专利名称：生物芯片的制造方法、探针溶液和生物芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物芯片的制造方法、探针溶液和生物芯片。
背景技术：
生物芯片是指将DNA、蛋白质、糖链等生物分子或者细胞等固定在支撑体(基板)上，并使固定的上述生物分子、细胞等(以下称为探针)与生物分子或其除其以外的化合物(以下称为靶)接触，能够大量且同时平行地检测所产生的特异性相互作用的芯片。生物芯片中，DNA芯片是将数千～数万种的DNA片断和合成寡核苷酸(以下将它们称为DNA探针)分别固定在边长为数厘米的四方玻璃基板、硅基板等的规定位置上而得到的。DNA芯片在例如同时测定多个基因的表达情况、以检测特定基因的存在为目的的基因检查方法等中使用。
使用了DNA芯片的上述基因检查方法例如可按照以下工序进行。
1.从检体的细胞或血液中将信使RNA(mRNA)取出。
2.由上述mRNA逆转录和复制互补性DNA(cDNA)后，将它们片断化，并结合荧光色素进行标记，调制靶。
3.将标记化了的上述cDNA(靶)设在DNA芯片上，使其与基板上的DNA探针结合。靶cDNA和与其互补的DNA探针相结合。
4.洗涤上述DNA芯片，除去未与DNA探针相结合的靶。
5.使用荧光显微镜观测荧光色素的发光，由此检测靶在DNA芯片基板上的位置和量。
DNA芯片的制造方法可大致分为2种方法。第1方法是应用在半导体制造技术中使用的光刻法，即将作为DNA构成单位的4种单核苷酸分别在基板上的规定位置处按照规定顺序化学键合，从而形成寡核苷酸的方法(例如参照专利文献1)。这里，寡核苷酸是指数个～数十个核苷酸聚合的物质，例如天然核酸等聚合度高的聚核苷酸片断化后的物质、与聚核苷酸相比分子量小的物质。
第2个DNA芯片的制造方法是预先准备溶解有固定的寡核苷酸的液体，将其微量滴加到基板上的规定位置以进行固定的方法。在将上述寡核苷酸固定到上述基板的方法中，有使用化学键的方法、使用物理吸附的方法等，上述微量滴加可以利用喷墨法(例如参照专利文献2)。上述喷墨法是指将液滴从形成于喷嘴板上的直径为数十μm的多个孔中向基板喷出，从而在基板的规定位置上配置上述液体的方法，这是作为喷墨式打印机的印刷方法而被广泛使用的方法。
利用了喷墨法的DNA芯片的制造方法比上述第1制造方法简单，且能够以低成本制造DNA芯片，因此作为今后的DNA芯片的制造方法而被期待。另一方面，作为该制造方法的问题点，可以列举出下述2点。
(1)将液滴配置在基板上的规定位置的精度。
(2)利用喷墨法喷出的溶液在基板上的扩散和渗透。
上述问题点(1)的配置精度是DNA芯片品质中的重要要素之一，但通过开发能够高精度印刷的喷墨式喷射装置，能够提高其精度。目前市售的喷墨式打印机能够将数十μm直径的液滴以±30μm的位置精度配置在基板上。通过日后的装置改良，液滴的微小化和位置精度将大大提高。
上述问题点(2)的在基板上溶液扩散和渗透是限制基板上的DNA探针区域的配置密度的原因。即，为了提高DNA探针区域的密度，需要以狭小间隔将各DNA探针溶液配置在基板上，但由于溶液的扩散和渗透，溶液之间会发生重叠。为了避免溶液之间的重叠，可以将各溶液的间隔扩大，但此时，探针的密度也降低。
图5示意地表示了通过喷墨法喷出的DNA探针溶液在基板上的扩散状况。另外，在图5的各图中，同一部分带有同一符号。图5A～图5C是通过喷墨法向基板上喷出的DNA探针溶液不在基板上扩散时的示意图，图5A表示通过喷墨法向基板53以箭头52方向喷射DNA探针溶液51的状况；图5B表示DNA探针溶液54与基板53刚接触后的状况；图5C表示上述接触后，经过一定时间后的DNA探针溶液55在基板53上的状况。如图5A～图5C所示，与基板53刚接触后的溶液54的接触面积(图5B)与之后溶液55和基板53的接触面积(图5C)相比，几乎没有变化，DNA探针溶液在基板53上没有扩散。作为对照，图5D～图5F是DNA探针溶液在基板上扩散时的示意图，图5D表示通过喷墨法向基板53以箭头52方向喷射DNA探针溶液51的状况；图5E表示DNA探针溶液56与基板53刚接触后的状况；图5F表示上述接触后，经过一定时间后的DNA探针溶液57在基板53上的状况。如图5D～图5F所示，与基板53刚接触后的溶液56的接触面积(图5E)随时间的变化较大，溶液57在基板53上扩散(图5F)。
图6是表示DNA探针溶液固定前的DNA芯片用基板和用喷墨法喷出DNA探针溶液后的上述基板的状况的平面示意图，图6的各图中，同一部分带有同一符号。图6A表示将DNA探针溶液固定在固定区域62前的DNA芯片用基板61；图6B表示喷射的DNA探针溶液63不在基板61上扩散时的DNA芯片用基板61；图6C表示喷射的DNA探针溶液64在基板61上扩散时的DNA芯片用基板61。当DNA探针溶液不在基板上扩散时，如图6B所示，溶液63被配置在规定区域62上；但当DNA探针溶液扩散时，如图6C所示，相邻溶液64混在一起。为了避免这种DNA探针溶液的重叠，需要扩大各个溶液之间的间隔(DNA探针区域的间隔)，但如果扩大该间隔，则在基板上的DNA探针区域的密度降低，可在一张DNA芯片上配置的DNA探针的种类变得有所限制。
喷墨法中，DNA探针溶液在基板上的扩散和渗透的容易性多起因于DNA探针和基板的固定方法。如上所述，作为DNA探针和基板的固定方法，可以列举出化学键合、物理吸附，但这些固定方法均是利用DNA探针中的极性基团的方法。因此，在固定DNA探针的基板表面上存在与DNA探针的极性基团发生化学反应的极性基团、或者与DNA探针的极性基团形成离子键或氢键的极性基团。具有极性基团的基板表面的表面能量高、对液体的浸润性良好。因此，DNA芯片用基板通常表面能量高、通过喷墨法喷出的DNA探针溶液易在基板上发生扩散和渗透。
作为解决DNA探针溶液在基板上的扩散和渗透问题的方法，公开了将固定DNA探针的区域制成亲水性、将其周围制成疏水性，由此防止DNA探针溶液从上述固定区域中扩散的方法(参照专利文献3)。该方法是一种制造DNA芯片的方法，其中，例如通过经过金属掩模等的光照处理将具有未处理状态下为疏水性、用光或热处理成为亲水性的表面的基板表面形成疏水性和亲水性的图案后，通过喷墨法将含有DNA探针的溶液喷在亲水性区域上。
专利文献1美国专利第5405783号说明书专利文献2日本特开2001-66305号公报专利文献3日本特开2003-28864号公报发明内容上述制造方法由于DNA探针溶液在基板上不扩散，因此具有能够高密度配置DNA探针区域的优点，但存在着基板表面的图案形成费事的问题。另外，为了正确地将DNA探针溶液仅喷出设置在形成有图案的基板的亲水性区域上，需要在喷墨装置中设置检测上述亲水性区域的机构，或者需要将基板正确地设置在喷墨装置上，因此也存在着制造成本高、制造工序增多的问题。
另外，包含DNA芯片的生物芯片，通常来说，如果有机物等附着在其表面上而被污染时，则存在着作为试验检体的靶和被固定在基板上的探针的结合变难、使用了生物芯片的上述基因检测方法的检测灵敏度降低的问题。因此，必须严密保管生物芯片以便不被污染，也存在着使用状况不良的问题。
因此，本发明的目的在于提供一种生物芯片的制造方法，其中，在使用探针溶液并将探针固定在基板上时，能够简单地抑制上述探针溶液在上述基板上的扩散和渗透，因此能够高密度地集积探针区域，并且所制造的生物芯片难以被有机物等污染。
为了达成上述目的，本发明的生物芯片的制造方法包括准备探针溶液的工序、准备基板的工序、在上述基板上配置上述探针溶液的工序以及将配置的上述探针溶液中的探针固定在上述基板上的工序，其中，上述探针溶液含有具有疏水性链和吸附于上述基板上的官能团的分子以及探针。
对于更简单地抑制在制造DNA芯片等生物芯片时通过喷墨法将探针溶液喷射到基板上时产生的上述溶液在上述基板上的扩散和渗透的方法，本发明人等着眼于作为溶液扩散和渗透起因之一的上述基板表面的表面能量，进行了深入研究。结果发现，如果在上述探针溶液中溶解具有疏水性链和吸附于上述基板的官能团的分子，则将上述探针溶液配置在上述基板上时，上述分子介由上述官能团吸附于基板上形成单分子膜，由于上述单分子膜，上述基板的表面能量降低，由此能够抑制上述探针溶液的扩散和渗透。而且，本发明人等还发现，如果在固定了上述探针的区域上形成上述单分子膜，则上述区域难以被有机物等污染，进而完成了本发明。
根据本发明的生物芯片的制造方法，例如能够制造探针固定的区域为疏水性、探针区域以外的基板表面为亲水性的本发明的生物芯片。根据该生物芯片，例如由于含有靶分子(目标分子)的试样溶液能够与生物芯片上的探针重现性良好地且有效地反应，因此能够进行更高精度的测定。
通常，为了使固定在生物芯片上的探针和靶分子反应，使用将溶解了靶分子的溶液滴加到整个生物芯片上，或者在试样溶液中浸渍生物芯片的方法。但是，例如使用在探针存在的区域为亲水性、初此之外为疏水性的现有生物芯片，利用上述方法使探针和靶试样溶液反应时，产生以下问题。即，在为将靶试样溶液滴加到上述生物芯片的方法时，如果生物芯片的基板面的法线从垂直方向(重力作用的方向)即便稍有偏移，由于生物芯片表面为疏水性，因此液滴就成为球状，几乎所有溶液都从生物芯片上滚落，靶分子和探针无法有效地反应。另外，在为将上述生物芯片浸渍在靶试样溶液中的方法时，如果不小心地进行浸渍的话，则在疏水性区域上产生气泡，该气泡会覆盖探针区域，从而靶分子和探针变得不能反应。与此相对，如果是本发明的生物探针，由于能够将未固定探针的区域制成亲水性，因此在将靶试样溶液滴加到基板上时，即便基板面的法线从垂直方向偏移，也能够抑制试验溶液从本发明的生物芯片表面滚落。另外，在将本发明的生物芯片浸渍在靶试样溶液中时，由于疏水性区域被限定于探针区域，因此在本发明的生物芯片表面上几乎不吸附气泡、靶分子和探针能够有效地反应。因而，本发明的生物芯片与以往相比，由于靶分子和探针有效地反应，因此能够精度良好地测定靶分子。
另外，根据本发明的生物芯片的制造方法，例如能够不经过基板上的亲水性和疏水性区域的图案形成等工序，即可简单地抑制探针溶液在基板上的扩散和渗透，因此能够简单制造探针区域高密度配置的生物芯片，能够制造例如价格低廉的生物芯片。而且，由于通过本发明的制造方法能够制造难以被污染的生物芯片，因此能够例如提高生物芯片的保存和处理等使用情况，例如可以将使用了DNA芯片等的基因研究和基因诊断变得更为简单和简便。
图1A～C是滴加在基板上的探针溶液的随时间变化的一个例子的示意图。
图2A～F是滴加在基板上的探针溶液的分子水平的随时间变化的一个例子的示意图。
图3为表示喷墨式打印机的一个例子的示意图。
图4A和B为表示喷墨头的一个例子的示意图。
图5A～F是表示喷到基板上的溶液的扩散状况的示意图。
图6A～C是表示喷到基板上的溶液的扩散状况的平面示意图。
图7是用于说明滴加到基板上的溶液的接触角θ和Young的关系式的示意图。
符号说明1探针溶液2基板3表面能量降低了的基板4被基板表面排斥而收缩的探针溶液 20与基板吸附的官能团21探针溶液 22DNA探针23具有氟代烷基链的分子 24基板25形成在基板上的具有氟代烷基链的分子的单分子膜26固定在基板上的DNA探针27伴随基板的表面能量降低而收缩的探针溶液28吸附在单分子膜上的具有氟代烷基链的分子29吸附在单分子膜上的DNA探针30具有氟代烷基链的基团31喷墨打印机整体图像 32喷墨头33记录介质 34托架轴35托架 36轧辊40点划线 41压电元件42振动板 43压力室44油墨供给孔 45油墨流路46喷嘴孔47通过电压施加而变形了的压电元件48喷出的油墨 49油墨的飞行方向
51通过喷墨法喷出的DNA探针溶液52表示喷射方向的矢量53基板54与基板刚接触后的DNA探针溶液55不扩散的DNA探针溶液56与基板刚接触后的DNA探针溶液57扩散后的DNA探针溶液61DNA芯片用基板62DNA探针固定位置(波状线圆内)63想配置的DNA探针溶液64在基板上扩散并相邻之间接触了的DNA探针溶液71液体 72基板73液体和基板的接触部分的液体表面切线74表示基板和液体的界面能量的矢量75表示基板表面能量的矢量76表示液体表面张力的矢量77接触角具体实施方式
本发明的生物芯片的制造方法中，作为具有疏水性链和吸附于基板的官能团的分子的所述疏水性链，可以列举出例如烃链，其中优选为烃链的1个以上氢原子取代为卤原子的卤代烷基链，更优选为氟代烷基链。
本发明的生物芯片的制造方法中，作为具有疏水性链和吸附于基板的官能团的分子的所述官能团，优选为例如OH、NH2、SH、SS、COOH、SiOH、Si(OR)(R为甲基、乙基、丙基或丁基)和Si[(O-CH2CH2)m-OR](m为1～10的自然数、R为甲基、乙基、丙基或丁基)。
本发明的生物芯片的制造方法中，具有上述氟代烷基链和上述官能团的分子优选为以下述通式(1)或(2)所示的化合物或者它们的水解物。
CF3(CF2)nC2H4SiR3-x(OY)x(1)CF3(CF2)nC2H4Si[(O-CH2CH2)m-OR]3(2)上述通式(1)中，R和Y各自独立地为甲基、乙基、丙基或丁基。n为1～10的自然数，x为1～3的自然数。x＝1时，R存在2个，但它们可不同。
上述通式(2)中，R为甲基、乙基、丙基或丁基。n为1～10的自然数、m为1～10的自然数。
本发明的生物芯片的制造方法中，上述探针溶液在基板上的配置优选通过滴加或利用喷墨法的喷射来进行。
本发明的生物芯片的制造方法中，在将上述探针固定在上述基板上后，还优选进一步包括用液体洗涤上述基板的工序。
本发明的生物芯片的制造方法中，上述探针溶液优选是来自于选自核酸、蛋白质、糖、细胞和它们的修饰物中至少一个的探针。
本发明的探针溶液是生物芯片的探针溶液，是含有具有疏水性链和极性基团的分子以及探针的探针溶液。本发明的探针溶液可以用于本发明的生物芯片的制造方法中。
本发明的探针溶液中，作为上述具有疏水性链和极性基团的分子的疏水性链，可以列举出例如烃链，其中优选为烃链的一个以上氢原子取代为卤原子的卤代烷基链，更优选为氟代烷基链。
本发明的探针溶液中，作为上述具有疏水性链和极性基团的分子的极性基团，优选为例如OH、NH2、SH、SS、COOH、SiOH、Si(OR)(R为甲基、乙基、丙基或丁基)和Si[(O-CH2CH2)m-OR](m为1～10的自然数、R为甲基、乙基、丙基或丁基)。
本发明的探针溶液中，作为上述具有氟代烷基链和极性基团的分子，优选为以下述通式(1)或(2)所示的化合物或者它们的水解物。
CF3(CF2)nC2H4SiR3-x(OY)x(1)CF3(CF2)nC2H4Si[(O-CH2CH2)m-OR]3(2)上述通式(1)中，R和Y各自独立地为甲基、乙基、丙基或丁基。n为1～10的自然数，x为1～3的自然数。x＝1时，R存在2个，但它们可不同。
上述通式(2)中，R为甲基、乙基、丙基或丁基。n为1～10的自然数、m为1～10的自然数。
本发明的的探针溶液中，上述探针优选是来自选自核酸、蛋白质、糖、细胞和它们的修饰物中至少一个的探针。
本发明的生物芯片是通过本发明的生物芯片制造方法制造的生物芯片，或者是使用本发明的探针溶液而制造的生物芯片，优选为在上述探针固定的上述基板上的区域上形成介由上述官能团吸附于上述基板的上述分子的单分子膜的生物芯片。
作为其他方式，本发明的生物芯片具有基板、由具有吸附于上述基板的官能团和疏水性链的分子构成且在上述基板上相互分开的多个区域上形成的单分子膜、固定于上述单分子膜形成的区域内的基板上的探针。具有上述疏水性链的分子的疏水性链，可以列举出例如烃链，其中优选为烃链的一个以上氢原子取代为卤原子的卤代烷基链，更优选为氟代烷基链。上述探针可以使用例如核酸、蛋白质、糖、细胞和它们的修饰物等。优选本发明的生物芯片的探针区域的基板表面为疏水性，探针区域以外的区域为亲水性。
首先，使用图1说明在本发明的生物芯片制造方法中，抑制配置于基板上的本发明的探针溶液的扩散和渗透的机理。图1是表示滴加到基板上的探针溶液的随时间变化的一个例子的示意图，图1的各图中，同一部分带有同一符号。图1A表示探针溶液1刚滴加到基板2上后的状况；图1B表示作为探针溶液1和基板2的接触部分的表面3的表面能量降低了的状况；图1C表示由于基板2的表面能量降低的表面3而收缩了的探针溶液4的状况。
如图1A所示，使溶解有探针以及具有疏水性链和吸附于上述基板的官能团的分子的探针溶液1与基板2接触时，如图1B所示，上述具有疏水性链和吸附于上述基板的官能团的分子吸附在上述溶液1和上述基板2的接触部分的基板表面3上，上述基板表面3的表面能量降低。因此，如图1C所示，探针溶液4在基板2的表面上被排斥而收缩，结果滴加到基板2上的探针溶液4不会在基板上扩散和渗透，而是被正确配置于上述基板2上的规定位置上。
然后，使用图2在分子水平上说明DNA探针溶液在基板上的动作。图2是表示作为本发明的一个例子的使用DNA探针时，滴加在基板上的探针溶液的分子水平的随时间变化的一个例子的示意图，图2的各图中，同一部分带有同一符号。图2A表示将含有DNA探针22以及具有疏水性链和吸附在基板上的官能团的分子23的探针溶液21刚滴加在基板24上后的状况，图2B表示在探针溶液21和基板24的接触部分上形成具有疏水性链和吸附在上述基板上的官能团的分子23的单分子膜25、和DNA探针22固定在基板上形成的26的状况，图2C表示在表面能量降低了的基板24上收缩的探针溶液27的状况，图2D表示探针溶液的溶剂蒸发后的基板24的单分子膜25、固定在基板上的DNA探针26、以及吸附于上述单分子膜25的具有疏水性链和吸附在基板上的官能团的分子28和DNA探针29，图2E表示洗涤图2D的基板后的基板24的状况。
如图2A所示，如果将探针溶液21滴加到基板24上，则如图2B所示那样，具有疏水性链和吸附在基板上的官能团的分子23吸附在基板24上并形成单分子膜25，DNA探针22也形成固定在基板24上的DNA探针26。具有疏水性链和吸附在基板上的官能团的分子23如图2F所示，其含有具有与有机分子难以发生化学反应的疏水性链的基团30和吸附于基板上的官能团20，介由该官能团20，上述分子23吸附在基板24上。DNA探针22在基板24上的固定方法根据所用基板24和DNA探针22的种类的不同而不同，如后所述，有根据化学键的、有根据物理吸附的，任何情况下都成为DNA探针22的一端被固定在基板24上、另一端能够自由运动的状态。由于上述单分子膜25，基板24的表面能量降低，其结果，如图2C所示，探针溶液27被基板24排斥而收缩。其后，如图2D所示，当探针溶液27的溶剂蒸发时，在分子23和DNA探针22的探针溶液浓度大于形成单分子膜所必需的浓度时，在探针溶液27中残存的分子成为吸附在上述单分子膜25的分子28和DNA探针29，并被层叠在单分子膜25上。这些分子，如图2E所示，可以通过洗涤除去。
使用young式说明滴加在基板表面的探针溶液由于上述基板的表面能量降低而如图1和图2所示那样随时间变化而收缩的原因。如图7所示，通常，基板72上的液体71的形状可根据作为矢量74与矢量76所成角的接触角77定义，其中矢量74表示液体71和基板72的界面能量，矢量76表示液体71和基板72的接触部分的液体表面切线方向73的液体71的表面张力，对于与表示基板72表面能量的矢量75之间的关系，下述关系式(3)成立。
cosθ＝(γS-γLS)/γL(3)上述式(3)中，θ表示接触角77的角度，γS为表示基板表面能量的矢量75的大小、γLS为表示界面能量的矢量74的大小、γL为表示液体71表面张力的矢量76的大小。
这里，上述界面能量γLS随着上述表面能量γS的减少而减少，其减少量小于上述γS的减少量(D.K.Kaelble、J.Adhesion、2卷、1970年、P66-81)。因此，如果基板的表面能量γS减少，则上述式(3)的右边减少，结果接触角θ增大。即，随着基板72上的表面能量的降低，接触角θ增大，因此液体71随时间变化而缩小。
接着，对本发明的生物芯片制造方法进行说明。本发明中，生物芯片可以通过例如下述制造方法制造，该制造方法包括调制并准备探针溶液的工序、准备基板的工序、将上述探针溶液配置在上述基板上的工序、将配置于上述基板上的上述探针溶液中的探针固定在上述基板上的工序。以下，作为本发明的生物芯片制造方法的一个例子，具体说明使用了DNA探针的DNA芯片的制造方法。但是，本发明当然并不限定于此。
(探针溶液的调制)在本发明的生物芯片制造方法中使用的探针溶液的调制中，首先对含有在上述探针溶液中的具有疏水性链和吸附在基板上的官能团的分子进行说明。
作为具有疏水性链和吸附在基板上的官能团的分子的疏水性链，没有特别限制，可以列举出例如烃链，其中优选为烃链的一个以上氢原子取代为卤原子的卤代烷基链，更优选为氟代烷基链。上述氟代烷基链在化学方面是稳定的，且与大多数的有机分子不发生化学反应。另外，氟代烷基链不与其它有机分子形成离子键和氢键，仅靠范德华力结合，该结合力在有机分子中最小。因此，有机分子更难吸附于具有氟代烷基链的分子的单分子膜上，即便吸附上了，也可以通过例如水洗等简单地除去。另一方面，作为吸附在上述基板上的官能团，可以列举出例如OH、NH2、SH、SS、COOH、SiOH、Si(OR)(R为甲基、乙基、丙基或丁基)和Si[(O-CH2CH2)m-OR](m为1～10的自然数、R为甲基、乙基、丙基或丁基)；优选为Si(OR)(R为甲基、乙基、丙基或丁基)、Si[(O-CH2CH2)m-OR](m为1～10的自然数、R为甲基、乙基、丙基或丁基)。
作为本发明中具有疏水性链和吸附在基板上的官能团的分子，优选为以下述通式(1)或(2)所示的化合物或者它们的水解物。这里所谓的水解物是指在以(1)或(2)表示的化合物中，结合于Si的OY或(O-CH2CH2)m-OR的一部分或全部变为OH的状态。
CF3(CF2)nC2H4SiR3-x(OY)x(1)CF3(CF2)nC2H4Si[(O-CH2CH2)m-OR]3(2)上述通式(1)中，R和Y各自独立地为甲基、乙基、丙基或丁基。n为1～10的自然数，x为1～3的自然数。x＝1时，R存在2个，但它们可不同。
上述通式(2)中，R为甲基、乙基、丙基或丁基。n为1～10的自然数、m为1～10的自然数。
以上述通式(1)或(2)所示的化合物或者它们的水解物由于与活性氢快速反应而形成了硅氧烷键(Si-O)，因此当在基板表面上有活性氢时，如果探针溶液和基板接触，则立刻形成具有靠硅氧烷键固定的氟代烷基链的分子的单分子膜，从而表面能量降低，能够更好地排斥探针溶液，因此优选。
上述通式(1)中，n优选为4～10。原因在于，n在上述范围时，以上述通式(1)表示的分子更易形成在基板上取向的单分子膜，且更容易减小基板的表面能量。另外，上述通式(1)中，x优选大，更优选为3。原因在于，以上述通式(1)所示的分子与基板的活性氢的反应性更高，基板的表面能量更低。上述通式(1)中，Y优选为甲基。原因在于，以上述通式(1)所示的分子与基板的活性氢的反应性更高，基板的表面能量更低。
上述通式(2)的(O-CH2CH2)m-OR基为极性基团，具有易溶解于水溶液的优点。特别是，由于大多数的探针为水溶液，因此作为溶解在探针溶液中的分子是优选的。
接着，对本发明的生物芯片制造方法中所用的探针溶液中含有的探针进行说明。作为上述探针，没有特别限制，可以使用来自于选自核酸、蛋白质、糖、细胞和它们的修饰物中至少1种的探针，例如可以使用生物来源的DNA，还可以使用合成的聚核苷酸或寡核苷酸。另外，通过化学键进行在基板上的固定时，根据需要，可以在上述探针的一端结合官能团。作为能够在与基板的固定中使用的官能团，可以列举出例如NH2、COOH、OH、PO3H和SH等，其结合方法没有特别限制，可以使用以往公知的方法。
在本发明的生物芯片制造方法中使用的探针溶液例如可以通过溶解上述具有疏水性链和吸附在基板上的官能团的分子以及上述探针来进行调制。作为在上述探针溶液中具有上述疏水性链和吸附在基板上的官能团的分子的浓度，例如为0.01～20wt％、优选为0.01～5wt％、更优选为0.01～1wt％。这种更优选的浓度是不会使探针分子改性或凝集，并且能够在基板上形成具有排斥探针溶液的疏水性链的单分子膜的值。
作为上述探针溶液的溶剂，可以使用例如纯水、含有盐类的水溶液、纯水和极性有机溶剂的混合液、或者纯水和极性有机溶剂和盐类的混合液等，其中，优选使用例如醇作为上述极性有机溶剂，作为上述醇，优选为例如乙醇。上述探针溶液的pH只要在不使探针改性的范围内即可，通常优选为5～10，更优选为6～8。
(基板的准备)接着，准备生物芯片的基板。作为在本发明的生物芯片制造方法中使用的基板，没有特别限制，例如可以使用在表面上具有活性氢的基板、玻璃、塑料、金属、陶瓷等，上述活性氢用于将上述具有疏水性链和吸附在基板的官能团的分子介由上述官能团进行固定。另外，基板的表面状态即便在平滑时也可具有凹凸、还可以是多孔质的。而且，基板可以带有刚性，也可以不带刚性而具有柔软性。作为在基板表面上存在的上述活性氢，没有特别限制，可以列举出例如-OH、-NH2、-COOH、-SO3H、-CN等。制作探针密度高的生物芯片时，优选使用平滑且具有刚性的玻璃或形成了金属薄膜的玻璃基板。
上述基板优选可通过化学键和物理吸附的至少一种将探针固定，为此优选例如对上述基板的表面实施等离子处理、紫外线照射、臭氧处理、利用具有NH2、COOH、OH、SH的硅烷偶联剂或硫醇化合物进行的表面修饰、或者它们的组合处理等。
(探针溶液在基板上的配置)接着，将如上调制的探针溶液配置在如上准备的基板上。该工序例如可以通过滴加探针溶液来进行，但优选为通过利用喷墨法的喷射装置、将上述探针溶液喷射到上述基板上来进行。其原因在于，附着的探针溶液量的微量化和位置精度优异。
上述喷墨式喷射装置例如可以使用作为喷墨式打印机而通常使用的装置。使用图3说明上述喷墨式打印机的一个例子。图3是喷墨式打印机的整体概略图。该图的喷墨式打印机31具备利用压电元件的压电效果进行记录的喷墨头32，其是使从该喷墨头32中喷出的油墨滴落在例如纸等记录介质33上进行记录。喷墨头32安装在配置于主要扫描方向X上的托架35上，随着托架35沿着托架轴34往返运动，喷墨头32在主要扫描方向X上往返运动。另外，喷墨式打印机31在与喷墨头32的宽度方向(X方向)相垂直的副扫描方向Y上具备使记录介质33相对移动的多个轧辊(移动机构)36。喷墨头32例如由具备喷射油墨的喷嘴孔的喷嘴板、从上述喷嘴中使油墨喷射的驱动部分和将油墨供给至喷嘴的部分构成。使用图4说明上述喷墨头的一个例子。图4为喷墨头的示意图，在各图中，同一部分带有同一符号。图4A为喷墨头的喷嘴孔46及其附近的剖面图，喷嘴孔46与压力室43连通，在压力室43的上部，按照顺序形成有振动板42和压电元件41。在压力室43中充满油墨，上述油墨从油墨流路45中通过油墨供给孔44被供给至压力室43中。在压电元件41上施加电压时，振动板42与压电元件41一起弯曲，压力室43的压力上升，油墨从喷嘴孔46中喷出。为了使油墨从喷嘴孔46中向一定方向喷射，优选对喷嘴孔46的表面实施疏水处理。图4B是在通过图4A的点划线40在垂直于纸面的面上截断时的立体图。图4B中，大致上仅显示了2个喷嘴孔46附近的结构，但这种喷嘴结构的数量没有特别限定，可以是2个以上，该图表示左侧的压电元件47和振动板42弯曲、油墨48从喷嘴孔46中喷射到箭头49方向上的状况。使用这种喷墨头、并使用上述探针溶液代替油墨，能够在基板上配置探针溶液。
(探针的固定)最后，将配置在基板上的探针溶液中的探针固定在基板上，由此可制造生物芯片。例如，通过物理吸附固定探针时，仅使探针溶液的溶剂干燥即可进行固定。作为上述干燥方法，可以列举出例如在室温下的常温干燥、利用干燥气体的吹拂、在40～80℃的烘箱中干燥等方法。另外，在通过化学键结合探针时，也可以进行分别相应的处置。
具体地说，例如在存在于探针分子内的NH2、COOH、OH、SO3H或SH中的任一个与存在于基板表面的NH2、COOH、OH、SiOH中的任一个之间发生化学反应，从而形成共价键。当在探针中没有能够与基板共价结合的适当官能团时，预先在探针中赋予官能团。例如，当探针和基板都具有NH2时，如果预先将基板浸渍在1～3wt％的戊二醛水溶液中，水洗、干燥后，将探针溶液滴加在基板上，则探针可以通过共价键固定在基板上。当探针和基板都具有COOH时，如果将基板浸渍在溶解有1～5wt％的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺)的水溶液中，水洗、干燥后，将探针溶液滴加在基板上，则探针可以通过共价键固定在基板上。另外，基板只要是如金、铜、银等那样，具有与带有SH或SS基团的分子结合的性质，就可以在探针分子中预先赋予SH基或SS基。
如上所述，通过本发明的生物芯片制造方法制造的生物芯片，如图2C～E等所示那样，由于在探针固定的区域上存在由具有疏水性链和吸附于基板的官能团的分子形成的单分子膜25，因此有机污染物难以附着在上述区域，而且即便污染物附着也能简单地除去，因此与现有的生物芯片相比，难以被污染。
如上所述，当具有疏水性链和吸附于基板的官能团的分子和探针的探针溶液含量大于在单分子膜形成或探针固定中所需的量时，上述分子和探针被层叠在基板上的单分子膜上(例如参照图2D)。层叠在单分子膜的上述分子将固定在基板上的探针覆盖起来，往往成为降低生物芯片的检测灵敏度的原因。此时，优选在固定探针后，用液体洗涤基板。
通过上述洗涤，能够除去吸附在上述单分子膜上的上述分子和探针(例如参照图2E)。另外，即便在上述洗涤后，由于在通过本发明的制造方法制造的生物芯片的探针区域上形成了上述具有疏水性链和吸附在上述基板的官能团的分子的单分子膜，因此难以被污染的优异效果也不会消失。
在上述洗涤中使用的液体，只要是不改性生物芯片的液体，就可以使用任何液体，例如使用纯水、缓冲溶液等。特别是，少量含有醇的水溶液容易溶解具有氟代烷基链的分子等具有疏水性链和吸附在上述基板的官能团的分子，故优选。在使用水和醇的混合溶液作为上述洗涤用液体时，醇的浓度例如为1～80wt％、优选为10～70wt％、更优选为30～50wt％。
接着，对本发明的探针溶液进行说明。本发明的探针溶液为生物芯片的探针溶液，是含有具有疏水性链和极性基团的分子以及探针的探针溶液。本发明的探针溶液可用在上述本发明的生物芯片制造方法中。
在本发明的探针溶液中，作为具有疏水性链和极性基团的分子中的极性基团，没有特别限制，例如在生物芯片的制造中使用时，优选为能够吸附在生物芯片基板上的官能团。本发明的探针溶液中，上述具有疏水性链和极性基团的分子以及探针的形态如前所述。
接着，对本发明的生物芯片进行说明。本发明的生物芯片具有基板、由具有吸附在上述基板的官能团和疏水性链的分子构成且在上述基板上相互分开的多个区域上形成的单分子膜、以及固定在形成有上述单分子膜区域内的基板上的探针。上述具有疏水性链的分子的疏水性链可以列举出例如烃链，其中优选为烃链的一个以上氢原子取代为卤原子的卤代烷基链，更优选为氟代烷基链。上述探针可以使用例如核酸、蛋白质、糖、细胞和它们的修饰物等。优选本发明的生物芯片的探针区域的基板表面为疏水性、探针区域以外的基板表面为亲水性。本发明的生物芯片可以使用上述本发明的生物芯片制造方法和/或本发明的探针溶液进行制造。
本发明的生物芯片如果使用本发明的制造方法，能够简单地制成探针区域被高密度配置的生物芯片，而且能够制成价格低廉的生物芯片。而且本发明的生物芯片难以被污染，重现性良好地且有效地与试样溶液反应。因此，根据本发明的生物芯片，例如能够提高其保存和处理等使用状况，提高测定灵敏度、测定精度，例如可以使利用了DNA芯片的基因研究、基因诊断变得更简单和简便。本发明的生物芯片可以用于例如个人基因表达模式已知的基因检测中，可以期待个人基因的特性被阐明。其结果，例如能够进行适合于个人的疾病治疗，能够进行癌的早期发现和早期治疗。
以下，对本发明的实施例进行说明。
实施例1基板的准备将大小为10mm×10mm、厚度为1mm的硼硅酸玻璃放在表面活性剂中超声洗涤后，用纯水流水洗净。之后，利用氮气吹拂除去基板上的水分，之后在110℃的臭氧氛围中照射紫外线，从而除去残留在基板表面的有机污染物。
具有氟代烷基链的分子的调制作为具有氟代烷基链的分子，使用专利文献(美国专利第5550184号说明书)中公开的那些。具体地说，如下调制。
在500ml的圆底烧瓶中放入200ml的庚烷和20ml的CF3(CF2)7C2H4SiCl3进行混合。该操作在充满了干燥氮气的手套箱中进行。在该圆底烧瓶中设置气体导入口和导出口。接着，从上述圆底烧瓶的气体导入口中导入干燥氮气，将烧瓶内保持在干燥氛围下，并用搅拌器搅拌烧瓶内的溶液，同时一点点地滴加20ml的CH3OC2H4OC2H4OH。滴加结束后，用80℃的油浴保温烧瓶并进行回流，同时持续搅拌12小时。其后，使用真空蒸发器，将烧瓶内的庚烷蒸发除去。其结果，得到纯度几乎为100％的CF3(CF2)7C2H4Si(OC2H4OC2H4CH3)3。
接着，一边搅拌2.4wt％的正十六烷基三甲基氯化铵水溶液，一边溶解合成了的上述CF3(CF2)7C2H4Si(OC2H4OC2H4CH3)3，使其浓度达到8wt％。搅拌约30分钟后，停止搅拌静置24小时，结果得到溶解有CF3(CF2)7C2H4Si(OC2H4OC2H4CH3)3和其水解物的水溶液(以下称为疏水液A)。另外，正十六烷基三甲基氯化铵起到促进CF3(CF2)7C2H4Si(OC2H4OC2H4CH3)3及其水解物在水中溶解的作用。
DNA探针DNA探针使用由下述序列(序列号1)构成的10个碱基的单链寡核苷酸(和光纯药生产)。
ATTCAGACTG(序列号1)探针溶液的调制调制溶解有20wt％的上述DNA探针和0.5wt％的上述疏水液A的水溶液，将其作为探针溶液。
DNA芯片的制作在喷墨装置中填充上述探针溶液，将4pl的液滴(液滴直径大约为20μm)以每滴500μm的间隔喷射到基板上配置为矩阵状。上述液滴的配置是固定上述喷墨装置，一边移动上述基板，一边按照溶液被喷射到规定位置的方式用计算机进行控制。在探针溶液喷射后，放置上述基板约1小时，使其干燥。另外，上述喷墨装置具有图4的示意图所示的喷墨头，上述喷墨头使用以500μm的间隔具备1列100个喷嘴孔的喷墨头。上述喷嘴孔的直径为20μm。在上述喷墨头中，振动板使用厚度为3μm的铜，压电元件使用厚度为3μm的钛酸锆酸铅(PZT)。上述PZT用真空溅射法形成，并在膜的垂直方向(001)上取向。探针溶液的喷射通过在上述压电元件上施加频率为10kHz、振幅为20V的电压来进行。
杂交反应和评价方法将在由与上述DNA探针互补的碱基序列构成的单链寡核苷酸的5’末端上结合有罗丹明的物质(此为靶)溶解在1M NaCl/50mM磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)中，使其最终浓度达到1μM。将DNA芯片浸渍在该溶液中3小时，之后，使用1M NaCl/50mM磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)洗涤上述DNA芯片，将未发生杂交反应的靶寡核苷酸除去。另外，DNA芯片在溶液中的浸渍是通过用镊子将DNA芯片基板的端部夹住，缓慢地浸渍在溶液中而进行的。
另外，上述杂交反应使用2种方法，即直接使用如上制作的DNA芯片、和在DNA芯片制作后在室内放置2天、之后用纯水洗涤的前处理后进行杂交反应。
DNA芯片上的靶荧光量测定使用图像分析装置(商品名ARGUS50Hamamatsu Photonics公司生产)进行。将杂交反应后的DNA芯片设置在倒置式荧光显微镜上，将从DNA探针的配置区域发出的荧光收集到显微镜的CCD相机中，用上述图像分析装置对其进行评价。这里，由于该荧光是由若丹明(rhodamine)产生的，因此能够确认在DNA探针配置区域上述DNA探针和上述靶相结合。
制作的DNA芯片的评价如下进行，对于(1)发出荧光的区域和(2)荧光强度这2个项目，随机选择配置了DNA探针的基板上的区域的200个点，求出在这些点上的上述(1)和(2)的值的平均值。其结果，对于上述(1)，无论有无杂交前的前处理，荧光区域都存在于约40μm的正圆内，基板上的各荧光区域全部分别距离500μm，在空间上独立。另外，对于上述(2)，进行了杂交前的前处理的DNA芯片的荧光强度与未进行上述前处理时相比，为80％。推测这是由于残存在放置了2天的DNA芯片上的污染物阻碍了靶的杂交反应。
(比较例1)除了在探针溶液中不使用上述疏水液A之外，其它与实施例1同样操作，进行DNA芯片的制作及其评价。将其结果与实施例1的结果一起示于下述表1中。
表1
如上述表1所示，比较例1的DNA芯片的荧光区域大于实施例1的荧光区域，其形状和大小各式各样。另外，比较例1的各荧光区域的大部分在空间上不独立，而是重叠。尽管探针溶液如上所述、分别以500μm的间隔喷射在基板上，但是各荧光区域的重叠仍然发生的原因认为是由于探针溶液在上述基板上扩散、从而各溶液相互接触。
另外，在杂交前进行在室内放置2天的前处理时，比较例1的DNA芯片的荧光强度为不进行前处理时的1/3倍，上述前处理导致的荧光强度的减少量说明，由于比较例1的DNA芯片比实施例1的DNA芯片大(参照上述表1)，实施例1的DNA芯片与比较例1的DNA芯片相比，难以被污染。
不进行杂交前的前处理时的荧光强度，实施例1的DNA芯片小于比较例1的DNA芯片(参照上述表1)。其原因认为是，由于实施例1的DNA探针溶液中所含的疏水液A的具有氟代烷基链的分子的影响，基板上DNA探针配置区域内的DNA探针密度降低(例如参照图2)。但是，实施例1的DNA芯片的荧光强度是充分的。
实施例2在制作DNA芯片后，用纯水和乙醇的混合溶液(体积比为8∶2)洗涤DNA芯片基板，除此之外，与实施例1同样操作，进行DNA芯片的制作及其评价。
其结果，实施例2的DNA芯片与实施例1的DNA芯片同样，探针溶液不会在基板上扩散和渗透，DNA探针被固定，并且耐污染也强。另外，无论有无杂交前的前处理，实施例2的DNA芯片的荧光强度分别比实施例1的DNA芯片大约10％。其原因认为，通过纯水和乙醇的混合溶液进行的洗涤，吸附在单分子膜上的具有氟代烷基链的分子被除去，靶和DNA探针的杂交不易进行。
实施例3将0.3ml的CF3(CF2)5C2H4Si(OCH3)3溶解在100ml的乙醇和纯水的混合溶液(体积比为7∶3)中，使用HCl将pH调到5.0，并在此溶液中溶解上述DNA探针，以使其达到20wt％，将该溶液作为探针溶液，除此之外与实施例1同样操作，进行DNA芯片的制作及其评价。
其结果，实施例3的DNA芯片与实施例1的DNA芯片同样，探针溶液不会在基板上扩散和渗透，DNA探针被固定，并且耐污染也强。
实施例4将0.3ml的CF3(CF2)5C2H4Si(OCH3)3溶解在100ml的乙醇和纯水的混合溶液(体积比为7∶3)中，使用NaOH将pH调到9.0，并在此溶液中溶解上述DNA探针，以使其达到20wt％，将该溶液作为探针溶液，除此之外与实施例1同样操作，进行DNA芯片的制作及其评价。
其结果，实施例4的DNA芯片与实施例1的DNA芯片同样，探针溶液不会在基板上扩散和渗透，DNA探针被固定，并且耐污染也强。
实施例5使用与实施例1同样的方法制作DNA芯片并进行评价。但在本实施例中改变用于进行杂交反应的基板在溶液中的浸渍方法，研究其影响。即，使用浸渍装置，按照DNA芯片基板的面方向与试样溶液的液面相垂直的方式，以规定的速度(0.1mm/s～10mm/s)将基板浸入在液体中。在基板完全浸渍在溶液中后在液体中放置3个小时，进行生物芯片上DNA探针与试样溶液中靶分子的杂交反应。其后，以10mm/s的速度将基板从液体中提起并洗涤。与实施例1同样，DNA芯片的评价是对(1)发出荧光的区域和(2)荧光强度这2项目进行的。其结果与下述比较例2的结果一起示于下述表2中。
比较例2作为比较例2，制作使用固定了DNA探针的区域以外为疏水性的DNA芯片来代替实施例5的DNA芯片，除此之外，与实施例5同样评价。该DNA芯片是利用作为通过喷墨法滴加DNA探针溶液时的防渗对策而早就提出的方法进行制作的。该DNA芯片的制造方法如下所示。
用与实施例1同样的方法，在洗涤了的钠钙玻璃基板上，利用光刻法以500μm的间隔按照矩阵状配置直径为40μm的圆形阳性抗蚀剂图案。接着，将该基板浸渍在溶解有1vol％的CF3(CF2)7C2H4Cl3的正十六烷和氯仿的混合溶液(体积比为4∶1)中1小时，之后用氯仿洗涤。该操作在干燥氮气氛围的手套箱中进行。通过该操作，CF3(CF2)7C2H4Cl3化学键合在未形成抗蚀剂的基板上，形成单分子膜。其后，使用丙酮洗涤基板，剥离抗蚀剂。结果，在基板上形成以500μm的间隔排列为矩阵状的直径为40μm的亲水性圆形区域和包围该圆形区域的疏水性区域。接着，与实施例1同样，通过喷墨法在亲水性区域上配置DNA探针溶液。配置时，预先按照溶液仅被滴加在亲水性区域上的方式调整基板和喷墨头的位置，通过计算机，根据基板和喷墨头的相对位置变化将溶液喷出。其后，将基板在室温下放置约1小时，进行干燥。
实施例5和比较例2的结果示于下述表2中。
表2
如上述表2所示，在实施例5中，对于所有的浸渍速度(0.1mm/s～10mm/s)，发出荧光的区域存在于直径为40μm的圆内，分别距离500μm而在空间上独立。另外，从各圆区域中发出的荧光强度相同。而且，平均荧光强度与浸渍速度无关，是一定的。
在比较例2中，对于所有的浸渍速度，发出荧光的区域也存在于直径为40μm的圆内，分别距离500μm而在空间上独立。可以推测这是由于形成探针的区域以外为疏水性，因此滴加在该区域的探针溶液不会向疏水性区域扩散和渗透。当浸渍速度为0.5mm/s以下时，从每个圆区域发出的荧光强度相同。另外，与浸渍速度无关，平均荧光强度为一定。平均荧光强度大于实施例5的平均荧光强度。这认为是由于在比较例2中，因为在圆内区域没有具有氟代烷基链的分子，所以探针密度大于实施例5的探针密度，从而杂交的靶分子的量变大。另一方面，浸渍速度为2mm/s以上时，从各个圆内区域发出的荧光强度的值随基板的位置而不同。随着浸渍速度的增加，荧光强度的平均值有减少的趋势。这意味着，随着浸渍速度的增加，在DNA芯片上杂交的靶分子的量减少。
实施例6即便基板在试样溶液中的浸渍速度增加，在实施例5的DNA芯片上杂交的分子的量也没有变化，但在比较例2的DNA芯片上杂交的分子的量减少。为了研究其原因，对于实施例5和比较例2的DNA芯片，目测观察浸渍在溶液中的基板表面状态。
实施例5的DNA芯片无论是何种浸渍速度，在浸渍在溶液前和浸渍在溶液时的状态的基板表面之间，均未观察到变化。比较例2中，在浸渍速度为0.5mm/s以下时也未观察到变化。但比较例2中，在浸渍速度为2mm/s以上时，可观察到浸渍在溶液中的基板表面上吸附了很多气泡。而且，该气泡的数量和大小随着浸渍速度的增大而增大。由这些结果可推测如下内容。即，在比较例2中，浸渍速度快时，吸附在基板上的气泡的一部分覆盖了DNA探针，在此处探针和靶分子的杂交难以发生。由于随着浸渍速度变大吸附的气泡数量和大小增大，因此被气泡覆盖的探针区域也增大，不能杂交的探针的区域也增大。由此，如上述表2所示可推测，在比较例2中，随着浸渍速度的增大，平均荧光强度降低。另外，由于气泡稀疏地不均匀地附着在基板上，因此不均一地形成杂交反应进行的场所和不进行的场所，荧光强度随位置不同而不同。
这样，实施例5中即便浸渍速度大气泡也不吸附在DNA芯片基板表面上、而比较例2在浸渍速度大时气泡附着，推测是由于两者中疏水区域面积占基板整体的比例有所不同。在DNA芯片基板上，固定了探针的区域所占的面积小于除此以外的面积。因此，在实施例5中，DNA芯片基板的大部分为亲水性，与此相对，比较例2中大部分为疏水性。因此，可以推测在将基板浸渍在试样溶液中时，比较例2与实施例5相比，气泡更易吸附。
综上所述，本实施例的生物芯片由于未形成DNA探针的区域为亲水性，因此在将基板放入在试样溶液中时，气泡难以吸附在基板表面上，能够重现性良好地与靶分子发生杂交反应、并重现性良好地检测靶分子。
如上说明，根据本发明的制造方法，能够简单地制造抑制探针溶液在基板上的扩散和渗透，将DNA探针固定，并高密度配置探针区域的生物芯片，因此能够制造例如价格便宜的生物芯片。另外，通过本发明的制造方法制造的生物芯片难以被污染，重现性良好且有效地与试样溶液反应，因此其保存和处理等使用状况良好，测定灵敏度和精度高。即，根据本发明例如能够更加普及生物芯片。这样，本发明在例如使用了生物芯片的基因研究、基因诊断、基因治疗、基础医学、临床医学等范围广泛的领域内是有用的。
序列表纯文本序列号1 DNA芯片用DNA探针序列表序列表<110>松下电器产业株式会社<120>生物芯片的制造方法、探针溶液和生物芯片<130>P037955<150>Japan Application No.2004-077002<151>2004-03-17<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>10<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>DNA probe for DNAchip<400>1attcagactg
权利要求书(按照条约第19条的修改)1、一种生物芯片的制造方法，其包括准备探针溶液的工序、准备基板的工序、在所述基板上配置所述探针溶液的工序、以及将配置的所述探针溶液中的探针固定在所述基板上的工序，其中，所述探针溶液含有具有疏水性链和吸附在所述基板上的官能团的分子以及探针。
2、如权利要求1所述的生物芯片的制造方法，其中，所述疏水性链为卤代烷基链。
3、如权利要求1或2所述的生物芯片的制造方法，其中，所述疏水性链为氟代烷基链。
4、如权利要求1～3中任一项所述的生物芯片的制造方法，其中，吸附在所述基板上的官能团选自OH、NH2、SH、SS、COOH、SiOH、Si(OR)(R为甲基、乙基、丙基或丁基)和Si[(O-CH2CH2)m-OR](m为1～10的自然数，R为甲基、乙基、丙基或丁基)。
5、如权利要求4所述的生物芯片的制造方法，其中具有所述氟代烷基链和吸附在所述基板上的官能团的分子为以下述通式(1)或(2)所示的化合物或者它们的水解物，CF3(CF2)nC2H4SiR3-x(OY)x(1)CF3(CF2)nC2H4Si[(O-CH2CH2)m-OR]3(2)上述通式(1)中，R和Y各自独立地为甲基、乙基、丙基或丁基；n为1～10的自然数；x为1～3的自然数；x＝1时，R存在2个，但它们可以不同，上述通式(2)中，R为甲基、乙基、丙基或丁基；n为1～10的自然数；m为1～10的自然数。
6、如权利要求1～5中任一项所述的生物芯片的制造方法，其中，所述探针溶液在基板上的配置是通过滴加或利用喷墨法的喷射来进行的。
7、如权利要求1～6中任一项所述的生物芯片的制造方法，其中，在将所述探针固定在所述基板上后，还进一步包括用液体洗涤所述基板的工序。
8、如权利要求1～7中任一项所述的生物芯片的制造方法，其中，所述探针是来自于选自核酸、蛋白质、糖、细胞及它们的修饰物中的至少一个的探针。
9、一种生物芯片的探针溶液，其含有具有疏水性链和极性基团的分子以及探针。
10、如权利要求9所述的探针溶液，其中，所述疏水性链为卤代烷基链。
11、如权利要求10所述的探针溶液，其中，所述卤代烷基链为氟代烷基链。
12、如权利要求9～11中任一项所述的探针溶液，其中，所述极性基团选自OH、NH2、SH、SS、COOH、SiOH、Si(OR)(R为甲基、乙基、丙基或丁基)和Si[(O-CH2CH2)m-OR](m为1～10的自然数、R为甲基、乙基、丙基或丁基)。
13、如权利要求12所述的探针溶液，其中，具有所述氟代烷基链和极性基团的分子为以下述通式(1)或(2)所示的化合物或者它们的水解物，CF3(CF2)nC2H4SiR3-x(OY)x(1)CF3(CF2)nC2H4Si[(O-CH2CH2)m-OR]3(2)上述通式(1)中，R和Y各自独立地为甲基、乙基、丙基或丁基；n为1～10的自然数；x为1～3的自然数；x＝1时，R存在2个，但它们可以不同，上述通式(2)中，R为甲基、乙基、丙基或丁基；n为1～10的自然数；m为1～10的自然数。
14、如权利要求9～13中任一项所述的探针溶液，其中，所述探针是来自于选自核酸、蛋白质、糖、细胞及它们的修饰物中的至少一个的探针。
15、一种生物芯片，该芯片是通过权利要求1～8中任一项所述的生物芯片的制造方法或者使用权利要求9～14中任一项所述的探针溶液而制得的。
16、一种生物芯片，该芯片具有基板、由具有吸附在所述基板的官能团和疏水性链的分子构成并在所述基板上的相互分开的多个区域上形成的单分子膜、和固定在所述单分子膜所形成的区域内的基板上的探针。
17、如权利要求16所述的生物芯片，其中，所述疏水链为卤代烷基链。
18、如权利要求16或17所述的生物芯片，其中，所述疏水链为氟代烷基链。
19、如权利要求16～18中任一项所述的生物芯片，其中，所述探针是来自于选自核酸、蛋白质、糖、细胞及它们的修饰物中的至少一个的探针。
20、如权利要求16～19中任一项所述的生物芯片，其中，在所述基板上的未形成所述单分子膜和探针的区域为亲水性。
20、如权利要求16所述的生物芯片，其中，在所述基板上的未形成所述单分子膜和探针的区域为亲水性。
权利要求
1.一种制造方法，该方法为生物芯片的制造方法，其包括准备探针溶液的工序、准备基板的工序、在所述基板上配置所述探针溶液的工序、以及将配置的所述探针溶液中的探针固定在所述基板上的工序，其中，所述探针溶液含有具有疏水性链和吸附在所述基板上的官能团的分子以及探针。
2.如权利要求1所述的生物芯片的制造方法，其中，所述疏水性链为卤代烷基链。
3.如权利要求1或2所述的生物芯片的制造方法，其中，所述疏水性链为氟代烷基链。
4.如权利要求1～3中任一项所述的生物芯片的制造方法，其中，吸附在所述基板上的官能团选自OH、NH2、SH、SS、COOH、SiOH、Si(OR)(R为甲基、乙基、丙基或丁基)和Si[(O-CH2CH2)m-OR](m为1～10的自然数，R为甲基、乙基、丙基或丁基)。
5.如权利要求4所述的生物芯片的制造方法，其中具有所述氟代烷基链和吸附在所述基板上的官能团的分子为以下述通式(1)或(2)所示的化合物或者它们的水解物，CF3(CF2)nC2H4SiR3-x(OY)x(1)CF3(CF2)nC2H4Si[(O-CH2CH2)m-OR]3(2)上述通式(1)中，R和Y各自独立地为甲基、乙基、丙基或丁基；n为1～10的自然数；x为1～3的自然数；x＝1时，R存在2个，但它们可以不同，上述通式(2)中，R为甲基、乙基、丙基或丁基；n为1～10的自然数；m为1～10的自然数。
6.如权利要求1～5中任一项所述的生物芯片的制造方法，其中，所述探针溶液在基板上的配置是通过滴加或利用喷墨法的喷射来进行的。
7.如权利要求1～6中任一项所述的生物芯片的制造方法，其中，在将所述探针固定在所述基板上后，还进一步包括用液体洗涤所述基板的工序。
8.如权利要求1～7中任一项所述的生物芯片的制造方法，其中，所述探针是来自于选自核酸、蛋白质、糖、细胞及它们的修饰物中的至少一个的探针。
9.一种生物芯片的探针溶液，其含有具有疏水性链和极性基团的分子以及探针。
10.如权利要求9所述的探针溶液，其中，所述疏水性链为卤代烷基链。
11.如权利要求10所述的探针溶液，其中，所述卤代烷基链为氟代烷基链。
12.如权利要求9～11中任一项所述的探针溶液，其中，所述极性基团选自OH、NH2、SH、SS、COOH、SiOH、Si(OR)(R为甲基、乙基、丙基或丁基)和Si[(O-CH2CH2)m-OR](m为1～10的自然数、R为甲基、乙基、丙基或丁基)。
13.如权利要求12所述的探针溶液，其中，具有所述氟代烷基链和极性基团的分子为以下述通式(1)或(2)所示的化合物或者它们的水解物，CF3(CF2)nC2H4SiR3-x(OY)x(1)CF3(CF2)nC2H4Si[(O-CH2CH2)m-OR]3(2)上述通式(1)中，R和Y各自独立地为甲基、乙基、丙基或丁基；n为1～10的自然数；x为1～3的自然数；x＝1时，R存在2个，但它们可以不同，上述通式(2)中，R为甲基、乙基、丙基或丁基；n为1～10的自然数；m为1～10的自然数。
14.如权利要求9～13中任一项所述的探针溶液，其中，所述探针是来自于选自核酸、蛋白质、糖、细胞及它们的修饰物中的至少一个的探针。
15.一种生物芯片，该芯片是通过权利要求1～8中任一项所述的生物芯片的制造方法或者使用权利要求9～14中任一项所述的探针溶液而制得的。
16.一种生物芯片，该芯片具有基板、由具有吸附在所述基板的官能团和疏水性链的分子构成并在所述基板上的相互分开的多个区域上形成的单分子膜、和固定在所述单分子膜所形成的区域内的基板上的探针。
17.如权利要求16所述的生物芯片，其中，所述疏水链为卤代烷基链。
18.如权利要求16或17所述的生物芯片，其中，所述疏水链为氟代烷基链。
19.如权利要求16～18中任一项所述的生物芯片，其中，所述探针是来自于选自核酸、蛋白质、糖、细胞及它们的修饰物中的至少一个的探针。
20.如权利要求16～19中任一项所述的生物芯片，其中，在所述基板上的未形成所述单分子膜和探针的区域为亲水性。
全文摘要
本发明的目的在于提供探针区域为高密度、且难以被有机物等污染的生物芯片的制造方法。为了达成上述目的，本发明的生物芯片制造方法包括使探针溶液附着在基板上以将探针固定在上述基板上的工序，上述探针溶液(1)的特征在于，含有探针和具有疏水性链和吸附在上述基板上的官能团的分子，如果上述探针溶液(1)吸附在上述基板(2)上，则在上述基板上形成介由上述官能团而吸附在上述基板上的上述分子的单分子膜(3)，通过该单分子膜(3)，制成上述探针溶液(1)的扩散和渗透被抑制的探针溶液(4)。作为上述疏水性链，优选为氟代烷基链。
文档编号G01N37/00GK1934447SQ200580008319
公开日2007年3月21日 申请日期2005年3月16日 优先权日2004年3月17日
发明者中川彻 申请人:松下电器产业株式会社