如果存在能预知斑点形成前是否处于易形成斑点的状态的方法，这作为斑点预防对策是非常有用的。
发明的公开本发明人鉴于上述问题，深入研究了可提供能预知肌肤斑点形成前肌肤是否处于易形成斑点的状态的方法。而且，本发明人将使用紫外线照射后停止照射、并在日晒样显色脱色后不久形成老年性色素斑样的斑点状色素斑的斑点模型小鼠(M.Naganuma等人，Journal of Dermatological Science25(2001)29-35)的斑点部位及非斑点部位分别的来自表皮的RNA进行微阵列分析，将其结果与未用紫外线照射且不形成斑点状色素斑的非斑点部位比较，发现在斑点部位的表皮存在以下基因表达的特异性亢进。因此，明确了通过对人的表皮研究以下基因的表达，可判断易形成斑点的皮肤。
(1)AK012157基因(序列号1)该基因为一仅已知其碱基序列，但尚无其功能的相关报道的基因(Meth.Enzymol.303，19-44(1999))。对大鼠中与该基因约80％同源的基因(S74257；序列号3)存在其与癌的侵润和转移相关的报道(Oncogene，1994，9(12)，3591-3600)，但尚无该基因与皮肤色素相关的报道。进一步地，已知人存在与小鼠AK012157基因约70％同源的基因(人FLJ21763基因(序列号2))，但尚无该基因与皮肤色素相关的报道。
(2)MCP-2(Monocyte Chemoattracting Protein 2，单核细胞趋化蛋白2)MCP-2为趋化因子(分子量约1万的小型细胞因子家族)中的一种，在该家族中MCP-1据报道为通过吸引单核细胞而使非肿瘤形成性的黑素瘤细胞形成肿瘤(Journal Immunol.，6月1日；166(11)6483-6490)，但尚无皮肤色素的相关报道。
(3)由于干扰素而致表达亢进的已知基因群(下文中有时称为“基因群1”)a)趋化因子体系Mcp9(小的可诱导的细胞因子B亚家族(Cys-X-Cys)，成员9)[ArthritisRheum.2002年10月；46(10)2730-41]；Mcp10(小的可诱导的细胞因子B亚家族(Cys-X-Cys)，成员10)[JImmunol.2002年4月1日；168(7)3195-204]；b)信号传递体系Isg15(干扰素刺激的蛋白(15kDa)isg15(遍在蛋白样))[Genes Dev，2003年2月15日；17(4)455-460]；Usp18(遍在蛋白特异的蛋白酶18)[J.Biol.Chem.，2002年3月22日；277(12)9976-9981]；c)抗病毒体系Oas12(2’-5’寡腺苷酸合酶样OASL2(IFN诱导的))[J.InterferonCytokine Res.，2002年9月；22(9)981-993]；Gbp2(IFN诱导的鸟苷酸结合蛋白2 gbp2(抗病毒))[J.InterferonCytokine Res.，1998年11月；18(11)977-985]；Gtpi(GTPase；干扰素-g诱导的GTPase(19440))Ifi47(干扰素γ可诱导的蛋白，47kDa(GTP结合基序)[J Immunol.1992年5月15日；148(10)3275-81]；Igtp(GTPase；干扰素γ诱导的GTPase igtp)[Infect Immun.2002年12月；70(12)6933-9]；Tgtp(GTPase；T细胞特异的GTPase(干扰素γ))[J.Leukoc.Biol.，1995年3月；57(3)477-83]；由于干扰素而致表达亢进的基因的启动子区存在干扰素反应性元件，通过磷酸化而活化的STAT-1(信号传导蛋白和转录激活物)与所述元件结合而使这些基因的表达亢进(Free Radical Biology & Medicine，2000；28(9)1430-1437，Exp Dermatol 1999；896-108)。因此，上述基因群(1)也称为在通过磷酸化而活化的磷酸化STAT-1存在下表达亢进的基因群。而且，实际上如图6所示，本文显示在斑点部位也存在磷酸化STAT-1的高表达。
(4)功能已知的其它基因群(下文中有时称为“基因群2”)a)角蛋白体系Sprr2A(小的富含脯氨酸的蛋白2A)[Mamm.Genome，2003；14(2)140-148]Krt2-6b(角蛋白复合体2，碱性，基因6a)[Genomics，1998；53(2)170-183]
b)细胞周期体系Cdk5rap2(CKK5调节亚单位相关蛋白2)[Neuron.2003年4月10日；38(1)33-46]；Mef2C(肌细胞增强子因子2C)[Brain Res Mol Brain Res.，2001年12月16日；97(1)70-82]；c)氧化还原体系Gsta4(谷胱甘肽S转移酶，α4)[J.Biol.Chem.，2002年5月17日；277(20)17892-17900]；d)骨体系Osf2(成骨细胞特异的因子(fascilin I-like))[Protein Expr Purif.，1995年6月；6(39)305-311]；e)细胞外基质(ECM)体系Tnc(肌腱蛋白C)[Matrix Biol.，2000年12月；19(7)581-596]；f)胰岛素体系Igfbp6(胰岛素样生长因子结合蛋白6)[Mol.Cell.Endocrinol.，1994；104(1)57-66]；g)环孢菌素体系Ppicap(肽基脯氨酸异构酶C(亲环素C)-相关蛋白)[Proc.Natl AcadSci USA，1993年7月15日；90(14)6815-9]；MCP-6(肥大细胞蛋白酶6)[J.Biol.Chem.，1991年2月25日；266(6)3847-3853]。
(5)功能未知的基因群(下文中有时称为“基因群3”)Mm.74656基因(GenBank AccAA519023)对上述基因群(3)中的任一基因均无与皮肤色素相关的报道。因此，这些基因的表达亢进与斑点相关是非常令人吃惊的。
第一方面，本发明提供了以预知皮肤斑点形成为目的的皮肤检查方法。所述方法的特征在于当将表皮中MCP2的表达与正常表皮中的表达比较存在亢进时，判断为易形成斑点的皮肤。
在合适的实施方案中，上述皮肤斑点形成源于UVB照射。
在更合适的实施方案中，上述表皮中MCP2的表达亢进是通过测定表皮中MCP2的量确定的。
在更合适的实施方案中，上述测定是利用MCP2的特异性抗体通过ELISA法或RIA法进行的。
在更合适的实施方案中，上述表皮中MCP2的表达亢进是通过测定自表皮提取的编码MCP2的mRNA的量确定的。
在更合适的实施方案中，上述mRNA的测定是通过聚合酶链反应进行的。
第二方面，本发明提供了筛选皮肤斑点形成抑制因子和/或皮肤斑点除去因子的方法。所述方法的特征在于对候选化合物评价其对MCP2的表达和/或活性的阻碍能力，并将具有该阻碍能力的MCP2抑制物选定为皮肤斑点形成抑制因子和/或皮肤斑点除去因子。
在合适的实施方案中，该方法进一步包括将具有上述阻碍能力的MCP2抑制物应用至斑点形成模型动物，选定具有抑制皮肤斑点形成和/或除去皮肤斑点的效果的抑制物。
第三方面，本发明提供了其它的预知皮肤斑点形成的皮肤检查方法。该方法的特征在于表皮中由序列号2所示的碱基序列组成的多核苷酸(人FLJ21763基因)或其中至少50个，优选地至少100个，更优选地至少200个，特别优选地至少400个的连续核苷酸序列组成的多核苷酸的表达、或者与表皮中由序列号2所示的碱基序列组成的多核苷酸(人FLJ21763基因)、由序列号1所示的碱基序列组成的多核苷酸(小鼠AK012157基因)或序列号3所示的碱基序列组成的多核苷酸(大鼠S74257基因)或它们中至少50个，优选地至少100个，更优选地至少200个，特别优选地至少400个的连续核苷酸序列组成的多核苷酸在高严格条件下可杂交的多核苷酸的表达与正常表皮中的表达相比亢进时，判断为易形成斑点的皮肤。人FLJ21763基因和大鼠S74257基因为对小鼠AK012157基因显示高同源性的基因(分别约70％和约80％)。小鼠AK012157基因、人FLJ21763基因和大鼠S74257基因的比对如
图1至2所示。杂交为已知的方法，或是根据已知方法的方法，如按照J.Sambrook等人在Molecular Cloning 2nd(Cold Spring Harbor Lab.Press，1989)一书中所述的方法进行，此外高严格杂交条件包括例如钠离子浓度为约10至40mM，优选地约20mM，温度为约50至70℃，优选地约60至65℃的条件。
在合适的实施方案中，上述皮肤斑点形成源于UVB照射。
在进一步合适的实施方案中，上述表皮中所述多核苷酸表达的亢进是通过测定自表皮提取的与所述多核苷酸互补的mRNA的量确定的。
在进一步合适的实施方案中，上述mRNA的测定是通过聚合酶链反应进行的。
第四方面，本发明提供了其它的筛选皮肤斑点形成抑制因子和/或皮肤斑点除去因子的方法。所述方法的特征在于对候选化合物评价其对表皮中由序列号2所示的碱基序列组成的多核苷酸(人FLJ21763基因)或其中至少50个，优选地至少100个，更优选地至少200个，特别优选地至少400个的连续核苷酸序列组成的多核苷酸的表达、或者与表皮中由序列号2所示的碱基序列组成的多核苷酸(人FLJ21763基因)、由序列号1所示的碱基序列组成的多核苷酸(小鼠AK012157基因)或序列号3所示的碱基序列组成的多核苷酸(大鼠S74257基因)或它们中至少50个，优选地至少100个，更优选地至少200个，特别优选地至少400个的连续核苷酸序列组成的多核苷酸在高严格条件下可杂交的多核苷酸的表达的阻碍能力，并将具有该阻碍能力的抑制物选定为皮肤斑点形成抑制因子和/或皮肤斑点除去因子。
在合适的实施方案中，该方法进一步包括将具有上述阻碍能力的抑制物应用至斑点形成模型动物，选定具有抑制皮肤斑点形成和/或除去皮肤斑点的效果的抑制物。
第五方面，本发明进一步提供了其它的预知皮肤斑点形成的皮肤检查方法。该方法的特征在于在磷酸化STAT-1(信号传导蛋白和转录激活物)及干扰素存在下使其表达亢进的表皮中基因的表达与正常表皮中的表达相比亢进时，判断为易形成斑点的皮肤。在此处，斑点是指皮肤上出现的茶褐色至深褐色的平面状斑纹(广辞苑)。特别地，文中对斑点模型小鼠用文字表示的斑点，主要是指老年性色素斑样的色素斑。
在合适的实施方案中，在磷酸化STAT-1及干扰素存在下，使其表达亢进的表皮中的基因为编码选自由Mcp9、Mcp10、Isg15、Usp18、Oas12、Gbp2、Gtpi、Ifi47、Igtp和Tgtp组成的组中的蛋白质的基因。
第六方面，本发明进一步提供了其它的预知皮肤斑点形成的皮肤检查方法，该方法的特征在于编码选自由Sprr2A、Krt2-6b、Cdk5rap2、Mef2C、Gsta4、Osf2、Tnc、Igfbp6和Ppicap组成的组中的蛋白质的基因的表达与正常表皮中的表达相比亢进时，判断为易形成斑点的皮肤。
第七方面，本发明进一步提供了其它的预知皮肤斑点形成的皮肤检查方法，该方法的特征在于MCP-6(肥大细胞蛋白酶6)蛋白质的表达与正常表皮中的表达相比亢进时，判断为易形成斑点的皮肤。
合适地，上述皮肤斑点形成源于UVB照射。
在合适的实施方案中，上述表皮中的基因的表达亢进是通过测定表皮中上述蛋白质的量确定的。
进一步合适地，上述测定是利用上述蛋白质特异的抗体通过ELISA法或RIA法进行的。
在其它合适的实施方案中，上述表皮中所述基因的表达亢进是通过测定自表皮提取的编码所述蛋白质的mRNA的量确定的。优选地，上述mRNA的测定是通过聚合酶链反应进行的。
第八方面，本发明进一步提供了其它的筛选皮肤斑点形成抑制因子和/或皮肤斑点除去因子的方法，所述方法的特征在于对候选化合物评价其对上述基因的表达和/或作为基因产物的蛋白质的活性的阻碍能力，并将具有该阻碍能力的抑制物选定为皮肤斑点形成抑制因子和/或皮肤斑点除去因子。
在合适的实施方案中，该方法进一步包括将具有上述阻碍能力的抑制物应用至斑点形成模型动物，选定具有抑制皮肤斑点形成和/或除去皮肤斑点的效果的抑制物。
第九方面，本发明进一步提供了其它的预知皮肤斑点形成的皮肤检查方法，该方法的特征在于与表皮中由序列号1所示的碱基序列组成的多核苷酸(Mm.74656)在高严格条件下可杂交的多核苷酸的表达与正常表皮中的表达相比亢进时，判断为易形成斑点的皮肤。
合适地，上述皮肤斑点形成源于UVB照射。
在合适的实施方案中，上述表皮中所述多核苷酸的表达亢进是通过测定自表皮提取的与所述多核苷酸互补的mRNA的量确定的。
在进一步合适的实施方案中，上述mRNA的测定是通过聚合酶链反应进行的。
第十方面，本发明进一步提供了其它的筛选皮肤斑点形成抑制因子和/或皮肤斑点除去因子的方法，所述方法的特征在于对候选化合物评价其对与表皮中由序列号1所示的碱基序列组成的多核苷酸(Mm.74656)在高严格条件下可杂交的多核苷酸的表达的阻碍能力，并将具有该阻碍能力的抑制物选定为皮肤斑点形成抑制因子和/或皮肤斑点除去因子。杂交为已知的方法，或是根据已知方法的方法，如按照J.Sambrook等人在Molecular Cloning 2nd(Cold Spring Harbor Lab.Press，1989)一书中所述的方法进行，此外高严格杂交条件包括例如钠离子浓度为约10至40mM，优选地约20mM，温度为约50至70℃，优选地约60至65℃的条件。
通过本发明，提供以预知皮肤斑点形成为目的的皮肤检查方法成为可能。
附图简述图1为对小鼠AK012157基因、人FLJ21763基因和大鼠S74257基因的比对。
图2为图1的继续。
图3为通过PCR显示的斑点模型小鼠的表皮和真皮中AK012157基因和MCP-2基因的表达。
图4为通过原位杂交显示的斑点模型小鼠的表皮中AK012157基因的表达。
图5为通过免疫组织染色显示的斑点模型小鼠的表皮中MCP-2的表达。
图6为通过Western印迹显示的斑点部位和正常部位主要信号蛋白的表达差异。
实施反明的最佳方式如上所述，不存在有关小鼠AK012157基因、与该基因显示高同源性的大鼠S74257基因和人FLJ21763基因、以及上述基因群(1)至(3)与皮肤色素相关联的报告。此外，也不存在小鼠和人MCP-2与皮肤色素相关联的报告。本发明人对经紫外线照射的斑点模型小鼠的斑点部位及非斑点部位分别的来自表皮的RNA进行微阵列分析，将其结果与非斑点部位比较，发现在斑点部位的表皮存在AK012157基因、MCP-2基因及上述基因群(1)至(3)的基因的表达特异性亢进。因此，推断通过以这些基因为指标，这些基因可预知皮肤斑点形成。特别地，在斑点模型小鼠中，AK012157基因、MCP-2基因的表达亢进不仅在UV照射期观察到，终止UV照射后由于UV照射所致表皮的褐色开始脱色的脱色期、进一步地其后开始出现斑点、形成斑点的色素斑形成期也观察到。由于在斑点模型小鼠的表皮中，这些基因的表达在脱色期也亢进，因此对人类而言，以与这些基因同源的基因为指标，即使在斑点形成前的脱色期也可预知将来的斑点形成。
斑点模型小鼠斑点模型小鼠可如M.Naganuma等人所述制备。简而言之，例如将7周龄左右的小鼠在紫外光源(Toshiba FL-SE；UVB)下8周，每周约3次以99mJ/cm2强度的紫外线照射(UV照射期)。遭受UV照射期的期间，观察到皮肤的均一性色素沉着(皮肤的褐色化)。该色素沉着在停止UV照射2周后几乎完全消失(脱色期)。此后，开始出现直径约2mm或以下的小的淡茶色的色素斑(所谓老年性色素斑样的“斑点”)(色素斑出现及形成期)。
以预知皮肤斑点形成为目的的皮肤检查方法本发明提供了以预知皮肤优选地人皮肤的斑点形成为目的的皮肤检查方法。所述方法的特征在于表皮中的MCP-2基因或人FLJ21763基因、或者在高严格条件下与人FLJ21763基因、小鼠AK012157基因或大鼠S74257基因可杂交的多核苷酸、或者选自由表皮中的Mcp9、Mcp10、Isg15、Usp18、Oas12、Gbp2、Gtpi、Ifi47、Igtp、Tgtp、Sprr2A、Krt2-6b、Cdk5rap2、Mef2C、Gsta4、Osf2、Tnc、Igfbp6和Ppicap组成的组中的基因的表达与正常表皮中的表达相比亢进时，判断为易形成斑点的皮肤。作为该评价标准，可为例如表皮中的MCP-2基因或人FLJ21763基因、或者在高严格条件下与人FLJ21763基因、小鼠AK012157基因或大鼠S74257基因可杂交的多核苷酸、或者选自由表皮中的Mcp9、Mcp10、Isg15、Usp18、Oas12、Gbp2、Gtpi、Ifi47、Igtp、Tgtp、Sprr2A、Krt2-6b、Cdk5rap2、Mef2C、Gsta4、Osf2、Tnc、Igfbp6和Ppicap组成的组中的基因的表达与对照表皮中这些基因的表达相比10％或以上、或20％或以上、或30％或以上、或50％或以上、或70％或以上、或100％或以上亢进时，判断为“易形成斑点的皮肤”。应该检查的皮肤为例如易形成斑点的脸、头、胳膊、肢等，另外也可为认为可形成斑点的所有部分的表皮。作为不形成斑点的表皮即对照表皮，为例如同一个体的例如不易暴露于紫外线、比较不易形成斑点的部位的表皮，如腹部、臀部的表皮。
本发明还提供了以预知皮肤优选地人皮肤的斑点形成为目的的皮肤检查方法，所述方法的特征在于在高严格条件下与表皮中的MCP-6或Mm.74656基因可杂交的多核苷酸的表达与正常表皮中的表达相比亢进时，判断为易形成斑点的皮肤。作为该评价标准，可为例如表皮中的上述多核苷酸的表达与对照表皮中这些多核苷酸的表达相比10％或以上、或20％或以上、或30％或以上、或50％或以上、或70％或以上、或100％或以上亢进时，判断为“易形成斑点的皮肤”。
杂交为已知的方法，或是根据已知方法的方法，如按照J.Sambrook等人在Molecular Cloning 2nd(Cold Spring Harbor Lab.Press，1989)一书中所述的方法进行，此外高严格杂交条件包括例如钠离子浓度为约10至40mM，优选地约20mM，温度为约50至70℃，优选地约60至65℃的条件。
表皮中上述基因的亢进是通过例如测定表皮中由所述基因编码的蛋白质的量确定的。例如，表皮中MCP-2表达的亢进是通过例如测定表皮中MCP-2的量确定的。优选地，该测定通过使用对上述蛋白质特异的抗体，应用本领域公知的方法如使用荧光物质、色素、酶等的免疫荧光法、Western印迹法、免疫测定法如ELISA法或RIA法等多种方法实施。此外，可通过自表皮提取RNA，测定编码所述基因的mRNA的量而确定。RNA的提取、其量的测定也是本领域公知的，例如RNA的定量可通过定量聚合酶链反应法(PCR)进行。
在高严格条件下与表皮中的上述基因可杂交的多核苷酸的表达可通过自表皮提取RNA，测定对应于上述多核苷酸的mRNA的量而确定。例如，表皮中的人FLJ21763基因、或者在高严格条件下与人FLJ21763基因、小鼠AK012157基因或大鼠S74257基因可杂交的多核苷酸的表达可通过自表皮提取RNA，测定对应于上述多核苷酸的mRNA的量而确定。mRNA的提取、其量的测定也是本领域公知的，例如RNA的定量可通过定量聚合酶链反应法(PCR)进行。
如上所述，本发明基于这样的发现对经紫外线照射的斑点模型小鼠的斑点部位及非斑点部位分别的来自表皮的RNA进行微阵列分析，将其结果与非斑点部位比较，发现在斑点部位的表皮存在AK012157基因、MCP-2基因及基因群(1)至(3)的基因的表达特异性亢进。因此，推断以对表皮中上述基因的表达和/或作为其基因产物的蛋白质的活性抑制为指标，例如以对表皮中MCP-2基因的表达和/或MCP-2的活性抑制为指标，或以对表皮中人FLJ21763基因的表达抑制为指标，或以对在高严格条件下与人FLJ21763基因、小鼠AK012157基因或大鼠S74257基因可杂交的多核苷酸的表达抑制为指标，可开发抑制皮肤斑点形成和/或除去已形成的斑点的药剂。
因此，本发明提供了包含作为皮肤斑点形成抑制因子和/或皮肤斑点除去因子的阻碍上述基因表达的抑制物的医药或皮肤外用组合物。本发明的组合物可预防皮肤斑点形成或除去斑点。
作为阻碍MCP-2活性的抑制物，例如为特表2001-518296号公报公开的对天然MCP-2的氨基末端氨基酸相应的第1位、第1至2位、第1至3位、第1至4位或第1至5位删除的、具有趋化因子拮抗物活性的氨基末端切除型MCP-2。
另外，MCP-2的抑制物包含MCP-2的因为结合而已知的CCR-1、3或5受体的拮抗物。CCR-3受体的拮抗物例如在特开平11-14782号公报、特表2002-512957号公报、特表2002-512960号公报、特表2002-530374号公报、特表2002-512957号公报、2003-510248号公报公开。
作为其具体的实例，例如为N-{1-(S)-[4-(3，4-二氯苄基)哌嗪-1-基甲基]-2-甲基丙基}-4-甲基苯甲酰胺二盐酸盐；N-{1-(S)-[4-(3，4-二氯苄基)哌嗪-1-基甲基]-2，2-二甲基丙基}-4-甲基苯甲酰胺二盐酸盐；N-{1-(S)-[4-(3，4-二氯苄基)哌啶-1-基甲基]-2-甲基丙基}-4-甲基苯甲酰胺二盐酸盐；N-{1-(R)-[4-(3，4-二氯苄基)哌啶-1-基甲基]-2-甲基丙基}-4-(2-氨基乙基)苯甲酰胺二盐酸盐；N-{1-(R)-[4-(3，4-二氯苄基)哌啶-1-基甲基]-2-甲基丙基}-5-甲基噻吩-2-酰胺盐酸盐；1-{1-(R)-[4-(3，4-二氯苄基)哌嗪-1-基甲基]-2-甲基丙基}-3-(3-甲氧基苯基)尿素；1-{1-(R)-[4-(3，4-二氯苄基)哌啶-1-基甲基]-2-甲基丙基}-3-(3-甲氧基苯基)尿素；(S)-乙基-2-(4-甲基苯磺酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(5-二甲基氨基萘-1-磺酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(萘-2-磺酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(噻吩-2-磺酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(喹啉-8-磺酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(2，4，6-三甲基苯磺酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(4-溴苯磺酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(4-氯苯磺酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(4-甲氧基苯磺酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-甲磺酰氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-[2-(E)-苯乙烯基磺酰氨基]-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(3-三氟甲基苯磺酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(2，5-二氯噻吩-3-磺酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(2-溴苯磺酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-[5-(2-吡啶)噻吩-2-磺酰氨基]-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(1，3-二甲基-5-氯-2-吡唑啉-4-磺酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(4-联苯基磺酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(2-硝基-4-甲氧基苯磺酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(2，5-二氯苯磺酰氨基)-3-[4-(2，5-二氯苯磺酰氧基)苯基]丙酸酯；(S)-乙基-2-(2，4-二氟苯磺酰氨基)-3-[4-(2，4-二氟苯磺酰氧基苯基)]丙酸酯；(S)-乙基-2-(5-二甲基氨基萘-1-磺酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(噻吩-2-磺酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(2，4，6-三甲基苯磺酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(4-溴苯磺酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；
(S)-乙基-2-(4-氯苯磺酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(4-甲氧基苯磺酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-[2-(E)-苯乙烯基磺酰氨基]-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(3-三氟甲基苯磺酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(2，5-二氯噻吩-3-磺酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(2-溴苯磺酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-[5-(2-吡啶)噻吩-2-磺酰氨基]-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(2-硝基-4-甲氧基苯磺酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(2，5-二氯苯磺酰氨基)-3-[4-(2，5-二氯苯磺酰氧基)苯基]丙酸酯；(S)-乙基-2-(2，5-二氯噻吩-3-磺酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(2-溴苯磺酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(2，5-二氯苯磺酰氨基)-3-[4-(2，5-二氯苯磺酰氧基)苯基]丙酸酯；(S)-乙基-2-(1-萘酰氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸酯；(S)-异丙基-2-(1-萘酰氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸酯；(S)-甲基-2-(1-萘酰氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸酯；(S)-苄基-2-(1-萘酰氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(1-萘酰氨基)-3-(4-氯苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-苯甲酰氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S，S)-乙基-2-(2-苄氧基羰基氨基-3-苯基丙酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S，S)-乙基-2-(N-乙酰吡咯烷-2-苯甲酰基氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-环己基氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(3，3-二苯基丙酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(3-苯基丙酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-[2-(2-萘基)乙酰氨基]-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(4-苯基丁酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；
(S)-乙基-2-戊酰基氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-戊酰基氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(4-苯甲酰基苯甲酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(2-呋喃基)氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(1-萘酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(5-羟基二氢茚酮基)氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-胡椒基氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-皮考啉基氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(3-硝基-4-氯苯甲酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(3-羟基-4-硝基苯甲酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(8-喹啉基氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-苯甲酰氨基-3-苯基丙酸酯；(S)-乙基-2-苯甲酰氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-苄基-2-苯甲酰氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-苯甲酰氨基-3-(4-甲氧基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-叔丁基氧基羰基氨基-3-(4-硝基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-叔丁基氧基羰基氨基-3-(4-氨基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-苯甲酰氨基-3-(3，5-二碘-4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-羧基苯甲酰氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-苯甲酰氨基-3-(1-萘基)丙酸酯；(±)-乙基-2-苯甲酰氨基-3-[3-(苯甲酰氧基)苯基]丙酸酯；(±)-乙基-2-苯甲酰氨基-3-(3-羟基苯基)丙酸酯；(R，S)-乙基-2-苯甲酰氨基-3-(2-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-苯甲酰氨基-3-(4-氨基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-苯甲酰氨基-3-(4-硝基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(2-苯基乙酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-苯甲酰氨基-3-(3-吲哚基)丙酸酯；(±)-乙基-2-(苯甲酰氨基)-2-苯基乙酸酯；
(±)-乙基-2-(苯甲酰氨基)-4-苯基丁酸酯；(S)-乙基-2-(1-萘酰氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-苯甲酰氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-环己基氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(1-萘酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-苄基-2-苯甲酰氨基-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-苯甲酰氨基-3-(4-甲氧基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-苯甲酰氨基-3-(1-萘基)丙酸酯；(±)-乙基-2-苯甲酰氨基-3-[3-(苯甲酰氧基)苯基]丙酸酯；(±)-乙基-2-苯甲酰氨基-3-(3-羟基苯基)丙酸酯；(R，S)-乙基-2-苯甲酰氨基-3-(2-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-苯甲酰氨基-3-(4-硝基苯基)丙酸酯；(±)-乙基-2-(苯甲酰氨基)-2-苯基乙酸酯；(±)-乙基-2-(苯甲酰氨基)-4-苯基丁酸酯；(S)-乙基-2-(1-萘酰氨基)-3-(4-硝基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-(1-萘酰氨基)-3-(4-羟基苯基)丙酸酯；(S)-乙基-2-苯甲酰氨基-3-(4-硝基苯基)丙酸酯。
CCR-1受体的拮抗物可列举如专利申请公开WO97/24325；Pfizer，Inc.的WO98/38167；帝人(株)的WO97/44329；万有制药(株)的WO98/04554；Merck&Co.，Inc.的WO98/27815、WO98/25604、WO98/25605、WO98/25617和WO98/31364；LeukoSite，Inc.的WO98/02151和WO99/37617；LeukoSite，Inc.的WO99/37651和WO99/37619；美国专利临时申请第60/021716号说明书(1996年7月12日申请)；美国专利申请第09/146827号说明书和第09/148236号说明书(1998年9月4日申请)；Hesselgesser等人，J.Biol.Chem.273(25)15687-15692(1998)；以及Howard等人，J.Medicinal Chem.41(13)2184-2193(1998)中所述的化合物。
此外，CCR-5受体的拮抗物可列举如特表2002-543186公报中所述的化合物。
本发明的医药或皮肤外用组合物可以例如水溶液、油液、其它溶液、乳液、膏、凝胶、悬液、微囊、粉末、颗粒、胶囊、固形剂等形式应用。采用现有技术已知的方法制备成这些形式后，作为洗剂、乳液剂、膏剂、软膏剂、硬膏剂、外敷软膏剂、气雾剂、水-油2层体系、水-油-粉末3层体系、注射剂、内服剂(锭剂、散剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、糖锭剂等)、坐剂等，可涂布、贴附、喷雾、注射、饮用、插入至体内。所述组合物不特定地限定于作为皮肤斑点形成抑制因子和/或皮肤斑点除去因子的上述抑制物，其基于组合物总量例如以0.001mM～1M，优选地0.01mM～100mM，更优选地0.1mM～10mM的程度含有。
在这些剂型中，洗剂、乳液剂、膏剂、软膏剂、硬膏剂、外敷软膏剂、气雾剂等皮肤外用剂是适合本发明目的的剂型。另外，文中描述的皮肤外用剂包含药品、准药品(软膏剂等)、化妆料[洗脸料、乳液、霜、凝胶、香精(美容液)、美容涂敷剂、面膜等基础化妆品；粉底霜、口红等化装用化妆品]；口腔化妆品；芳香化妆品；毛发化妆品；身体化妆品]。特别地，本发明的医药或皮肤外用组合物合适于作为斑点预防的化妆料应用。
在本发明的医药或皮肤外用组合物中，根据目的剂型可合适地配伍以现有技术公知的赋形剂或香料等为首的油脂类、表面活性剂、防腐剂、金属离子螯合剂、水溶性高分子、增稠剂、颜料等粉末成分、紫外线防御剂、保湿剂、抗氧化剂、pH调节剂、洗涤剂、干燥剂、乳化剂等。进一步地，对于将其它药效成分配伍至本发明的医药或皮肤外用组合物中时，可在所述配伍不损害目的效果的范围内实施。
本发明进一步提供了筛选皮肤斑点形成抑制因子和/或皮肤斑点除去因子的方法。所述方法的特征在于对候选化合物评价其对表皮中的上述基因如MCP-2的表达和/或活性的抑制能力、或评价其对与人FLJ21763基因、小鼠AK012157基因或大鼠S74257基因在高严格条件下可杂交的多核苷酸的表达的抑制能力，并将具有该阻碍能力的抑制物选定为皮肤斑点形成抑制因子和/或皮肤斑点除去因子。
在合适的实施方案中，上述筛选方法进一步包括将具有上述阻碍能力的抑制物应用至斑点模型动物，选定具有抑制皮肤斑点形成和/或除去皮肤斑点的效果的抑制物。
确认上述抑制物的皮肤斑点形成抑制和/或皮肤斑点除去的效果的操作可利用将抑制物应用至斑点模型动物如斑点模型小鼠而实施。作为动物，除了小鼠，还可利用大鼠、兔子等多种动物。在合适的实施方案中，通过制备所述抑制物的溶液如水溶液，然后反复涂布至皮肤斑点模型动物的皮肤，评估斑点的形成，可判定有无上述效果。
以下，通过具体的实施例，对本发明进行更具体的说明。此外，本发明不限于这些实施例。
实施例斑点模型小鼠的制备斑点模型小鼠如前述M.Naganuma等人所述制备。简而言之，将7周龄的小鼠在紫外光源(Toshiba FL-SE；UVB)下经过8周、每周约3次以99mJ/cm2强度的紫外线照射(UV照射期)。15至23周龄(UV照射期结束约8周为止)的期间为脱色期，23至35周龄(UV照射期结束约18至30周后)的期间为色素斑出现期，35至52周龄(UV照射期结束约30至47周后)的期间为色素斑形成期。
自皮肤采取RNA采取小鼠背部的皮肤全部层，去除脂肪层，通过加热剥离表皮，使用ISOGEN(日本基因公司，按照厂商推荐的方法)提取RNA，使用RNeasy(Qiagen公司)纯化。将真皮切为1厘米角，于液氮中冷冻粉碎后，使用ISOGEN(日本基因公司，按照厂商推荐的方法)提取RNA，使用RNeasy(Qiagen公司)纯化。通过TBE琼脂糖凝胶电泳、SYBR green(Molecularprobes公司)染色确认RNA的质量和纯度。
UV照射期的样本采取自约10周龄小鼠，该样本的对照样本采取自约14周龄小鼠。脱色期的样本采取自约20周龄小鼠，该样本的对照样本也采取自约20周龄小鼠。色素斑形成期的样本采取自约42周龄小鼠，该样本的对照样本采取自约40周龄小鼠。
微阵列用样品的反应微阵列解析使用Affimetrix公司的基因芯片。
Affimetrix公司的基因芯片用样品的制备根据Affimetrix公司推荐的方法进行反应。将RNA 10μg与寡聚-dT引物(24mer)100pmol(Sigma公司)共同于70℃反应10分钟。然后，加入5X第一链反应缓冲液4μl、0.1M DTT 2μl、10mM dNTP混合物1μl、Superscript II 2μl(均来自Invitrogen公司)，42℃反应1小时。向此反应物中，加入无Rnase的水91μl、5X第二链反应缓冲液30μl、10mM dNTP混合物3μl、10U/μl大肠杆菌(E.coli)DNA连接酶1μl、10U/μl大肠杆菌DNA聚合酶I 4μl、2U/μl RnaseH 1μl(均来自Invitrogen公司)，16℃反应2小时。然后，加入2μl(10U/μl)T4DNA聚合酶(Invitrogen公司)16℃反应5分钟，并加入10μl0.5M EDTA终止反应。使用Phase LockGels(Qiagen公司)清除，用不含Rnase的水12μl溶出。自获得的cDNA通过体外转录制备添加有生物素的cRNA(Enco，Farmingdale)，通过RNeasy(Qiagen公司)纯化。将cRNA于片段化缓冲液中94℃反应35分钟片段后，用于基因芯片杂交。洗净芯片后，使用Affimetrix公司的扫描仪读取数据。
分析结果对约9000种基因表达逐一分析的结果，表明斑点模型小鼠的表皮与对照小鼠的表皮相比较，AK012157基因、MCP-2基因及基因群(1)至(3)的基因的表达显著亢进。引人注意的是，AK012157基因、MCP-2基因的表达亢进不仅在UV照射期观察到，终止UV照射后由于UV照射所致表皮的褐色开始脱色的脱色期、进一步地其后开始出现斑点、形成斑点的色素斑形成期也通常观察到。由于在斑点模型小鼠的表皮中，这些基因的表达在产生斑点前的脱色期也亢进，因此以这些基因为指标，即使在斑点形成前的脱色期也可以预知将来的斑点形成。以下的表1和表2显示了其结果。
表1
(将正常部位或UV非照射部位设定为1时的表达比。UV照射期、脱色期为n＝2的平均值，色素斑形成期为n＝3的平均值。)表2
RT-PCR将自皮肤采取的RNA各(斑点部位、非斑点部位的表皮或真皮)1μg与寡聚-dT引物(24mer)100pmol(Sigma公司)共同于70℃反应10分钟(总体积20μl)。然后，加入5X第一链反应缓冲液4μl、0.1M DTT 2μl、2.5mMdNTP混合物4μl、Superscript II 1μl(均来自Invitrogen公司)，42℃反应1小时。最后70℃反应10分钟延伸，制备cDNA模板。加入rTaq用10X缓冲液5μl、25mM MgCl23μl、2.0mM dNTP混合物5μl、rTaq 0.5μl(均来自TOYOBO公司)、ddH2O 33.5μl、cDNA模板各1μl、有意引物和反义引物(参照以下序列)各20mM 1μl(总体积50μl)，进行PCR反应[94℃2分钟，(94℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟)进行30个循环，72℃10分钟]。
MCP-2引物序列有意TTCTTTGCCTGCTGCTCATA(序列号4)反义GACAAGGATGAGAAAACACG(序列号5)AK012157引物序列有意ACTCCGGCTCCTTCACTATG(序列号6)反义CTTTGGAATGAGGACTTGGA(序列号7)最后在含1.5％溴化乙锭的琼脂糖凝胶中电泳得到约300bp的条带。结果如图3所示，如图3所表明的那样，认为AK012157基因和MCP-2基因在表皮的斑点部位显著表达，在表皮的非斑点部位几乎不表达。此外，在真皮中均无表达差异。
原位杂交(ISH)
将小鼠皮肤组织使用10％中性福尔马林固定，石蜡包埋后，使用常规方法制备组织切片。使用Ventana公司HX系统自动切片处理机，并进行原位杂交反应(方法Japan open blue 8.0)。作为预处理，将组织切片进行封闭、蛋白酶处理后，与使用T7聚合酶自AK012157序列制备的Dig标记的核糖探针500ng于68℃杂交6小时。然后，洗净并与抗Dig-碱性磷酸酶反应并洗净后，使用底物NBT/BCIP显色并包封，用光学显微镜观察。
结果如图4所示。如图4所表明的那样，认为AK012157基因在表皮的斑点部位显著表达，在表皮的非斑点部位几乎不表达。
免疫组织染色(IHC)将小鼠皮肤组织使用中性福尔马林固定，石蜡包埋后，使用常规方法制备组织切片。使用1％H2O2处理15分钟后，封闭30分钟，与1/50稀释的抗小鼠MCP2抗体(R&D Systems)反应1昼夜。将其通过tyramide增感法(TSA体系，Perkin-Elmer公司)使用试剂盒检测。洗净后与连接有HRP的二次抗体反应并洗净，与FITC标记的tyramide反应并洗净、包埋，使用荧光显微镜观察。
比较主要的信号转导系统蛋白质群的表达提取斑点模型小鼠的斑点部位和正常部位的表皮蛋白质，如图6所示，主要的信号蛋白质群的表达量使用Western印迹研究时，磷酸化STAT1尤其在斑点部位/正常部位显示大的表达差异。这个结果与干扰素诱导的基因群(基因群(1))在斑点部位亢进具有整合性。
产业上的可利用性通过本发明，可提供以预知皮肤斑点形成为目的的皮肤检查方法。
序列表<110>株式会社资生堂<120>以斑点部位亢进基因群为指标而预知皮肤斑点形成的方法、筛选皮肤斑点形成抑制剂的方法<130>P871<150>JP 2003-343549<151>2003-10-01<150>JP 2003-344786<151>2003-10-02<160>7<210>1<211>758<212>DNA<213>小鼠<400>1aaaccntttt cgtggcacag cttcctccct aggcgtgaga ctccggctcc ttcactatga60gacttctagc cctttccggt ctgctctgca tgctgctcct ctgtttctgc attttctcct 120cagaagggag aagacatcct gccaagtcct tgaaactcag gcgctgctgt cacctatctc 180ctagatccaa gctgacaacc tggaaaggaa accacacaag gccctgcaga ctctgcagaa 240acaagctacc agtcaagtca tgggtggtgc ctggggctct cccacagata tagggcctcc 300tccgcccaga tgaagcgttg atgcccagat gtggagacac cagaagcata cacactatgt 360tgccttgccc cttgccaatg agctgtgaca ctggaatgct tcacttcaga catcagggcg 420gatggattgc agaattccaa gtcctcattc caaaggtgtc accaaccttc agagtcacta 480aggtccaggc tcagcccaca agtcaccatg gctcctccag agtaaaagtc caagattcca 540cctgtgggag ctacagatcc agagactttc aagctgacta gagtgcagag aagcaagacc 600tcagtgtgat cagccgagac tacagcatct tgggaaccct cagtcagccc caaaccccta 660acacttaacc actggtctcc aaaccaacac ctgtaacttc ctaatgaaat catcaggagg 720ataccaaaag aaataaacca taaatcagca tacacacg 758<210>2<211>2063<212>DNA<213>人(Homo Sapiens)<400>2ctctgcccat tgggaaacac ctctctatga ctctataaat gtccaaggtg gccccaaggg60aggacttctg cagcacagct cccttcccag gacgtgaaaa tctgccttct caccatgagg 120cttctagtcc tttccagcct gctctgtatc ctgcttctct gcttctccat cttctccaca 180gaagggaaga ggcgtcctgc caaggcctgg tcaggcagga gaaccaggct ctgctgccac 240cgagtcccta gccccaactc aacaaacctg aaaggacatc atgtgaggct ctgtaaacca 300tgcaagcttg agccagagcc ccgcctttgg gtggtgcctg gggcactccc acaggtgtag 360
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权利要求
1.以预知皮肤斑点形成为目的的皮肤检查方法，所述方法的特征在于当表皮中的MCP-2(Monocyte Chemoattracting Protein 2，单核细胞趋化蛋白2)的表达与正常表皮中的表达相比较亢进时，判断为易形成斑点的皮肤。
2.权利要求1所述的方法，其中所述皮肤斑点形成的原因为UVB照射。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述表皮中的MCP-2的表达亢进是通过测定表皮中MCP-2的量确定的。
4.权利要求3所述的方法，其中所述测定是利用MCP2特异的抗体通过ELISA法或RIA法进行的。
5.权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中所述表皮中的MCP-2的表达亢进是通过测定自表皮提取的编码MCP2的mRNA的量确定的。
6.权利要求5所述的方法，其中所述mRNA的测定是通过聚合酶链反应进行的。
7.筛选皮肤斑点形成抑制因子和/或皮肤斑点除去因子的方法，所述方法的特征在于对候选化合物评价其对MCP2的表达和/或活性的阻碍能力，并将具有该阻碍能力的MCP2抑制物选定为皮肤斑点形成抑制因子和/或皮肤斑点除去因子。
8.权利要求7所述的方法，其还包括将具有上述阻碍能力的MCP2抑制物应用至斑点形成模型动物，选定具有抑制皮肤斑点形成和/或除去皮肤斑点的效果的抑制物。
9.以预知皮肤斑点形成为目的的皮肤检查方法，该方法的特征在于表皮中由序列号2所示的碱基序列组成的多核苷酸(人FLJ21763基因)或者与该多核苷酸在高严格条件下可杂交的多核苷酸、与表皮中由序列号1所示的碱基序列组成的多核苷酸(小鼠AK012157基因)在高严格条件下可杂交的多核苷酸、或者与表皮中由序列号3所示的碱基序列组成的多核苷酸(大鼠S74257基因)在高严格条件下可杂交的多核苷酸的表达与正常表皮中的表达相比亢进时，判断为易形成斑点的皮肤。
10.权利要求9所述的方法，其中所述皮肤斑点形成的原因为UVB照射。
11.权利要求9或10所述的方法，其中所述表皮中所述多核苷酸表达的亢进是通过测定自表皮提取的与所述多核苷酸互补的mRNA的量确定的。
12.筛选皮肤斑点形成抑制因子和/或皮肤斑点除去因子的方法，所述方法的特征在于对候选化合物评价其对表皮中由序列号2所示的碱基序列组成的多核苷酸(人FLJ21763基因)或者与该多核苷酸在高严格条件下可杂交的多核苷酸、与表皮中由序列号1所示的碱基序列组成的多核苷酸(小鼠AK012157基因)在高严格条件下可杂交的多核苷酸、或者与表皮中由序列号3所示的碱基序列组成的多核苷酸(大鼠S74257基因)在高严格条件下可杂交的多核苷酸的表达的阻碍能力，并将具有该阻碍能力的抑制物选定为皮肤斑点形成抑制因子和/或皮肤斑点除去因子。
13.权利要求12所述的方法，其还包括将具有上述阻碍能力的抑制物应用至斑点形成模型动物，选定具有抑制皮肤斑点形成和/或除去皮肤斑点的效果的抑制物。
14.以预知皮肤斑点形成为目的的皮肤检查方法，该方法的特征在于编码选自由Mcp9(小的可诱导的细胞因子B亚家族(Cys-X-Cys)，成员9)、Mcp10(小的可诱导的细胞因子B亚家族(Cys-X-Cys)，成员10)、Isg15(干扰素刺激的蛋白(15kDa)isg15(遍在蛋白样))、Usp18(遍在蛋白特异的蛋白酶18)、Oas12(2’-5’寡腺苷酸合酶样OASL2(IFN诱导的))、Gbp2(IFN诱导的鸟苷酸结合蛋白2 gbp2(抗病毒))、Gtpi(GTPase；干扰素-g诱导的GTPase(19440))、Ifi47(干扰素γ可诱导的蛋白，47kDa(GTP结合基序))、Igtp(GTPase；干扰素γ诱导的GTPase igtp)和Tgtp(GTPase；T细胞特异的GTPase(干扰素γ))组成的组中的蛋白质的基因的表达与正常表皮中的表达相比亢进时，判断为易形成斑点的皮肤。
15.以预知皮肤斑点形成为目的的皮肤检查方法，该方法的特征在于编码选自由Sprr2A(小的富含脯氨酸的蛋白2A)、Krt2-6b(角蛋白复合体2，碱性，基因6a)、Cdk5rap2(CKK5调节亚单位相关蛋白2)、Mef2C(肌细胞增强子因子2C)、Gsta4(谷胱甘肽S转移酶，α4)、Osf2(成骨细胞特异的因子(fascilin I-like))、Tnc(肌腱蛋白C)、Igfbp6(胰岛素样生长因子结合蛋白6)和Ppicap(肽基脯氨酸异构酶C(亲环素C)-相关蛋白)组成的组中的蛋白质的基因的表达与正常表皮中的表达相比亢进时，判断为易形成斑点的皮肤。
16.以预知皮肤斑点形成为目的的皮肤检查方法，该方法的特征在于MCP-6(肥大细胞蛋白酶6)蛋白质的表达与正常表皮中的表达相比亢进时，判断为易形成斑点的皮肤。
17.权利要求14-16中任意一项所述的方法，其中所述皮肤斑点形成的原因为UVB照射。
18.权利要求14-17中任意一项所述的方法，其中所述表皮中所述基因的表达亢进是通过测定自表皮提取的编码所述蛋白质的mRNA的量确定的。
19.筛选皮肤斑点形成抑制因子和/或皮肤斑点除去因子的方法，所述方法的特征在于对候选化合物评价其对权利要求14-16中任意一项所述的基因的表达和/或所述基因的蛋白质产物的活性的阻碍能力，并将具有该阻碍能力的抑制物选定为皮肤斑点形成抑制因子和/或皮肤斑点除去因子。
20.权利要求19所述的方法，其还包括将具有上述阻碍能力的抑制物应用至斑点形成模型动物，选定具有抑制皮肤斑点形成和/或除去皮肤斑点的效果的抑制物。
21.以预知皮肤斑点形成为目的的皮肤检查方法，该方法的特征在于与表皮中由序列号1所示的碱基序列组成的多核苷酸(Mm.74656)在高严格条件下可杂交的多核苷酸的表达与正常表皮中的表达相比亢进时，判断为易形成斑点的皮肤。
22.权利要求21所述的方法，其中所述皮肤斑点形成的原因为UVB照射。
23.权利要求21或22所述的方法，其中所述表皮中所述多核苷酸的表达亢进是通过测定自表皮提取的与所述多核苷酸互补的mRNA的量确定的。
24.筛选皮肤斑点形成抑制因子和/或皮肤斑点除去因子的方法，所述方法的特征在于对候选化合物评价其对与表皮中由序列号1所示的碱基序列组成的多核苷酸(Mm.74656)在高严格条件下可杂交的多核苷酸的表达的阻碍能力，并将具有该阻碍能力的抑制物选定为皮肤斑点形成抑制因子和/或皮肤斑点除去因子。
25.权利要求24所述的方法，其还包括将具有上述阻碍能力的抑制物应用至斑点形成模型动物，选定具有抑制皮肤斑点形成和/或除去皮肤斑点的效果的抑制物。
全文摘要
本发明提供了以预知皮肤斑点形成为目的的皮肤检查方法，该方法的特征在于表皮中的MCP－2基因、或者与小鼠AK012157基因、人FLJ21763基因或大鼠S74257基因在高严格条件下可杂交的多核苷酸、或者Mcp9、Mcp10、Isg15、Usp18、Oas12、Gbp2、Gtpi、Ifi47、Igtp、Tgtp、Sprr2A、Krt2－6b、Cdk5rap2、Mef2C、Gsta4、Osf2、Tnc、Igfbp6、Ppicap、MCP－6或Mm.74656基因的表达与正常表皮中的表达相比亢进时，判断为易形成斑点的皮肤。
文档编号G01N33/50GK1856709SQ20048002788
公开日2006年11月1日 申请日期2004年9月30日 优先权日2003年10月1日
发明者青木宏文, 儿玉龙彦, 长谷川圣高, 加治屋健太朗, 石松弓子, 尾乡正志, 吉田诚一, 岸本治郎, 茂吕修 申请人:株式会社资生堂