专利名称：将生物分子高密度固定到表面具有活化羧基的固体基质上的方法及用该方法制备的微阵列的制作方法
背景技术：
1.发明领域本发明涉及将生物分子固定到微阵列基质上的方法和利用该方法制备的生物分子微阵列。
2.相关技术的描述术语“微阵列(microarray)”一词是指在预定区域内高密度固定有特异分子的基质。微阵列的例子包括，例如，多核苷酸微阵列和蛋白质微阵列。这种微阵列在本领域中非常熟知，如在美国专利5,445,934和5,744,305中披露的具体例子。通常，微阵列是用光刻(photolithographic)技术来制备。光刻法，在基质的预定区域包覆具有可去除的保护基团的单体，接受能源而从单体上去除保护基团，然后具有可去除的保护基团的第二单体偶联到上述单体上。重复进行接受能源、去除保护基因和偶联单体以获得存在于基质上的预期多核苷酸。可选地，微阵列是利用下述方法来制备，将事先合成的多核苷酸固定到基质的预定区域，如针点法(spotting method)、利用喷墨打印机(inkjetprinter)等的压电打印法(piezoelectric printing method)和微量吸移法(micro-pipetting method)等。这种方法可自由随意排列生物分子，因而具有广泛的应用。
通常，将生物分子固定到如玻璃或塑料等基质表面上是困难的。常规的方法是，为了将事先合成的生物分子固定到固体基质上，需要将基质的表面处理成具有特定功能基团。功能基团的例子包括氨基、醛基、环氧基和酯基。
被建议的方法包括用功能基团包覆固体基质，然后将活化的生物分子固定上去。例如，美国专利5,350,800披露了一种方法，包括将含有羧基的蛋白质如肝素或层粘连蛋白中的羧基用碳二亚胺活化后，将所得产物与包覆有氨基的固体基质反应而固定该产物。美国专利5,760,130披露的方法，包括用磷酸咪唑烷(phosphorimidazolide)活化的多核苷酸固定到包覆有氨基的玻璃基质上。然而，在常规的方法中，由于利用的是包覆氨基的基质，那么需要对生物分子进行活化。
美国专利5,760,130披露一种将多核苷酸固定到包覆有羧基的塑料平板上。在该方法中，例如可利用具有羧基和氨基的″Sumilon″MS-3796F和MS-3696F (可从Sumitomo Bakeliet获得)。然而，由于该方法所用的塑料平板具有羧基，存在的问题是羧基的密度太低。况且，美国专利5,760,130披露的方法意在利用固定在支撑物上的多核苷酸来合成cDNA。因此，不要求测量微阵列中靶生物分子的荧光强度。该专利没有提出引入高密度羧基的需求。因此，本发明人进行了大量研究，通过将生物分子高密度固定到微阵列基质上，以增加对靶生物分子检测的荧光信号强度，并研究出一种通过羧基酐(carboxylic anhydride)将生物分子高密度固定到基质上的方法。
发明概述本发明提供一种利用表面具有活化羧基的基质而高密度将生物分子固定在基质上的方法。
本发明也提供一种由上述方法制备的微阵列。
根据本发明的一个方面，提供一种将生物分子固定到固体基质上的方法，包括用硅烷酐(silane anhydride)包覆固体基质以引入酐功能基基团到固体基质的表面；通过水解从酐功能基团以暴露羧基；将羧基与碳二亚胺和琥珀酰亚胺反应以活化羧基；和将生物分子接触表面具有活化羧基的固体基质以将所述生物分子固定在固体基质上。
根据本发明的另一方面，提供一种将生物分子固定到固体基质上的方法，包括用氨基硅烷包覆固体基质以引入氨基功能基团到固体基质的表面；将氨基功能基团与四羧酸二酐(tetracarboxylic dianhydride)反应以引入酐功能基团到固体基质的表面；
通过水解从酐功能基团暴露出羧基；将羧基与碳二亚胺和琥珀酰亚胺反应以活化羧基；和将生物分子接触表面具有活化羧基的固体基质以将所述生物分子固定在固体基质上。
附图简述本发明的上述及其它方面和优点通过详细描述的实施方式将更清楚，引用了下述附图
图1是根据本发明一个实施方式，在表面具有活化羧基的微阵列基质的制备方法示意图。
图2是根据本发明另一个实施方式，在表面具有活化羧基的微阵列基质的制备方法示意图。
图3A和图3B是微阵列的荧光强度测定结果，分别是其中核酸探针固定到根据本发明的一个示范性实施方式的方法制备的基质上，然后与靶核酸进行杂交的微阵列；和其中用核酸探针固定到常规基质上，然后与靶核酸杂交的微阵列，和图4A至4D是微阵列的荧光强度测定结果，分别是将核酸探针固定到根据本发明的另一个示范性实施方式的方法制备的基质上，然后与靶核酸进行杂交的微阵列；以及将核酸探针固定到常规基质上，然后与靶核酸杂交的微阵列。
发明详述根据本发明的一个实施方式，提供一种将生物分子固定到固体基质上的方法，包括用硅烷酐包覆固体基质以引入酐功能基团到固体基质的表面；通过水解从酐功能基团暴露羧基；将羧基与碳二亚胺和琥珀酰亚胺反应以活化羧基；将生物分子接触表面具有活化羧基的固体基质以将所述生物分子固定在固体基质上。
根据该实施方式的方法，对固体基质没有特别的限制，可以是透明材料或不透明材料。固体基质可以是对环境不产生污染(enviroment-friendly)的材料或对化学物质具有抗性的材料。固体基质的具体实例包括玻璃、硅片、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚酯、聚丙烯酸酯和聚氨基甲酸酯(polyurethane)。
根据该实施方式的方法，硅烷酐可以是式I所代表的化合物 其中R1是亚烷基、亚芳基或烷基亚芳基(alkylarylene)，优选为C1-C20直链或支链亚烷基，更优选为甲基、乙基、丙基或丁基，R’是取代或未取代的C1-C20亚烷基、C1-C20亚芳基、C1-C20亚芳基烷基(arylenealkyl)、C1-C20亚烷基亚芳基(alkylenearylene)，R2是C1-C20烷基、芳基、亚芳基烷基(arylenealkyl)、亚烷基芳基(alkylenearyl)或氢原子，且各自中的R2基团可以相同，也可以彼此不同。更优选地，硅烷酐可以是3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酐，例如它可以从Gelest，Inc.获得。
根据该实施方式的方法，固体基质可用含有0.01至90重量％硅烷酐溶液进行包覆。
此外，用硅烷酐对固体基质的包覆中，固体基质的包覆所用硅烷酐溶液进一步包含由式II和III任一所代表的硅烷化合物 其中R3是C1-C20烷氧基、羟基或卤素，R4是C1-C20直链或支链烷基、芳基、亚芳基烷基或亚烷基芳基或氟化烃功能基团，包括CF3，n是1至15的整数，Si(OR5)4…(III)，其中R5是C1-C20直链或支链烷基、芳基、亚芳基烷基或亚烷基芳基或氢原子。
每100重量份硅烷酐中加入由式II和III任一代表的硅烷化合物的量为0至0.01重量份。
包覆溶液是用合适的溶剂将式I代表的化合物稀释或通过式I代表的化合物与由式II和III任一所代表的硅烷化合物混合制备而成。式I的硅烷酐与式II和III任一所代表的硅烷化合物之间的重量比为0.01∶99.99至100∶0。在包覆溶液中可包含0.01至90重量％的合成硅烷寡聚物。所用的溶剂包括醇溶剂，如甲醇、乙醇、丙醇和丁醇、甲基乙基酮(methylethyl ketone)、二甲基甲酰胺、甲基吡咯烷酮(N-methylpyrrolidone)，或它们的混合物。
根据该实施方式的方法，包覆硅烷酐的方法是本领域熟知的，可选用下述方法来进行浸渍包覆(dip coating)(自组装分子包覆，self-assemblymolecular coating)、旋转包覆(spin coating)、喷雾法和化学汽相淀积法(chemical vapor deposition)。浸渍包覆可在1分钟或更长时间内进行。旋转包覆在300至2,500rpm的转速下进行操作。用这种方法形成的酐包覆层可进一步在约100至300℃下形成三维空间的网状结构。
根据该实施方式的方法，酐的水解在水溶液中于20至100℃下进行。可用酸性或中性溶液于20至100℃下处理酐至少1分钟以进行水解，然后于氮气下进行干燥所得产物。由于水解，从一个酐中获得两个羧基，之后即在基质上产生高密度羧基。因此，在基质上可高密度地形成活化的羧基，进而生物分子可通过化学连接于活化羧基上。例如，在常规方法中，琥珀酐与表面具有氨基的基质发生反应以形成羧基。而根据该实施方式的方法，基质上的羧基密度可达表面具有氨基的常规基质的2倍以上。根据本发明的实施方式获得的基质制备成的微阵列用于分析时，增强了可检测的荧光强度。
根据该实施方式的方法，碳二亚胺可由式IV所代表R6N＝C＝NR7…(IV)，其中R6是烷基或环烷基，R7是烷基氨基或无环烷基氨基。
根据该实施方式的方法，碳二亚胺可以是1-乙基-3-(3-二甲基-氨丙基)碳二亚胺氢氯化物(EDC)或N，N’-双环己基碳二亚胺(DCC)。琥珀酰亚胺可以是N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟磺基琥珀酰亚胺。碳二亚胺或琥珀酰亚胺可在合适溶剂中以浓度为20至200mM用于反应。反应时间可至少为30分钟，但并没有特别的限制。碳二亚胺或琥珀酰亚胺，例如N-羟基琥珀酰亚胺可从Aldrich Chemical Co.，Inc.购买得到。
羧基与碳二亚胺和琥珀酰亚胺之间的反应被认为通过下述机制进行的，但并不局限于此。首先，基质表面上的羧基与碳二亚胺形成不稳定的中间体，即O-乙酰异脲(O-acylisourea)酯键，该中间体可与氨基反应。然后，所获得的键与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或水溶性N-羟磺基琥珀酰亚胺形成更稳定的琥珀酰亚胺酯，因而使基质表面具有活化的羧基。
根据该实施方式的方法，任何具有能与活化酯基化学连接的功能基团的生物分子均可用于固定到基质上，例如氨基。生物分子可以是DNA、RNA、PNA或蛋白质。
当与具有活性功能基团如氨基的生物分子与根据本发明实施方式的表面具有活化羧基的基质进行反应时，生物分子作用于活化羧基的酯键以形成酰胺键，因而生物分子被固定到基质上。这种固定方法的优点是在杂交过程中可大大降低靶材料与基质之间形成非特异性键的数目。
图1图解了根据本发明实施方式的表面具有活化羧基的微阵列基质的制备方法。第一步，用硅烷酐即3-(三乙氧基甲硅)丙基琥珀酐(TSA)(a)包覆固体基质。接着，进行水解反应以获得表面具有羧基的基质(b)，然后将所获得的基质与碳二亚胺，例如1-乙基-3-(3-二甲基-氨丙基)碳二亚胺氢氯化物(EDC)和N，N’-双环己基碳二亚胺(DCC)，以及琥珀酰亚胺，例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-羟磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)反应而获得表面具有活化羧基的基质(c)。
根据本发明的另一实施方式，提供一种生物分子微阵列，其是由上述将生物分子固定在固体基质表面的方法制备而成的。这种生物分子微阵列中，生物分子固定在基质上的斑点区域(spot regions)的排列形式可与常规微阵列一样排列。
将生物分子固定在基质上的方法为本领域熟知的。具体例子包括接触类型的针点(spotting)法、利用如使用喷墨打印机的压电打印法以及微量吸移法等。
根据本发明另一实施方式，提供一种将生物分子固定在固体基质上的方法，包括用氨基硅烷包覆固体基质以引入氨基功能基团到固体基质的表面；将氨基功能基团与四羧酸二酐反应以引入酐功能基团到固体基质的表面；
通过水解从酐功能基团暴露出羧基；将羧基与碳二亚胺和琥珀酰亚胺反应以活化羧基；将生物分子接触表面具有活化羧基的固体基质以将所述生物分子固定在固体基质上。
根据本实施方式的方法，固体基质可用含0.01至90重量％氨基硅烷化合物的溶液进行包覆。
根据本实施方式的方法，氨基硅烷是由式V所示的初级氨基硅烷或由式VI所示的次级氨基硅烷H2N-R8-Si(OR9)3…(V)， 其中R8是亚烷基、亚芳基、芳撑亚烷基、烷撑亚芳基、含醚、酯或亚胺的基团，R9是C1-C20烷基、芳基、亚芳基烷基或亚烷基芳基或氢原子。
R8和R9优选为烷基，更优选为甲基、乙基或丙基或丁基。氨基硅烷的例子包括3-氨基丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷、2-氨基十一烷基三甲氧基硅烷、氨基苯三甲氧基硅烷、双(三甲氧基硅丙基)胺和N-(2-氨乙基氨丙基)三乙氧基硅烷。
在用氨基硅烷对固体基质进行包覆时，首先向由式V或VI所示的至少一种化合物中加入水和醇溶剂，如乙醇和甲醇混合获得氨基硅烷化合物的混合物。其次，将获得的溶液振摇，并对硅烷化合物进行浓缩反应而在溶液中获得水合寡聚体(oligomer hydrate)。用氨基硅烷化合物包覆固体基质，在约200至300℃下烘焙以形成具有三维空间网状结构的包覆层。
此外，在用氨基硅烷对固体基质进行包覆时，用于包覆的氨基硅烷溶液进一步包含由式II和III任一所示的硅烷化合物 其中R3是C1-C20烷氧基、羟基或卤素，R4是C1-C20直链或支链烷基、芳基、亚芳基烷基或亚烷基芳基或氟化烃功能基团，包括CF3，n是1至15的整数，Si(OR5)4…(III)，其中R5是C1-C20直链或支链烷基、芳基、亚芳基烷基或亚烷基芳基或氢原子。
如式II或III所示的硅烷化合物，可以使用的混合物只包含疏水性硅烷化合物以控制氨基层的疏水性或只包含硅烷醇(silane alkoxide)以增加与基质表面的键强度。
每100重量份氨基硅烷中加入由式II和III任一代表的硅烷化合物的量为0.0001至0.01重量份。
根据该实施方式的方法，包覆氨基硅烷的方法是本领域熟知的，可选用下述方法来进行浸渍包覆(自组装分子包覆)、旋转包覆、喷雾法和化学汽相淀积法。
根据本实施方式的方法，四羧酸二酐可由式VII所示 其中R10是四元有机基团，诸如四元碳环芳族、杂环族、脂环族或脂肪族基团。
四羧酸二酐可选自苯均四羧酸二酐、3，3′，4，4′-二苯四羧酸二酐、2，2′，3，3′-二苯四羧酸二酐、2，3，3′，4′-二苯四羧酸二酐、1，2，4，5-苯基四羧酸二酐，3，3′，4，4′-二苯甲酮四羧酸二酐、2，2′，3，3′-二苯甲酮四羧酸二酐、2，3，3′，4′-二苯甲酮四羧酸二酐、双(3，4-联羧基苯)醚二酐、双(3，4-联羧基苯)砜二酐、1，4，5，8-萘四羧酸二酐、1，2，5，6-萘四羧酸二酐、2，3，6，7-萘四羧酸二酐、2，2-双(3，4-联羧基苯)-六氟丙烷二酐、环丁烷四羧酸二酐、甲基环丁烷四羧酸二酐以及1，2，3，4-四羧酸丁烷二酐。
根据本实施方式的方法，四羧酸二酐的反应浓度为0.02至90重量％。四羧酸二酐可溶于至少一种选自下述溶剂的呈溶解状态下反应丙酮、甲基乙基酮、二甲基甲酰胺和N-甲基吡咯烷酮。
基质表面的氨基功能基团与四羧酸二酐之间的反应例如可按下述方式进行，通过浸渍包覆(自组装分子包覆)用四羧酸二酐包覆到氨基基质上以形成单层，然后四羧酸二酐与氨基反应至少10分钟。可通过与氨基进行亲核取代反应而引入这种二酐。反应结束后，被吸收到基质上的四羧酸二酐可用反应溶剂冲冼去除，然后于氮气下干燥。这样，剩余的冲洗溶剂在氮气烤箱中干燥去除。
根据本实施方式的方法，酐的水解在水溶液中于20至100℃下进行。可用酸性或中性溶液于20至100℃下处理酐至少1分钟以进行水解，然后于氮气下进行干燥。由于水解，从一个酐中获得两个羧基，之后即在基质上产生高密度羧基。因此，在基质上可高密度地形成活化的羧基，进而生物分子可与活化羧基成键连接。例如，在常规方法中，琥珀酐与表面具有氨基的基质发生反应以形成羧基。而根据本发明实施方式的方法，基质上的羧基密度可达表面具有氨基的常规基质的2倍以上。根据本发明的实施方式获得的基质制备成的微阵列用于分析时，可检测到更高的荧光强度。
根据本发明实施方式的方法，碳二亚胺可由式IV所代表R6N＝C＝NR7…(IV)，其中R6是烷基或环烷基，R7是烷基氨基或无环烷基氨基。
碳二亚胺可以是1-乙基-3-(3-二甲基-氨丙基)碳二亚胺氢氯化物(EDC)或N，N’-双环己基碳二亚胺(DCC)。
根据本发明实施方式的方法，琥珀酰亚胺可以是N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟磺基琥珀酰亚胺。
根据本实施方式的方法，碳二亚胺或琥珀酰亚胺可在20至200mM的浓度下进行反应。
根据本发明实施方式的方法，任何具有能与活化酯基化学连接的功能基团如氨基的生物分子均可用于固定到基质上。生物分子可以是DNA、RNA、PNA或蛋白质。
图2图示了根据本发明的实施方式制备而成的表面具有活化羧基的微阵列基质的方法。首先，用氨基硅烷包覆基质，例如用γ-氨丙基三乙氧基硅烷(GAPS)，以获得表面具有氨基的基质(a)。然后，将获得的基质与四羧酸二酐，例如1，2，4，5-苯基四羧酸二酐，进行反应以引入二酐到基质上(b)。接着，进行水解反应以获得表面具有羧基的基质(c)，进而将获得的基质与碳二亚胺，例如1-乙基-3-(3-二甲基-氨丙基)碳二亚胺氢氯化物(EDC)和N，N’-双环己基碳二亚胺(DCC)，以及琥珀酰亚胺，例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-羟磺基琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)进行反应，获得表面具有活化羧基的基质(d)。
根据本发明另一实施方式，提供一种利用上述将生物分子固定到固体基质表面的方法制备而成的生物分子微阵列。
将生物分子固定在基质上的方法为本领域熟知的。具体例子包括接触类型的针点(spotting)法、如利用喷墨打印机的压电打印法，以及微量吸移法等。
通过下述实施例来更详细的描述本发明。然而，提供的这些实施例是以说明为目的，对本发明范围没有任何限制。
实施例实施例1将核酸固定到表面具有活化羧基的基质和氨基硅烷包覆的基质。
(1)制备氨基硅烷包覆的基质将γ-氨丙基三乙氧基硅烷(GAPS)溶于乙醇中，得到0.002M GAPS溶液。将所得溶液以浸渍包覆包覆已洗净的片状玻璃基质，然后于120℃处理1小时以获得氨基硅烷包覆的基质。
(2)制备表面具有活化羧基的基质将3-(三乙氧基甲硅)丙基琥珀酐(TSA)溶于乙醇中，得到0.002M TSA溶液。将所得溶液以浸渍包覆包覆已洗净的片状玻璃基质，然后于120℃处理1小时以获得硅烷酐包覆了的基质。
硅烷酐(TSA)包覆的玻璃基质在弱酸性的水中洗涤3分钟，硅烷酐水解产生羧基。然后，将得到的表面具有羧基的玻璃基质分别在包含100mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N，N’-双环己基碳二亚胺(DCC)的DMF溶液中反应1小时，获得表面具有活化羧基的微阵列基质。进而，将所得到的玻璃基质于乙醇中洗涤并保存于氮气容器。
(3)核酸的固定和杂交试验具有SEQ ID No1所示序列的寡核苷酸探针与DMSO混合，并利用spotter分别点样(spot)到上述方法获得的表面具有活化羧基的基质和氨基硅烷包覆的基质上。于37℃、100％RH下固定1小时，然后经过洗涤处理获得固定有探针的微阵列。
对于获得的每一种微阵列，用与上述具有SEQ ID No1所示序列的探针互补的靶核酸进行杂交。在杂交中，靶核酸溶于0.1％SSPET(含0.1％TritonX-100的磷酸钠EDTA缓冲液)，与每一种微阵列于37℃反应14小时。反应之后，每一种微阵列分别用6xSSPET和3xSSPET洗涤5分钟，并于氮气下干燥。GenePix 4000B scannerTM(Axon)对干燥的微阵列进行扫描检测。其结果如图3A和3B所示。在杂交过程中，用氨基硅烷包覆的基质，即氨基基质，还进行了琥珀酐/NMP封闭处理。
如图3A和3B所示，利用根据本发明实施方式的方法制备的表面具有活化羧基的基质用作微阵列，具有更强的荧光强度和更佳的斑点(spot)形态，而在杂交过程中无需封闭处理。图3A显示使用TSA基质的结果，图3B显示使用GAPS基质的结果，其中左侧所用的探针浓度为100μM，而右侧所用的探针浓度为25μM。显示于图3A和3B中的荧光强度测定结果的相应数值如表1所示。
表1
实施例2将核酸固定到表面具有活化羧基的基质、氨基基质、在氨基层上具有活化羧基的基质。
(1)制备表面具有活化羧基的基质将3-(三乙氧基甲硅)丙基琥珀酐(TSA)和1，2-双(三乙氧基甲硅)乙烷溶于乙醇，其溶液中浓度均为0.002M。将所获得的溶液以浸渍包覆包覆已洗净的片状玻璃基质，然后于120℃处理1小时以获得硅烷酐包覆了的基质。
上述酐包覆的玻璃基质在呈弱酸性的水中洗涤3分钟，通过水解自硅烷酐产生羧基。然后，将得到的表面具有羧基的玻璃基质分别于包含100mMN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N，N’-双环己基碳二亚胺(DCC)的DMF溶液中反应1小时，获得表面具有活化羧基的玻璃基质。反应之后，将所得到的玻璃基质于乙醇中洗涤并保存于氮气容器。这样获得的基质称为“TSA基质”。
(2)制备氨基硅烷包覆的基质将3-氨基丙基三甲氧基硅烷和1，2-双(三乙氧基甲硅)乙烷通过搅拌溶于乙醇中，其浓度均为0.002M。将所得溶液以浸渍包覆包覆已洗净的片状玻璃基质，然后于120℃处理1小时以获得氨基硅烷包覆了的基质。这样获得的基质称为“氨基基质”。
(3)制备在氨基层上具有活化羧基的基质将上述氨基基质浸入含0.01M琥珀酐或1，2，4，5-苯基四羧酸二酐的DMF溶液中，反应1小时。反应之后，将每一种所得到的基质用乙醇洗涤，并于氮气容器中干燥。之后，所得的每一种基质在弱酸性的水中洗涤3分钟，硅烷酐水解产生羧基。接着，将得到的表面具有羧基的玻璃基质分别于包含100mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N，N’-双环己基碳二亚胺(DCC)的DMF溶液中反应1小时，以使羧基活化。反应一旦完成，将所得的玻璃基质用乙醇洗涤并保存于氮气容器中。这样获得的基质分别称为“SA(琥珀酐)基质”和“BD(1，2，4，5-苯基四羧酸二酐)基质”。
(4)核酸的固定和杂交试验具有SEQ ID No1所示序列的寡核苷酸探针与DMSO混合，并利用spotter分别点样到上述获得的每一种基质上。于37℃、100％RH下固定1小时，然后经过洗涤处理获得固定有探针的各种微阵列。
对于获得的每一种微阵列，用与上述具有SEQ ID No1所示序列的探针互补的靶核酸分别进行杂交。在杂交中，靶核酸溶于0.1％SSPET(含0.1％Triton X-100的磷酸钠EDTA缓冲液)，与每一种微阵列于37℃反应14小时。反应之后，每一种微阵列分别用6xSSPET和3xSSPET洗涤5分钟，并于氮气下干燥。GenePix 4000B scannerTM(Axon)对干燥的微阵列进行扫描检测。其结果如表2和图4所示。在杂交过程中，对氨基基质，还进行了琥珀酐/NMP封闭处理。
表2
正如表2所示，根据本发明实施方式的方法制备而成的微阵列，斑点(spots)显示了更佳的特性，即更高的荧光强度，且不需要在固定寡核苷酸探针之后的封闭处理(blocking process)。图4A至4D分别显示了称为TSA基质、BD基质、SA基质和氨基基质的微阵列用于杂交的结果。其中斑点(spots)的荧光强度，红色表示较强，蓝色表示较弱。
当使用本发明的实施方式的将生物分子固定到固体基质的方法，从一个酐中获得两个羧基，因而，生物分子可高密度固定于固体基质上。当用本发明的实施方式的高密度固定有生物分子的微阵列用于分分析时，增强了荧光强度。
虽然本发明通过说明性实施例进行了阐明，本领域技术人员可以理解的是，对本发明具体形式和细节进行变化仍然没有偏离所附权利要求限定的本发明精神和范围。
序列表<110>三星电子株式会社(samsung Electronic Co.Ltd.)<120>将生物分子高密度固定到表面具有活化羧基的固体基质上的方法及用该方法制备的微阵列<130>PN052195<160>1<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探针寡核苷酸<400>1caggtgggac tggtt 1权利要求
1.一种将生物分子固定到固体基质上的方法，包括用硅烷酐包覆固体基质以引入酐功能基团到固体基质的表面；通过水解从酐功能基团暴露羧基；将羧基与碳二亚胺和琥珀酰亚胺反应以活化羧基；和将生物分子接触表面具有活化羧基的固体基质以将所述生物分子固定在固体基质上。
2.根据权利要求1的方法，其中固体基质选自玻璃、硅片、聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯、聚酯、聚丙烯酸酯或聚氨基甲酸酯。
3.根据权利要求1的方法，其中所述硅烷酐是式I所示的化合物 其中R1是亚烷基、亚芳基或烷基亚芳基，R’是取代或未取代的C1-C20亚烷基、C1-C20亚芳基、C1-C20亚芳基烷基、C1-C20亚烷基亚芳基，R2是C1-C20烷基、芳基、亚芳基烷基、亚烷基芳基或氢原子，且各自中的R2基团可以相同，也可以彼此不同。
4.根据权利要求3的方法，其中R1是甲基、乙基、丙基或丁基。
5.根据权利要求3的方法，其中硅烷酐是3-(三乙氧基甲硅烷基)丙基琥珀酐。
6.根据权利要求1的方法，其中固体基质用含0.01至90重量％硅烷酐溶液进行包覆。
7.根据权利要求1的方法，其中在用硅烷酐包覆固体基质时，固体基质用硅烷酐溶液包覆，所述硅烷酐溶液进一步包含由式II和III任一所示的硅烷化合物 其中R3是C1-C20烷氧基、羟基或卤素，R4是C1-C20直链或支链烷基、芳基、亚芳基烷基或亚烷基芳基或氟化烃功能基团，包括CF3，n是1至15的整数，Si(OR5)4…(III)，其中R5是C1-C20直链或支链烷基、芳基、亚芳基烷基或亚烷基芳基或氢原子。
8.根据权利要求7的方法，其中基于每100重量份硅烷酐加入由式II和III任一所示的硅烷化合物的量为0至0.01重量份。
9.根据权利要求1的方法，其中用硅烷酐包覆固体基质是通过选自下述方法来进行的自组装分子包覆、旋转包覆、喷雾法或化学汽相淀积法。
10.根据权利要求1的方法，其中水解反应在水溶液中于20至100℃进行。
11.根据权利要求1的方法，其中碳二亚胺由式IV所示R6N＝C＝NR7…(IV)，其中R6是烷基或环烷基，R7是烷基氨基或无环烷基氨基。
12.根据权利要求11的方法，其中碳二亚胺是1-乙基-3-(3-二甲基-氨丙基)碳二亚胺氢氯化物(EDC)或N，N’-双环己基碳二亚胺(DCC)。
13.根据权利要求1的方法，其中琥珀酰亚胺是N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟磺基琥珀酰亚胺。
14.根据权利要求1的方法，其中碳二亚胺或琥珀酰亚胺的反应浓度为20至200mM。
15.根据权利要求1的方法，其中所述生物分子具有氨基。
16.根据权利要求15的方法，其中生物分子是DNA、RNA、PNA或蛋白质。
17.用权利要求1-16任一项方法制备而成的生物分子微阵列。
18.一种将生物分子固定在固体基质上的方法，包括用氨基硅烷包覆固体基质以引入氨基功能基团到固体基质的表面；将氨基功能基团与四羧酸二酐反应以引入酐功能基团到固体基质的表面；通过水解而从酐功能基团暴露出羧基；将羧基与碳二亚胺和琥珀酰亚胺反应以活化羧基；及将生物分子接触表面具有活化羧基的固体基质以将所述生物分子固定在固体基质上。
19.根据权利要求18的方法，其中固体基质用含0.01至90重量％氨基硅烷化合物溶液进行包覆。
20.根据权利要求18的方法，其中氨基硅烷是由式V所示的初级氨基硅烷或由式VI所示的次级氨基硅烷H2N-R8-Si(OR9)3…(V)， 其中R8是亚烷基、亚芳基、亚芳基亚烷基、亚烷基亚芳基、含醚、酯或亚胺的基团，R9是C1-C20烷基、芳基、亚芳基烷基或亚烷基芳基或氢原子。
21.根据权利要求18的方法，其中在用氨基硅烷包覆固体基质时，固体基质的包覆所用氨基硅烷溶液进一步包含由式II和III任一所示的硅烷化合物 其中R3是C1-C20烷氧基、羟基或卤素，R4是C1-C20直链或支链烷基、芳基、亚芳基烷基或亚烷基芳基或氟化烃功能基团，包括CF3，n是1至15的整数，Si(OR5)4…(III)，其中R5是C1-C20直链或支链烷基、芳基、亚芳基烷基或亚烷基芳基或氢原子。
22.根据权利要求21的方法，其中基于每100重量份氨基硅烷式II和III任一所示的硅烷化合物的量为0至0.01重量份。
23.根据权利要求18的方法，用氨基硅烷酐包覆固体基质的方法选自下述方法自组装分子包覆、旋转包覆、喷雾法或化学汽相淀积法。
24.根据权利要求18的方法，其中四羧酸二酐由式VII所示 其中R10是四元有机基团，选自四元碳环芳族(carboncyclic aromatic)、杂环族、脂环族或脂肪族基团。
25.根据权利要求24的方法，其中四羧酸二酐选自苯均四羧酸二酐、3，3′，4，4′-二苯四羧酸二酐、2，2′，3，3′-二苯四羧酸二酐、2，3，3′，4′-二苯四羧酸二酐、1，2，4，5-苯基四羧酸二酐，3，3′，4，4′-二苯甲酮四羧酸二酐、2，2′，3，3′-二苯甲酮四羧酸二酐、2，3，3′，4′-二苯甲酮四羧酸二酐、双(3，4-联羧基苯)醚二酐、双(3，4-联羧基苯)砜二酐、1，4，5，8-萘四羧酸二酐、1，2，5，6-萘四羧酸二酐、2，3，6，7-萘四羧酸二酐、2，2-双(3，4-联羧基苯)-六氟丙烷二酐、环丁烷四羧酸二酐、甲基环丁烷四羧酸二酐或1，2，3，4-四羧酸丁烷二酐。
26.根据权利要求18的方法，其中四羧酸二酐的反应浓度为0.02至90重量％。
27.根据权利要求18的方法，其中四羧酸二酐溶于至少一种选自下述的溶剂中丙酮、甲基乙基酮、二甲基甲酰胺基或N-甲基吡咯烷酮。
28.根据权利要求18的方法，其中酐的水解在水溶液中于20至100℃下进行。
29.根据权利要求18的方法，其中碳二亚胺由式IV所示R6N＝C＝NR7…(IV)，其中R6是烷基或环烷基，R7是烷基氨基或无环烷基氨基。
30.根据权利要求29的方法，其中碳二亚胺是1-乙基-3-(3-二甲基-氨丙基)碳二亚胺氢氯化物(EDC)或N，N’-双环己基碳二亚胺(DCC)。
31.根据权利要求18的方法，其中琥珀酰亚胺是N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟磺基琥珀酰亚胺。
32.根据权利要求18的方法，其中碳二亚胺或琥珀酰亚胺的反应浓度为20至200mM。
33.根据权利要求18的方法，其中生物分子具有氨基。
34.根据权利要求33的方法，其中生物分子是DNA、RNA、PNA或蛋白质。
35.用权利要求18-34任一项方法制备而成的生物分子微阵列。
全文摘要
本发明提供一种将生物分子固定到固体基质上的方法。该方法包括用硅烷酐包覆固体基质以引入酐功能基团到固体基质的表面；通过水解从酐功能基团获得羧基；将羧基与碳二亚胺和琥珀酰亚胺反应以活化羧基；再用生物分子接触表面具有活化羧基的固体基质以将所述生物分子固定在固体基质上。
文档编号G01N33/545GK1661114SQ20051000447
公开日2005年8月31日 申请日期2005年1月12日 优先权日2004年1月12日
发明者黄奎渊 申请人:三星电子株式会社