专利名称：中药材陈皮水提物的指纹图谱测定方法
技术领域：
本发明涉及中药材陈皮的指纹图谱的建立方法，具体地说是中药材陈皮水溶性活性成分HPLC指纹图谱的建立，本发明还涉及由此方法所得到陈皮药材标准指纹图谱。
背景技术：
陈皮(Pericarpium CitriReticulatae)为芸香科植物橘(Citrus reticulata Blanco)及其栽培变种的干燥成熟果皮，具有理气健脾，燥湿化痰作用，临床用于胸脘胀满，食少吐泻，咳嗽痰多等症。陈皮生药中含有挥发油，川陈皮素，辛弗林以及黄酮类成分；黄酮类成分包括橙皮苷，新陈皮苷，柑橘素等成分，其中橙皮苷为主要成分。目前，对陈皮及其复方制剂的质量鉴定，主要以其中一、二个活性成分作为表征药材品质的质控指标，如橙皮苷(崔丽华等，中国药事，2000，14(2)，105～106；黄华轼，江西中医学院学报，2004，16(2)，66)，辛弗林(贾晓斌，南京中医药大学学报，1999，15(1)27～28；洒丽明等，中成药，1997，19(10)，19～20)，川陈皮素(钱士辉等，南京中医药大学学报，1998，14(4)219～220)等活性成分作为检测指标，以HPLC或TLC方式进行检测与鉴别。由于陈皮及其复方制剂的质量控制方法不够全面，难以全面表征它们的物理化学特征，因此，对陈皮的提取精制方法、质量控制方法进行改进，利用现代分析技术表征陈皮药材品质。
陈皮的化学成分中的黄酮类，橙皮苷，辛弗林等是极性成分，属于水溶性成分。目前，对于陈皮的极性部分的药理作用的研究很多，研究表明陈皮的极性部分的药理作用很广，如沈明勤，临床药学，1997，2，32(2)，97～100；徐彭，江西中医学院学报，1998，10(4)，172～173王妹梅等，中国药科大学学报、1998，29(6)，462～464；而要控制陈皮及其成方制剂的功效，只针对其一、二个化学成分是远远不够，必须对它的物质群整体予以控制，从整体上表征陈皮药材品质特性，目前，能够表征陈皮极性部分的整体特性的研究还是一片空白。本发明是对陈皮极性部分进行提取，利用高效液相色谱指纹图谱方式，控制极性部分的整体特性。
中药指纹图谱是运用现代分析技术(光谱、波谱、色谱、核磁共振、X射线衍射及各种技术的联用等)对中药化学信息以图形(图像)的方式进行表征并加以描述。中药是依靠其所含的多种化学成分发挥综合的医疗作用，这是与化学合成药最根本的区别，现在已逐渐得到人们的认同。因此凭借某一种化学成分定性和定量的传统中药质量评价方法的有效性和专属性渐渐受到质疑。中药指纹图谱建立的是全面反映中药所含内在化学成分的种类与数量，进而反映中药的质量，尤其在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确，而采用中药指纹图谱的方式，将有效地表征中药质量。指纹图谱也为国际社会所认可，美国FDA制定的植物草药指南中明确把指纹图谱作为混合物质群的质量控制方法(FDA.Guidance ofIndustryBotanical Drug(Draft).2000August)，采用中药指纹图谱的方式对中药及中成药进行质量控制，有利于中药及其产品进入国际市场。
发明内容
本发明是对陈皮极性部分进行提取，利用高效液相色谱指纹图谱方式，控制极性部分的整体特性。
本发明的目的是通过对陈皮水提取物HPLC指纹图谱的形容，摸索出一种陈皮质量控制的方法，确立建立陈皮的标准指纹图谱的方法，借此可将陈皮指纹图谱作为质量控制及真伪鉴别的指标之一；本发明还同时提供了陈皮的标准指纹图谱，同时用相关系数法计算特征指纹峰的相似度。
为建立陈皮药材质量的综合控制方法，以国家药品监督局2000年颁发的关于中药指纹图谱技术要求，对不同产地和采收时间的陈皮进行测定，建立起陈皮高效液相指纹图谱测定方法。
本发明通过下列步骤实施(a)供试品溶液的制备称取陈皮药材，加水，回流提取，过滤，取滤液过大孔吸附树脂柱，水洗，乙醇或甲醇洗去强极性成分，再用乙醇或甲醇洗脱，收集乙醇或甲醇洗脱液，水浴挥干乙醇或甲醇，移置量瓶中，加水至刻度，即为供试品；(b)色谱条件色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为冰醋酸水溶液，流动相B为甲醇；检测波长335～350nm；(c)测定精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
本发明的优选方案可以是所述(a)中的大孔吸附脂用弱极性与非极性大孔吸附树脂；乙醇为5～15％乙醇或5～15％甲醇洗去强极性成分，再用40％～90％乙醇洗脱，收集40％～90％乙醇或40％～90％甲醇洗脱液；所述(b)中的流动相A为0.5％～7％冰醋酸水溶液。
进一步优选的本发明可以通过下述步骤实施所述步骤(a)中供试品溶液的制备称取过24～80目筛药材陈皮，置平底烧瓶中，加8～80倍量水，加热，回流提取0.5～3h，放冷至30～50℃，真空过滤，药渣中再加入6～60倍量水，提取0.25～2h，同法操作，合并过滤液，量定体积。量取相对生药材0.25～5g的滤液，过AB-8型树脂柱，先用3～4倍柱体积的水洗，再用3～4倍柱体积的5％～15％乙醇或5％～15％甲醇洗，弃去洗脱液，最后用3～4倍柱体积的40％～90％乙醇或甲醇洗脱，收集40％～90％乙醇或40％～90％甲醇洗脱液，水浴挥干乙醇或甲醇，移置2ml～125ml量瓶中，加纯水至刻度，即为供试品样；所述步骤(b)中所述色谱条件检测波长336～348nm；柱温20～40℃；进样量5～100μl。流动相A相为0.5％～7％冰醋酸，B相为甲醇，流速1.0ml/min。
再进一步优选的本发明可以通过下述步骤实施所述步骤(a)中供试品溶液的制备称取过24～80目筛药材陈皮，置平底烧瓶中，加20～75倍量水，加热，回流提取0.6～2.5h，放冷至30～50℃，真空过滤，药渣中再加入15～55倍量水，提取0.3～1.5h，同法操作，合并过滤液，量定体积。量取相对生药材0.75～3g的滤液，过AB-8型树脂柱，先用3～4倍柱体积的水洗，再用3～4倍柱体积的6％～14％乙醇或6％～14％甲醇洗，弃去洗脱液，最后用3～4倍柱体积的50％～85％乙醇或50％～85％甲醇洗脱，收集50％～85％乙醇或50％～85％甲醇洗脱液，水浴挥干乙醇或甲醇，移置5ml～100ml量瓶中，加纯水至刻度，即为供试品样。
所述步骤(b)中所述色谱条件检测波长338～346nm；柱温22～38℃；进样量10～80μl；流动相A相为1％～6.5％冰醋酸，B相为甲醇，流速1.0ml/min。
更进一步优选的本发明可以通过下述步骤实施所述步骤(a)中供试品溶液的制备称取过24～80目筛药材陈皮，置平底烧瓶中，加30～65倍量水，加热，回流提取0.75～2.0h，放冷至30～50℃，真空过滤，药渣中再加入15～55倍量水，提取0.4～1.0h，同法操作，合并过滤液，量定体积。量取相对生药材0.5～2g的滤液，过AB-8型树脂柱，先用3～4倍柱体积的水洗，再用3～4倍柱体积的8％～12％乙醇或8％～12％甲醇洗，弃去洗脱液，最后用3～4倍柱体积的60％～80％乙醇或60％～80％甲醇洗脱，收集60％～80％乙醇或60％～80％甲醇洗脱液，水浴挥干乙醇或甲醇，移置10ml～50ml量瓶中，加纯水至刻度，即为供试品样；所述步骤(b)中所述色谱条件检测波长339～345nm；柱温25～35℃；进样量15～50μl；流动相A相为2％～5％冰醋酸，B相为甲醇，流速1.0ml/min。
最佳的本发明可以通过下述步骤实施所述步骤(a)中供试品溶液的制备精密称取过24～80目筛药材陈皮2.0g，置200ml平底烧瓶中，加60倍量水，加热，回流提取1h，放冷至约40～50℃，真空过滤，药渣中再加入40倍量水，提取0.5h，同法操作，合并过滤液，移至100ml量瓶中，定容至刻度。取50ml该滤液，以1.5～2.0ml/min流速过AB-8型树脂柱，分离柱高50cm，内径1.0cm，柱内树脂高40cm，再以同样流速先用100ml的水洗，再用100ml的10％乙醇洗，弃去洗脱液，最后用100ml的70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，水浴挥干乙醇，移置25ml量瓶中，加纯水至刻度，即为供试品样.
所述步骤(b)中所述色谱条件检测波长340nm；柱温30℃；进样量20μl。流动相A相为5％冰醋酸，B相为甲醇，采用递度洗脱，梯度洗脱程序如下0分钟，流动相A为82％的5％冰醋酸溶液、B为18％的甲醇；40分钟，流动相A为76％的5％冰醋酸溶液、B为24％的甲醇；60分钟，流动相A为70％的5％冰醋酸溶液、B为30％的甲醇。。
本发明中，因甲醇对人体具有毒害，选用乙醇溶液作为洗脱剂比甲醇更安全，其洗脱剂乙醇浓度在40％～90％范围均有较好的效果。
按照本发明中发明方法测定7个不同来源的陈皮药材水提物的指纹图谱，比较其色谱图，按2000年国家药品监督管理局颁发的《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》，以相对保留时间标定指纹峰，确定其共有峰有9个，其中以橙皮苷为参照物，即9号峰，制定了陈皮药材标准指纹图谱技术参数，其共有峰的相对保留时间比值平均值1(0.194)，2(0.208)，3(0.276)，4(0.291)，5(0.364)，6(0.439)，7(0.711)，8(0.837)，9(1)；共有峰的相对峰面积比值范围以及占总面积比例范围1(0.01～0.047)(0.95％～2.05％)，2(0.02～0.06)(0.78％～2.63％)，3(0.011～0.051)(1.57％～2.56％)，4(0.102～0.263)(5.81％～11.51％)，5(0.022～0.083)(1.28％～3.62％)，6(0.089～0.323)(5.01％～16.05％)，7(0.231～0.395)(13.16％～19.09％)，8(0.012～0.078)(0.67％～3.40％)，9(1～1)(43.78％～63.15％)。
不同来源的陈皮药材特征指纹色谱峰的相似度，根据相关系数法计算峰的相似度，用峰的峰面积进行计算，用相关系数方法进行计算，其相似度范围是.9887～0.9990，已达到指纹图谱相似度的要求(0.9～1.0)。
本发明的优点如下(1)以陈皮水提取物建立起来的HPLC指纹图谱，代表着陈皮大部分药理活性，能有效地表征陈皮药材的质量。大量的陈皮药理研究结果表明陈皮水提取物其药理作用广泛，且其药理作用多于挥发油成分，故用陈皮的水提取成分作为监控指标就更具有代表性。
(2)以陈皮整个指纹图形作为一个整体看待，注重各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既避免了因只测定一、二个化学成分而判定陈皮整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。本发明为完整、准确评价陈皮的质量提供了新的对照标准，为陈皮GAP基地质量控制建立方法，以及提高陈皮及其成方制剂的质量控制及疗效做出贡献。
(3)本发明具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点。为反映陈皮整体特征，选用了检测波长为340nm，在此波长下检测，其峰数多，反应的信息全面。而现文献中是针对某一成分(如橙皮苷、辛弗林、川陈皮素等)的最大吸收选择波长，其不能全面反应陈皮的各成分的信息。因橙皮苷溶于热水中，所以在提取液过滤前，提取液保持一定的温度30～50℃，保证一定的提取率；另外，样品通过大孔吸附树脂AB-8富集纯化后，除去了强极性成分如蛋白质、糖类、鞣质等，提高样品的纯度，降低了因样品复杂而给色谱柱分离效果带来影响，提高色谱柱柱效以及寿命，同时提高了实验的准确性。
图1陈皮药材120min色谱20.2mg/ml橙皮苷的色谱3陈皮药材指纹图谱的特征峰图4不同来源的陈皮药材水提物色谱图其中从上至下依次为10-11月采于湖北、11月采于湖北、10-11月采于浙江、10月采于湖南、11月采于浙江、10月采于浙江、11月采于湖南。
实施方式实施例一(a)供试品溶液的制备称取过24～80目筛药材陈皮，置平底烧瓶中，加8倍量水，加热，回流提取3h，放冷至30～50℃，真空过滤，药渣中再加入6倍量水，提取2h，同法操作，合并过滤液，量定体积。量取相对生药材5g的滤液，过AB-8型树脂柱，先用3～4倍柱体积的水洗，再用3～4倍柱体积的15％乙醇或15％甲醇洗，弃去洗脱液，最后用3～4倍柱体积的90％乙醇或90％甲醇洗脱，收集90％乙醇或90％甲醇洗脱液，水浴挥干乙醇或甲醇，移置125ml量瓶中，加纯水至刻度，即为供试品样；(b)色谱条件检测波长340nm；柱温30℃；进样量20μl。流动相A相为5％冰醋酸，B相为甲醇，流速1.0ml/rmin，递度洗脱0分钟，流动相A为82％的5％冰醋酸溶液、B为18％的甲醇；40分钟，流动相A为76％的5％冰醋酸溶液、B为24％的甲醇；60分钟，流动相A为70％的5％冰醋酸溶液、B为30％的甲醇；
(c)测定精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到陈皮药材水提物的指纹图谱。
实施例二(a)供试品溶液的制备称取过24～80目筛药材陈皮，置平底烧瓶中，加80倍量水，加热，回流提取0.5h，放冷至30～50℃，真空过滤，药渣中再加入60倍量水，提取0.25h，同法操作，合并过滤液，量定体积。量取相对生药材0.25g的滤液，过AB-8型树脂柱，先用3～4倍柱体积的水洗，再用3～4倍柱体积的5％乙醇或5％甲醇洗，弃去洗脱液，最后用3～4倍柱体积的40％乙醇或40％甲醇洗脱，收集40％乙醇或40％甲醇洗脱液，水浴挥干乙醇或甲醇，移置2ml量瓶中，加纯水至刻度，即为供试品样；(b)色谱条件检测波长340nm；柱温30℃；进样量20μl。流动相A相为5％冰醋酸，B相为甲醇，流速1.0ml/min，递度洗脱0分钟，流动相A为82％的5％冰醋酸溶液、B为18％的甲醇；40分钟，流动相A为76％的5％冰醋酸溶液、B为24％的甲醇；60分钟，流动相A为70％的5％冰醋酸溶液、B为30％的甲醇；(c)测定精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到陈皮药材水提物的指纹图谱。
实施例三(a)供试品溶液的制备称取过24～80目筛药材陈皮，置平底烧瓶中，加20倍量水，加热，回流提取2.5h，放冷至30～50℃，真空过滤，药渣中再加入15倍量水，提取1.5h，同法操作，合并过滤液，量定体积。量取相对生药材3g的滤液，过AB-8型树脂柱，先用3～4倍柱体积的水洗，再用3～4倍柱体积的14％乙醇或14％甲醇洗，弃去洗脱液，最后用3～4倍柱体积的85％乙醇或85％甲醇洗脱，收集85％乙醇或85％甲醇洗脱液，水浴挥干乙醇或甲醇，移置5ml量瓶中，加纯水至刻度，即为供试品样；(b)色谱条件检测波长340nm；柱温30℃；进样量20μl。流动相A相为5％冰醋酸，B相为甲醇，流速1.0ml/min，递度洗脱0分钟，流动相A为82％的5％冰醋酸溶液、B为18％的甲醇；40分钟，流动相A为76％的5％冰醋酸溶液、B为24％的甲醇；60分钟，流动相A为70％的5％冰醋酸溶液、B为30％的甲醇；(c)测定精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到陈皮药材水提物的指纹图谱。
实施例四(a)供试品溶液的制备称取陈皮药材，过24～80目筛，置平底烧瓶中，加75倍量水，加热，回流提取0.6h，放冷至30～50℃，真空过滤，药渣中再加入55倍量水，提取0.3h，同法操作，合并过滤液，量定体积。量取相对生药材0.75g的滤液，过AB-8型树脂柱，先用3～4倍柱体积的水洗，再用3～4倍柱体积的6％乙醇或6％甲醇洗，弃去洗脱液，最后用3～4倍柱体积的50％乙醇或50％甲醇洗脱，收集50％乙醇或50％甲醇洗脱液，水浴挥干乙醇或甲醇，移置100ml量瓶中，加纯水至刻度，即为供试品样。
(b)色谱条件检测波长340nm；柱温30℃；进样量20μl。流动相A相为5％冰醋酸，B相为甲醇，流速1.0ml/min，递度洗脱0分钟，流动相A为82％的5％冰醋酸溶液、B为18％的甲醇；40分钟，流动相A为76％的5％冰醋酸溶液、B为24％的甲醇；60分钟，流动相A为70％的5％冰醋酸溶液、B为30％的甲醇。
(c)测定精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到陈皮药材水提物的指纹图谱。
实施例五(a)中供试品溶液的制备称取过24～80目筛药材陈皮，置平底烧瓶中，加30倍量水，加热，回流提取2.0h，放冷至30～50℃，真空过滤，药渣中再加入15倍量水，提取1.0h，同法操作，合并过滤液，量定体积。量取相对生药材2g的滤液，过AB-8型树脂柱，先用3～4倍柱体积的水洗，再用3～4倍柱体积的12％乙醇或12％甲醇洗，弃去洗脱液，最后用3～4倍柱体积的80％乙醇或80％甲醇洗脱，收集80％乙醇或80％甲醇洗脱液，水浴挥干乙醇或甲醇，移置10ml量瓶中，加纯水至刻度，即为供试品样.
(b)色谱条件检测波长340nm；柱温30℃；进样量20μl。流动相A相为5％冰醋酸，B相为甲醇，流速1.0ml/min，递度洗脱0分钟，流动相A为82％的5％冰醋酸溶液、B为18％的甲醇；40分钟，流动相A为76％的5％冰醋酸溶液、B为24％的甲醇；60分钟，流动相A为70％的5％冰醋酸溶液、B为30％的甲醇。
(c)测定精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到陈皮药材水提物的指纹图谱。
实施例六(a)中供试品溶液的制备称取过24～80目筛药材陈皮，置平底烧瓶中，加65倍量水，加热，回流提取0.75h，放冷至30～50℃，真空过滤，药渣中再加入55倍量水，提取0.4h，同法操作，合并过滤液，量定体积。量取相对生药材0.5g的滤液，过AB-8型树脂柱，先用3～4倍柱体积的水洗，再用3～4倍柱体积的8％乙醇或8％甲醇洗，弃去洗脱液，最后用3～4倍柱体积的60％乙醇或60％甲醇洗脱，收集60％乙醇或60％甲醇洗脱液，水浴挥干乙醇或甲醇，移置50ml量瓶中，加纯水至刻度，即为供试品样。
(b)色谱条件检测波长340nm；柱温30℃；进样量20μl。流动相A相为5％冰醋酸，B相为甲醇，流速1.0ml/min，递度洗脱0分钟，流动相A为82％的5％冰醋酸溶液、B为18％的甲醇；40分钟，流动相A为76％的5％冰醋酸溶液、B为24％的甲醇；60分钟，流动相A为70％的5％冰醋酸溶液、B为30％的甲醇。
(c)测定精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到陈皮药材水提物的指纹图谱。
实施例七1、仪器与试药1、1仪器美国Waters高效液相色谱仪(2996PDA二极管阵列检测器，515泵，Empower工作站)；Waters in line Degasser AF脱气机；中药小型粉碎机(上海淀久中药机械制造有限公司)；万用电炉DL-1(北京中兴伟业仪器有限公司)；Milli-Q超纯水仪；Mettler Toledo AB204-N分析天平，AB-8大孔吸附树脂(南开大学)。
1、2试药陈皮药材(由江中药业股份有限公司采购，经江中药业股份有限公司质监部鉴定为正品)为干燥品，未经炮制。甲醇(色谱纯)；醋酸(分析纯)；水(双蒸并过Milli-Q超纯水仪)；橙皮苷对照品(中国药品生物制品检定所)。
2、陈皮指纹图谱测定2、1陈皮指纹图谱制备AB-8型树脂柱的预处理a、先于吸附柱内加入相当于装填树脂体积0.4～0.5倍的乙醇或甲醇，再将新树脂投入柱中.使其液面高于树脂层约30cm，并浸泡24小时。
b、用2倍柱体积乙醇或甲醇，以每小时2倍柱体积的流速通过树脂层，并浸泡4～5小时。现用乙醇或甲醇以每小时2倍柱体积的流速通过树脂层，洗至流出液加水不呈白色浑浊为止。并以水以同样流速洗净乙醇或甲醇。
c、用2倍柱体积的5％HCL溶液，以每小时4～6倍柱体积的流速通过树脂层，并浸泡2～4小时，而后用水以同样流速洗至出水pH为中性。
d、再用2倍柱体积的5％HCL溶液，以每小时4～6倍柱体积的流速通过树脂层，并浸泡2～4小时，而后用水以同样流速洗至出水pH为中性。
进行大孔吸附树脂再生处理时，直接用95％乙醇以每小时4～6倍柱体积的流速冲洗，再用蒸馏水冲洗树脂至平衡。
对照品溶液的制备精密称取真空干燥至恒重的橙皮苷对照品10mg，置25ml量瓶中，加甲醇溶解定容至刻度，摇匀，即为母液，精密量取5ml置于10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得(每毫升含橙皮苷0.2mg)。
供试品制备精密称取过24～80目筛药材陈皮2.0g，置200ml平底烧瓶中，加60倍量水，直火加热回流提取1h，放冷至约40～50℃，真空过滤，药渣中再加入40倍量水，提取0.5h，同法操作，合并过滤液，移至100ml量瓶中，定容至刻度。取50ml该滤液，以1.5～2.0ml/min流速过AB-8型树脂柱(分离柱高50cm，内径1.0cm，柱内树脂高40cm)，再以同样流速先用100ml的水洗，再用100ml的10％乙醇洗，弃去洗脱液，最后用100ml的70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，水浴挥干乙醇，移置25ml量瓶中，加Milli-Q水至刻度，即为供试品样.
3、色谱条件Agilent ODS-C18分析柱(250mm×4.6mm 5μm)；检测波长340nm；柱温30℃；进样量20μl。流动相A相为5％冰醋酸，B相为甲醇，流速1.0ml/min梯度洗脱程序如下表
参照物 选用橙皮苷为参照物(S)。
分别取对照品及供试品溶液20μl进样，照高效液相色谱法测定，记录60分钟的色谱图。以橙皮苷的色谱峰(S)的相对保留时间和峰面积为1计算相对保留时间和相对峰面积。
4、结果4、1精密度与稳定性实验取陈皮药材供试品溶液分别在0、2、4、6、8h不同的时间点进行检测，考察色谱峰相对峰面积和相对保留时间比值的一致性，同时进行精密度测定。结果见表一、表二表一、相对峰面积的相对标准差
表二、相对保留时间的相对标准差
4、2重现性实验精密称取过24～65目筛陈皮药材粉5份，按供试品制备方法制备样品，分别进样检测。结果见表三、表四。
表三、相对峰面积的相对标准差
表四、相对保留时间的相对标准差
5、特征共有峰按照本发明方法测定7个不同来源的陈皮药材其水提物的HPLC图谱，比较其色谱图，按《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》以相对保留时间标定指纹峰，确定其共有峰有9个，其中以橙皮苷为参照物，即9号峰。制定了陈皮药材标准指纹图谱技术参数，其共有峰相对保留时间比值平均值1(0.194)，2(0.208)，3(0.276)，4(0.291)，5(0.364)，6(0.439)，7(0.711)，8(0.837)，9(1)；共有峰相对峰面积比值范围以及占总面积比例范围1(0.01～0.047)(0.95％～2.05％)，2(0.02～0.06)(0.78％～2.63％)，3(0.011～0.051)(1.57％～2.56％)，4(0.102～0.263)(5.81％～11.51％)，5(0.022～0.083)(1.28％～3.62％)，6(0.089～0.323)(5.01％～16.05％)，7(0.231～0.395)(13.16％～19.09％)，8(0.012～0.078)(0.67％～3.40％)，9(1～1)(43.78％～63.15％)。其具体结果见表五、表六。
表五、不同产地和时间的陈皮药材水提取物特征共有峰的相对保留时间比值
表六、不同产地和时间的陈皮药材水提取物特征共有峰的相对峰面积比值
6、不同来源的陈皮药材特征指纹图色谱峰的相似度 根据相关系数法计算峰的相似度，用峰面积进行计算，其相似度范围是0.9887～0.9990，已达到指纹图谱相似度的要求(0.9～1.0)，结果如下表七。
表七、不同产地和时间的陈皮药材特征指纹色谱峰的相似度
相似度计算公式
权利要求
1.一种中药材陈皮水提物的指纹图谱测定方法，其特征包括如下步骤(a)供试品溶液的制备称取中药材陈皮，加水，回流提取，过滤，取滤液过大孔吸附树脂柱，水洗，乙醇或甲醇洗去强极性成分，再用乙醇或甲醇洗脱，收集洗脱液，水浴挥干乙醇或甲醇，移置量瓶中，加水至刻度，即为供试品；(b)色谱条件色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为冰醋酸水溶液，流动相B为甲醇；检测波长335～350nm；(c)测定精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。
2.根据权利要求1所述(a)中的大孔吸附脂为弱极性与非极性大孔吸附树脂。
3.根据权利要求1所述(a)中的乙醇或甲醇为5～15％乙醇或5～15％甲醇洗去强极性成分，再用40％～90％乙醇或40％～90％甲醇洗脱，收集40％～90％乙醇或40％～90％甲醇洗脱液。
4.根据权利要求1所述(b)中的流动相A为0.5％～7％冰醋酸水溶液。
5.根据权利要求1所述步骤(a)中供试品溶液的制备称取过24～80目筛中药材陈皮，置平底烧瓶中，加8～80倍量水，加热，回流提取0.5～3h，放冷至30～50℃，真空过滤，药渣中再加入6～60倍量水，提取0.25～2h，同法操作，合并过滤液，量定体积。量取相对生药材0.25～5g的滤液，过AB-8型树脂柱，先用3～4倍柱体积的水洗，再用3～4倍柱体积的5％～15％乙醇或5％～15％甲醇洗，弃去洗脱液，最后用3～4倍柱体积的40％～90％乙醇或40％～90％甲醇洗脱，收集40％～90％乙醇或40％～90％甲醇洗脱液，水浴挥干乙醇或甲醇，移置2ml～125ml量瓶中，加纯水至刻度，即为供试品样；所述步骤(b)中所述色谱条件检测波长336～348nm；柱温20～40℃；进样量5～100μl；流动相A相为0.5％～7％冰醋酸，B相为甲醇，流速1.0ml/min。
6.根据权利要求5所述步骤(a)中供试品溶液的制备称取过24～80目筛药材陈皮，置平底烧瓶中，加20～75倍量水，加热，回流提取0.6～2.5h，放冷至30～50℃，真空过滤，药渣中再加入15～55倍量水，提取0.3～1.5h，同法操作，合并过滤液，量定体积。量取相对生药材0.75～3g的滤液，过AB-8型树脂柱，先用3～4倍柱体积的水洗，再用3～4倍柱体积的6％～14％乙醇或6％～14％甲醇洗，弃去洗脱液，最后用3～4倍柱体积的50％～85％乙醇或50％～85％甲醇洗脱，收集50％～85％乙醇或50％～85％甲醇洗脱液，水浴挥干乙醇或甲醇，移置5ml～100ml量瓶中，加纯水至刻度，即为供试品样。所述步骤(b)中所述色谱条件检测波长338～346nm；柱温22～38℃；进样量10～80μl。流动相A相为1％～6.5％冰醋酸，B相为甲醇，流速1.0ml/min。
7.根据权利要求6所述步骤(a)中供试品溶液的制备称取过24～80目筛中药材陈皮，置平底烧瓶中，加30～65倍量水，加热，回流提取0.75～2.0h，放冷至30～50℃，真空过滤，药渣中再加入15～55倍量水，提取0.4～1.0h，同法操作，合并过滤液，量定体积。量取相对生药材0.5～2g的滤液，过AB-8型树脂柱，先用3～4倍柱体积的水洗，再用3～4倍柱体积的8％～12％乙醇或8％～12％甲醇洗，弃去洗脱液，最后用3～4倍柱体积的60％～80％乙醇或60％～80％甲醇洗脱，收集60％～80％乙醇或60％～80％甲醇洗脱液，水浴挥干乙醇或甲醇，移置10ml～50ml量瓶中，加纯水至刻度，即为供试品样.所述步骤(b)中所述色谱条件检测波长339～345nm；柱温25～35℃；进样量15～50μl。流动相A相为2％～6％冰醋酸，B相为甲醇，流速1.0ml/min。
8.根据权利要求7所述步骤(a)中供试品溶液的制备精密称取过24～80目筛陈皮药材2.0g，，置200ml平底烧瓶中，加60倍量水，加热，回流提取1h，放冷至约40～50℃，真空过滤，药渣中再加入40倍量水，提取0.5h，同法操作，合并过滤液，移至100ml量瓶中，定容至刻度。取50ml该滤液，以1.5～2.0ml/min流速过AB-8型树脂柱，分离柱高50cm，内径1.0cm，柱内树脂高40cm，再以同样流速先用100ml的水洗，再用100ml的10％乙醇洗，弃去洗脱液，最后用100ml的70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，水浴挥干乙醇，移置25ml量瓶中，加纯水至刻度，即为供试品样。所述步骤(b)中所述色谱条件检测波长340nm；柱温30℃；进样量20μl。流动相A相为5％冰醋酸，B相为甲醇。采用递度洗脱，梯度洗脱程序如下0分钟，流动相A为82％的5％冰醋酸溶液、B为18％的甲醇；40分钟，流动相A为76％的5％冰醋酸溶液、B为24％的甲醇；60分钟，流动相A为70％的5％冰醋酸溶液、B为30％的甲醇。
9.根据权利要求1、4所述中的流动A溶液的配制比例是按体积比配制。
全文摘要
本发明涉及中药材陈皮水提物的指纹图谱的测定方法，包括如下步骤(a)中药材陈皮，加水，回流提取，过滤，取滤液过大孔吸附树脂柱，水洗，5～15％乙醇或5～15％甲醇洗去强极性成分，再用40％～90％乙醇或40％～90％甲醇洗脱，收集洗脱液，水浴挥干乙醇或甲醇，移置量瓶中，加水至刻度，即为供试品；(b)色谱条件色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为冰醋酸水溶液，流动相B为甲醇；检测波长335～350nm；(c)测定精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。本发明的优点是方法简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握的特点，完整、准确评价陈皮的质量。
文档编号G01N30/02GK1830472SQ20051009703
公开日2006年9月13日 申请日期2005年12月30日 优先权日2005年12月30日
发明者付玉梅, 李诒光, 伍振峰 申请人:江中药业股份有限公司