用于粒子处理的整体式盒的制作方法

专利名称：用于粒子处理的整体式盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种处理粒子的方法和装置，如基于预先确定的特性 分选粒子的方法和装置。
背景技术：
传统的处理粒子的系统是依靠大量分开制造并且在现场组装的单 独的、非集成的部件。这些传统的系统是笨重的，并且可能存在潜在
的污染问题。
例如，在传统的粒子分选系统中，将要分选的粒子或细胞悬浮在 液体介质中(悬浮液)，该悬浮液通过一系列的贮存器、管、腔室、 喷嘴和/或接头(在本文中统称为"流体接触表面")。在传统的高速光 学分选器中，悬浮液在被捕获在目标腔室中之前通过喷嘴并且形成微 滴流(气溶胶相)。微滴流(气溶胶)接触或污染该系统内未对该微 滴流确切密封的任何区域，因为难以用其他方式保证散乱的或不当形 成的气溶胶不会向各个方向飞溅。为此，未对气溶胶相确切密封的所 有表面都被认为是"流体接触表面"的部分。
在使用粒子分选和其他粒子处理的许多应用中，特别是在临床应 用或临床前研究中，确保"操作者分离"和/或"产物分离"是非常重要 的。操作者分离是指保护操作者以免其接触粒子悬浮液，例如，在悬 浮液内可能存在传染病病原体时。产物分离是指悬浮液与该悬浮液外的微量污染(包括环境污染或已经通过该分选系统的原有悬浮液的污 染)分离。
为了提供操作者分离，传统的分选系统和其他粒子处理系统需要 在密封环境腔室中操作。但是，这些类型的系统难以进行手动操作。 为了确保产物分离，传统系统需要更换或清洗所有流体接触表面，拆 卸、清洗或更换传统流体接触表面所需的手动步骤具有破坏操作者分 离的危险。

发明内容
本发明提供了一种一次性的整体式盒，其用于对粒子进行处理， 如粒子分选，其中封装了所有的流体接触表面，供微流粒子处理技术 使用。流体接触表面的封装确保、改进或促进了操作者分离和/或产物 分离。该盒可以使用任何适合的技术处理粒子。
根据本发明的第一方案，用于对样品进行处理的整体式粒子处理 盒包括这样一种整体式粒子处理盒，在其上形成有用于处理样品的粒 子处理部件和封装在该整体式粒子处理盒中的多个流体接触表面。该 整体式粒子处理盒中的所有流体接触表面都被封装且相对于外部环境 密封。
根据本发明另一方案，粒子分选系统包括整体式盒，在盒上形
成有粒子分选部件；位于粒子分选部件上游、用于为粒子分选部件提 供待分选的粒子的粒子源；用于提供悬浮粒子的鞘流体的鞘流体贮存 器；和位于粒子分选部件下游、用于收集分选后的粒子的保持室。
根据本发明的又一方案， 一种处理样品的方法，包括将整体式粒 子处理盒插入操作机器中和指示该操作机器对密封在该整体式粒子处 理盒内的样品进行处理的步骤。
在另一方案中，粒子处理系统包括包括用于对多个样品进行平 行处理的多个微通道和处理工具的粒子处理芯片，含有对粒子处理芯 片提供物质和从粒子处理芯片接受物质的多个腔室和流体路径的盒， 用于将粒子处理芯片安装到盒上以使该盒的腔室和流体路径与微通道
流体连通的支架，和用于从微通道接收和聚集已处理的样品的多个聚 集管。
在又一方案中，用于对样品进行处理的整体式粒子处理盒包括这
样的整体式粒子处理盒，在其上形成有用于处理样品的粒子处理部 件；封装在整体式粒子处理盒中的、包括至少一个流体室和至少一个 流体路径的多个流体接触表面，其中该整体式粒子处理盒中的所有流 体接触表面都被封装且相对于外部环境密封；和用于对储存在该盒腔 室中的样品进行处理的化学试剂。
根据本发明的另 一 方案，提供了用于对样品进行处理的整体式粒 子处理盒，其包括这样的整体式粒子处理盒，在其上形成有用于处 理样品的粒子处理部件；封装在整体式粒子处理盒中的、包括至少一 个流体室和至少 一个流体路径的多个流体接触表面，其中整体式粒子 处理盒中的所有流体接触表面都被封装且相对于外部环境密封；和用 于对样品进行基于珠子的排除或检测的珠子，其中所述珠子储存在该 盒的第一腔室中。
在本发明的另一方案中，提供了一种处理样品的方法。该方法包 括以下步骤提供密封的整体式粒子处理盒，将该密封的整体式粒子 处理盒放入生物安全拒中，其中该密封的整体式粒子处理盒中装有待 处理的样品和用于对样品进行处理的处理工具。然后，将密封的整体
式粒子处理盒插入操作机器中。操作该操作机器，利用处理工具实现 对密封在整体式粒子处理盒中的样品的处理。然后，从操作机器中取
出密封的整体式粒子处理盒，并且在生物安全柜中，将已处理的样品 从密封的整体式粒子处理盒中取出。


图1示出了现有技术的粒子分选系统。
图2示出了根据本发明一种示例性实施方式的用于粒子处理的整 体式盒。
图3示出了根据本发明一种示例性实施方式的用于粒子分选的整 体式盒。
图4示出了本发明一种实施方式的整体式粒子分选盒，其包括聚 集过滤器。
图5示出了本发明另一实施方式的整体式粒子分选盒，其包括用
于控制液位和/或鞘流体浓度以及提供鞘再循环的泵和过滤器。
图6A至6D是用于粒子处理的整体式盒的一种实施方式的CAD图。
图7示出了本发明另一实施方式的整体式粒子处理盒的一种实施 方式，其包括用于过滤从循环贮存器开始的再循环管线的截留过滤器。
图8示出了本发明的整体式粒子处理盒的另一实施方式，其包括 基于泵的上清液再循环部件。
图9示出了本发明另一实施方式的整体式粒子处理盒，其包括基 于泵的上清液再循环部件。
图10示出了一种整体式粒子处理盒，其包括使用空心纤维和泵 的气动上清液再循环系统。
图UA至IIC示出了根据本发明一种应用与多孔板集成的整体式 粒子处理盒。
图12A至12D是本发明示例性实施方式的整体式粒子处理盒原 型的照片。
图13示出了用于处理粒子的整体式粒子处理盒的另一应用，其 中该盒系统允许在芯片外聚集已处理的样品。
具体实施例方式
本发明提供用于对样品进行包括粒子分选在内的粒子处理的整体 式盒。下面将参照示例性实施方式描述本发明。本领域技术人员将会 理解本发明可以在大量不同的应用和实施方式中实现，其在应用中不 具体限定于这里描述的特定实施方式。
本文使用的"盒"是指连接在一起成为单个整体式物体，并且能 够作为 一个整件运输或移动的多个腔室和/或流体路径。盒中的至少某 些部件(如腔室)可以刚性连接，而另外一些部件(如连接腔室的通 道或管)可以柔性连接。
本文使用的术语"微流"是指处理、加工、喷射和/或分析流体样 品的系统或装置包括至少一个具有微尺度大小的通道。本文使用的术 语"通道"是指在介质中或通过介质形成的通路，其可使流体(如液体 和气体)运动。术语"微通道"是指优选在微流系统或装置中形成的通
道，其纟黄截面尺寸为大约1.0 nm至大约250 优选大约25 pm至 大约150 jLim，最好为大约50 iam至大约100 |am。本领域技术人员能 够确定微通道的适当的体积和长度。范围包括上述数值作为上限或下 限。微通道可以具有任何选择的形状或排列，例子包括线性或非线性 构造和U形构造。
图1是现有技术的传统粒子分选系统中流体接触表面系统的总 图。如图所示，传统系统10包括细胞源12和鞘流体贮存器14,它们 用于建立被悬浮粒子的良好的中心流动。管16、 18将细胞源12和鞘 流体室14连接到分选喷嘴20上。微滴的气溶胶相区22由分选喷嘴 20产生，然后是一个或多个捕获室24a、 24b (标为保持室1或保持室 2),选择的细胞或粒子亚组被引到捕荻室24a、 24b中。
在图1的传统的分选系统10中，流体接触表面至少包括七个不 同的部件，以及邻接气溶胶相区22的所有表面，因为在开始流动或 流动阻断事件过程中，微滴能够以所有方向飞溅。在这种类型的传统 系统10中，必然地，"保持"室24a、 24b必须是开放腔室才能获得微 滴。开放腔室可能会引入或产生污染或者操作者可能会接触腔室内的 材料。利用通过这些贮存器上的外孔(未示出)施加的气压可以驱使 流体离开细胞源12和鞘流体贮存器14。压力孔可以用无菌过滤器锁 住，无菌过滤器是另外将要清洗或处理的物体。
传统分选系统10的部件一般是分开的可动元件，并不彼此密封 或相对于环境密封。分开的部件也不在同一基座上建立。
在整个本申请中，整体式粒子处理盒的不同实施方式的类似部件 用类似的标号标出。
图2示出了用于对样品进行处理的根据本发明示例性实施方式的 粒子处理盒100,其封装了多个、优选所有的流体接触表面。示例性
整体式粒子处理盒100可以设计为对样品进行任何合适的处理或多重
处理。优选地，整体式粒子处理盒对样品进行微流处理。该盒可以包
括一个或多个粒子处理子系统110,该粒子处理子系统110能对加入 盒100中的样品(如悬浮液)施加一个或多个单元处理。粒子处理子 系统110可以单独地插入盒100中并且可以从中取出，或者可以集成 到盒基座上。例如，盒基座中可以形成凹槽或腔室来接纳粒子处理子 系统110。可以引入整体式盒100内的单元处理的一些例子包括但不 限于粒子的温育或染色，粒子的洗涤，包括对上清液进行纯化的变化 形式，悬浮液中的粒子的加热或冷却，细胞或其他粒子与化学物质或 珠子的混合，粒子的基于大小的过滤，悬浮液中的粒子亚组的减除或 富集，粒子的分选，以及本领域公知的其他合适的处理。
理想的是，为了使用本发明示例性实施方式的整体式盒100准备
粒子，如用于研究或临床应用的细胞，使用者将"源"例如细胞悬浮液
通过样品加入口 102加入盒中，使用处理子系统IIO操作该盒，并在 结束时在可能的条件下通过处理样品出口 106取出最终产物。如果诸 如鞘流体、溶液、混合的悬浮液、磁珠等处理工具是必要的，则可以 通过处理工具加入口 104将处理工具加入盒100内，并4诸存在处理工 具源114中。可^,代的，用一个口既作为样品加入口又作为处理工具 加入口。可以利用提取口 108获得处理子系统UO的副产物。
也可以在上述口和子系统110之间i殳置多个腔室。优选地，至少 一些腔室彼此刚性连接，形成整体式盒100。如图所示，示例性盒 110包括用于储存待处理的样品的样品加入室112，这些样品可以通 过样品加入口 102提供。样品加入室112通过流体路径116与处理子 系统IIO流体连通。处理工具加入室114可以〗诸存通过处理工具加入 口 104提供的处理工具。流体路径118将处理工具加入室112与粒子
处理部件110流体连通。已处理样品室，标为"保持室，，124a，储存由 处理子系统110处理过的样品，并且可以通过流体路径126与粒子处 理部件110流体连通。样品输出口，如^是取口 106，可以用来从已处 理样品室中取出样品。副产物输出室，标为"副产物室"124b,可以储 存使用子系统处理产生的副产物，如在分选系统中未选择的粒子，或 用于另一处理的副产物溶液，可以利用另一流体路径128将该副产物 从粒子处理部件110提供给副产物输出室124b。与流体路径连通的多 个气孔101、 103、 105和107施加压力，促使流体通过盒流动。另 外，根据进行处理的类型，盒中可以设置多个另外的孔、腔室和流体 路径。
可以用本发明示例性实施方式的整体式盒IOO进行多种处理。例 如，本发明示例性实施方式的整体式粒子处理盒可以用来进行粒子的 温育或染色。例如，在使用整体式粒子处理盒的一种应用中，悬浮液 可以与含有荧光团标记的抗CD4小鼠抗体的溶液混合并温育，以便选 择性地标记在其表面上表达CD4的细胞。
在另一应用中，整体式粒子处理盒100可以用于洗涤悬浮液中的 粒子，包括对上清液进行纯化的变化形式。例如，在如上所述的温育 后，可能需要除去未结合的抗体，以使未结合的荧光团不干扰鉴定 CD4阳性细胞的光学手段。通过将悬浮液从最初的腔室通过过滤器泵 送以分离细胞与上清液，可以在整体式粒子处理盒100中进行悬浮液 中粒子的洗涤。然后，被提取的细胞可以回到最初的腔室中，同时上 清液通过盒中含有结合的蛋白A或抗小鼠抗体的另一腔室，以在将纯 化的上清液加回到最初腔室中之前沉淀上清液中剩佘的任4可抗体。这 种处理可以通过盒继续循环，直到从上清液中充分除去未结合的抗 体。
在另一应用中，整体式粒子处理盒100可以对加入其中的悬浮液 进行加热和/或冷却。例如，操作机器可以给盒提供加热和/或冷却垫 或区域，使盒的每个腔室或区域可以保持在不同温度下，或者使其温
度在整体式粒子处理盒的操作过程中改变。可以使用任何合适的手段 来控制整体式粒子处理盒的选择的腔室或区域内的温度。
在另一应用中，整体式粒子处理盒100可以进行诸如细胞的粒子 与化学物质、珠子或另一物质的混合。例如，盒100的第一腔室中的 细胞悬浮液可以被泵送或驱送到容纳有化学物质、珠子或含化学物质 或珠子的溶液的第二腔室中。第二腔室可以容纳有可由操作机器通过 磁性或机械方式驱动的转子或搅拌棒，用来增强或控制混合。
在另一应用中，整体式粒子处理盒100可以对粒子如细胞进行基
于大小的过滤。例如，盒的第一腔室中的细胞悬浮液可以被泵送通过 过滤器进入第二腔室中，该过滤器只允许小于某一大小的细胞或粒子 流入第二腔室中。这一操作在第二腔室中产生大小确定的细胞亚群。
在另一应用中，整体式粒子处理盒100可以进行;兹i朱细胞亚组减
除或富集。例如，盒的第一腔室中的细胞悬浮液可以被泵送到含有用
抗-CD4抗体包被的磁珠的第二腔室中，使在其表面上表达CD4的细 胞将与珠子结合。在第二腔室中混合后，用外部操作机器对整体式粒 子处理盒中的第二腔室施加磁场。磁场使珠子和与珠子结合的任何细 胞沉淀到第二腔室的壁上。然后，悬浮液中的液体和剩余的细胞被泵 送到盒中的第三腔室中，第三腔室于是含有减除了表达CD4的细胞的 群体。然后可以向第二腔室中加入液体以释放磁体，从而使与珠子结 合的细胞(与珠子一起)回到悬浮液内。在与珠子结合的细胞被悬浮 后，可以将产生的悬浮液泵送到盒上的第四腔室内，该第四腔室于是 含有表达CD4的细胞富集的细胞群体。
本领域技术人员应当知道，本发明不限于磁珠细胞亚组减除或富 集，而是可以包括减除或富集珠细胞亚组的任何合适的处理。例如， 在整体式粒子处理盒的一种应用中，可以将第一腔室中的细胞悬浮液 泵送到含有大乳胶珠子的第二腔室中，该珠子的直径优选大于50微 米，并且用抗-CD4抗体包被，使在其表面上表达CD4的细胞将与珠 子结合。在细胞悬浮液与珠子在第二腔室中混合后，将产生的悬浮液 通过大小分离过滤器泵送到第三腔室中，该大小分离过滤器允许小于
40微米的粒子通过，并且使较大的凝块循环到第二腔室中。第三腔室
于是含有表达CD4的细胞被减除的群体。如果随后向第二腔室中加入 含有破坏珠子和抗-CD4抗体之间结合的化学物质或酶的液体，则结 合的细胞可以重悬浮，悬浮液可以被泵送到第四腔室中，第四腔室于 是含有表达CD4的细胞被富集的细胞群体。
根据另一应用，整体式粒子处理盒100可以用来进行产物或物质 的释放检测。例如，盒中的过滤器可以截留流经该过滤器的样品中感 兴趣的产物或物质，如细菌。然后可以从过滤器中收集被截留的细菌 进行检测。
整体式粒子处理盒100在盒中可以包括多个样品处理子系统 110。例如，两个或多个样品处理子系统110可以串联设置在盒中，
以允许连续的样品处理。连续处理子系统之间的富集区可以重新设置
处理之间的样品参数。两个样品处理阶段110之间的合适的富集区的 一个例子见美国申请No. 10/329,008,该申请的内容引入本文作为参 考。例如，富集区可以由设置在盒上的样品处理子系统之间的过滤器 形成。
根据另一实施方式，整体式粒子处理盒可以用于粒子分选。示例 性的盒200进行细胞分选，但是本领域技术人员应当知道，盒200也 可以对任何类型的粒子进行分选。图3示出了根据本发明的示例性实 施方式的整体式粒子分选盒200，其包括在没有气溶胶相的情况下分 选粒子的基于微流的分选部件120。在分选部件120的上游，盒200 包括用于储存待分选的粒子的细胞源112,储存促进分选过程的鞘流 体的鞘流体源114，用于细胞源的无菌过滤气孔101,用于细胞源的 样品加入口 102，用于鞘流体的无菌过滤气孔103,和用于鞘流体贮 存器114的流体加入口 104。气孔IOI、 103施加压力，导致或促4吏流 体流动通过盒。作为管116和U8示出的通道将细胞源112和鞘流体 贮存器114分别连接到分选部件120的入口。在分选部件120的下 游，盒包括用于收集分选后的粒子的保持室124a、 124b，管126、 128将分选部件120的出口连接到保持室124a、 124b上。该盒还包括:
分别对应于各自的保持室124a、 124b、用于从各自保持室中提取收集 的流体的拔_耳又口 106、 108和无菌流体气孔105、 107。该盒处理通过 该系统的相对大量(0,1ml至5000ml的悬浮液)和相等或4交大体积的 鞘流体，并输出到输出室124a、 124b内。
装置。合适的细胞分选装置的例子包括如美国专利6,808,075和美国 专利申请序列号10/329,008和10/664,587所述的微流分选芯片，该专 利和申请的内容引入本文作为参考。但是，本发明不限于使用这些参 考文献中描述的细胞分选部件。
分选部件120可以单独制造、保存和/或运输，然后插入到盒基座 200内，乂人而形成灵活的连4妄。或者，分选部件120可以整体地和刚 性地在盒基座200上形成。
如图所示，从细胞源U2或鞘流体贮存器114到分选部件120和 从分选部件到保持室124a、 124b的流体连接可以用单管或管阵列形 成。形成流体路径的管可以具有任何合适的直径。
本发明的整体式粒子处理盒的一种实施方式，例如图2所示的整
体式粒子处理盒100或图3的整体式粒子分选盒200,具有在细胞或
粒子分选系统的操作中得到改进的几种性质。例如，大多数并且优选
为全部流体接触表面都构建在一个物体("盒，，)内。可以通过一次梯:
作将包括所有流体接触表面的整体式盒插入处理仪器(含有悬浮液从 不会接触的分选用光学器件、电子器件、控制软件和其他子系统的平
台)内。整体式盒也可以在一次操作使用后处理掉。该盒可以在组装 后立即灭菌。该盒可以以无菌的、现成的形式提供给使用者。对每个 盒(因此， 一次处理运行所需要的所有流体接触表面)可以给予条形 码或其它独特的标识，使作为产物污染可能来源的所有部件完全可以 被追踪。另外，在操作中不需要从盒中除去流体废物。而是，随着盒 的处理，流体废物可以一皮处理掉，而不需要单独处理流体废物。
使用本发明的整体式粒子处理盒能够提高操作者分离和产物分 离。为了使用盒进行粒子处理操作，如粒子分选，使用者可以从制造商处获取密封和无菌的盒。使用者然后可以将盒放入生物安全柜中， 如无菌层流柜中，并且进行无菌操作(以对于该类型样品的常规组织 培养的方式)，加入细胞样品和鞘流体贮存器。盒优选地在该操作之 前和之后密封。使用者将该盒置于分选仪器平台中。该系统将样品中 的细胞或粒子分选到盒内的 一个或多个保持室中。使用者从该系统上 取出盒，将盒放回生物安全拒中，通过其提取口取出已处理的样品。 使用者然后可以用安全的方式处理用过的盒和不需要的流体。可以采 取类似的步骤使用整体式粒子处理盒对样品进行其他的处理。
如图4所示，本发明一种实施方式的整体式粒子处理盒IOO，还可
以包括聚集过滤器180,用以帮助除去细胞块以及防止分选部件堵 塞。如图所示，可以向连接细胞源112和处理部件110的流体线3各 116中添加聚集过滤器180。聚集过滤器180可以包含任何合适的适 合过滤样品的材料，并可设置在盒100，中沿流体流动路径的任何位置。
如图5所示，本发明另一实施方式的整体式粒子处理盒IOO，，可以 包括用于液位/浓度控制和在使用处理部件110进行粒子处理后进行鞘 再循环的部件。示例性的盒IOO"包括分别位于各自的处理粒子室 124a、 124b下游的泵192、 194和过滤器182、 184,处理粒子室 124a、 124b接收来自处理部件的处理过的粒子。泵192、 194和过滤 器182、 184有利于液位/浓度控制和用来处理粒子的处理工具(如鞘 流体)的再循环。过滤器182、 184可以是三通流动过滤器(three-port flow filter ) ,例如，空心纤维过滤器，用于从流体^各径(即相应 的处理粒子室124)中除去流体，如鞘流体。该系统于是从处理粒子 室中除去鞘流体，从而提高了处理粒子室中收集的粒子的浓度，并且 控制各自的处理粒子室124a、 124b中的液位。
示例性的整体式粒子处理盒IOO"还包括用于再循环过滤器182、 184收集的流体的再循环部件。如图所示，可以使用再循环路径 1121、再循环贮存器191和泵190回收(再循环)过量的流体，并使 其返回到处理介质贮存器114,例如鞘流体贮存器中。再循环贮存器
191接收从过滤器182和184中除去的流体，泵19(H吏提取的流体通 过流体路径1121从过滤器182和184返回到腔室114中，以在随后 的粒子处理程序中再利用。
图6A-6D是用于粒子分选的整体式粒子处理盒200的一种实施方 式的CAD图。每个盒由贮存器盘151和贮存器盖152形成。压力系 统153包括压力入口 155、 156，其用于施加压力，促4吏流体通过流体 路径流动。泵系统154也促使流体流动且包括泵压头158， 159。流体 路径中位于分选部件120上游的过滤器157帮助防止堵塞。位于保持 室下游的浓缩过滤器182、 184帮助控制流体浓度水平，并促使鞘流 体再循环。阀191、 192、 193和194可以是luer-启动的，与细胞源、 鞘流体贮存器和保持室连接，以向盒中注射流体或从盒中取出流体。 还可以设置通风孔187、 188。如图所示，盒200具有支架122,支架 122上形成成形区或凹槽，用于接收以分选部件120表示的处理部 件，如美国专利6,808,075和美国专利申请系列号10/329,008和 10/664,587所述的分选芯片，这些专利及专利申请引入本文作为参
如图7所示，本发明另一实施方式的整体式粒子处理盒1100可以 包括用于过滤从再循环贮存器191开始的再循环管线1121的截留过滤 器1120。优选选择截留过滤器1120，以从再循环管线1121中除去选冲奪 的粒子或分子。
截留过滤器1120可以从盒1100上取下，以进一步分析上面截留的 成分。例如，在处理细胞的盒中，再循环贮存器191可以接收通过过 滤器182或184而除去储存在处理粒子室124中的粒子的上清液。在一 种应用中，可以使用除菌截留过滤器(如0.2微米过滤器)截留再循环 管线1121中的流体中的微生物。随后可以从盒上取下除菌截留过滤器 进行微生物;险测。通过这种方法，检测更加准确，并且能够反映样品 中存在的较大比例的微生物。
除菌截留过滤器也可以用来对流经截留过滤器1120的样品进行分 子清洗。 可选的是，截留过滤器1120可以包括多个珠子，用于截留样品 中的某些成分。
图8示出了^f艮据本发明用于处理细胞的整体式粒子处理盒2100的 部件的另一实施方式，其包括基于泵的上清液再循环部件。在图8的 实施方式中， 一种简单的上清液再循环系统使用空心过滤器1820和两 个蠕动泵1900、 1920。通过细胞处理系统110的细胞进入已处理样品 室124a中。含有细胞的液体通过空心过滤器1820的中心被泵送回到已 处理样品室124a中。不含细胞的液体可以通过过滤器1820的壁，因此 不含细胞的液体被驱送到再循环贮存器191中。优选使用气压口 107使 再循环贮存器191保持在大气压下，泵1900驱使液体(现在不含细 胞)进入鞘流体贮存器114中供再次使用。鞘流体由经过调节的气压 驱送到细胞处理系统中。
在示例性的实施方式中，为了将鞘流体驱送到细胞处理单元中， 整体式粒子处理盒2100系统的压力Ps相对较高。分别为已处理样品 室124a和再循环贮存器191通风的气压孔103、 105的压力均调节为 大气压。
根据图9所示的另一实施方式，包括基于泵的上清液再循环部件 的整体式粒子处理盒3100还可包括截留过滤器3180。在一种实施方 式中，截留过滤器3180可以包括能够截留病毒和微生物的0.2nm的 除菌滤网。在该情况下当使该系统循环时，越来越高百分比的液体通 过截留过滤器3180，该过滤器收集初始细胞源或鞘流体中存在的一定 百分比的任何微生物。
可替代地或者同时，整体式粒子处理盒中使用的截留过滤器3180 可以具有分子保持性质。例如，截留过滤器可以包括用蛋白G和蛋白 A包净皮的多朱子，蛋白G和蛋白A与系统驱动通过截留过滤器3180的 液体中的免疫球蛋白结合。在这种实施方式中，循环系统"清洗"能够 被适当亲和力的结合珠子截留的任何分子的液体。
使用这种截留过滤器的整体式粒子处理盒可以用几种方式使用。 例如，如果细胞处理单元IIO是简单的混合室，并且初始鞘流体含有
与FITC荧光团连接的抗-CD4小鼠抗体，则该截留过滤器可包括与珠 子结合的抗小鼠抗体和用于保持珠子的0.2^im过滤器。在这种实施方 式中，该系统用抗-CD4抗体将输入的细胞染色，然后洗涤被染色的 细胞，除去未结合的抗体。
在另一应用中，截留过滤器3180可以包括制造为大约1毫升的 可移除体积的0.2)am除菌过滤器。该截留过滤器在充分循环后截留原 始细胞体积中的任何微生物。为了检测一批人细胞中的微生物，以便 得到用于细胞治疗(骨髓移植)的细胞，可以在截留过滤器中利用一 升细胞将所有微生物浓缩为1毫升，使任何微生物的浓度都增加1000 倍。这种方法比传统微生物检测测定法更快速。
根据如图10所示的本发明另一实施方式，整体式粒子处理盒 4100可以包括^使用空心过滤器4180而不4吏用泵的气动上清液再循环 系统。盒的这种子系统具有五个腔室第一已处理样品室124a (保持 1),通过流体路径4182与第一已处理样品室124a连接的第二已处理 样品室124c (保持2)，第一再循环室4191(再循环1),第二再循环室 4192(再循环2),和鞘流体室(鞘)114。
所有腔室优选地始终处于受控压力下。所述压力可以用分别连接 到鞘流体室114、细胞处理单元110、第一已处理样品室12化、第二 已处理样品室124c、第一再循环室4191和第二再循环室4192的气压 孔4101、 4102、 4103、 4104、 4105和4106控制。通过控制腔室之间 流体路径(即管路)的流动阻力来控制流速。细胞处理单元110保持 输出压力Pc。第一已处理样品室124a处于^f氐于Pc的压力Pkl。
整体式粒子处理盒4100对于第一已处理样品室124a、第二已处 理样品室124b和第一再循环室4191具有两种流动状态。在第一种状 态时，第一已处理样品室的压力Pkl处于在第一水平，其高于第二已 处理样品室124c的压力Pk2和第一再循环室4191的压力Prl，后两 者均为0。在第二种状态时，第二已处理样品室124c的压力PK处于 第三水平，其高于第一已处理样品室Prl的压力Pkl和第一再循环室 的压力Pk2，后两者均大于O。在第一种状态时，含有含细胞液体的样品通过过滤器4180的中
心从第一已处理样品室124a向第二已处理样品室124c流动。样品上 清液通过过滤器4180的壁流动到第一再循环室4191内。
在第二种状态时，含有含细胞液体的样品从第二已处理样品室
124c向第一已处理样品室124a流动，上清液也通过过滤器的壁流动 到第一再循环室4191内。
在两种状态下，上清液优选地具有进入第一再循环室4191内的 相同流速。
位于盒4110之外的控制系统控制盒内的压力，以在第一状态和 第二状态之间变化，从而防止第一或第二已处理样品室溢流或排流。
第二再循环室4192保持低于第一再循环室4191的压力，直到克 满时为止，然后切换到高于第一再循环室4191和鞘流体室114的压 力，从而将所有液体从再循环室驱送到鞘流体室114中。然后，第二 再循环室4192恢复为低于第一再循环室4191的压力而再次充满，重 复这种鞘注射循环。优选地，止回阀4195、 4196位于流体3各径中处 于第一再循环室4191、第二再循环室4192和鞘流体室114之间用来 阻止逆流。
该系统4110没有或者具有极少的可能损伤细胞的接触表面(即 蠕动泵或其它机械泵)，因此能够提高活细胞的产率。
图IIA至IIC示出了本发明示例性实施方式的整体式粒子处理盒 的一种合适的应用。在图IIA至IIC的实施方式中，整体式盒100与 多孔板集成。图IIA是盒的剖视图，其中刚性体中的腔室和芯片 1100与盒100通过软管连接。为了运输和操作，芯片1100保持在盒 IOO上的刚性"芯片座，，IIIO中。芯片座1U0的尺寸和结构设置为接收 芯片1100并将其连接到盒上。
在示例性的实施方式中，芯片1100可以是如美国专利6,808,075 和美国专利申请序列号10/329,008和10/664,587所迷的微加工的玻璃 芯片，或在非微加工的塑料包装件(芯片保持件)内的微加工芯片的 组合，它们一起保持在刚性芯片座中，并且从该座中滑出到"操作机
器"内进行操作。 理时，芯片移动回到座1110内。
图11B示出了一种实施方式，其中芯片1100具有多个输入管
1122a-e。多孔板1140在图中示出含有四个孔，但是也可以使用更多 或更少的孔，将该多孔板1140置于或连接到盒的细胞输入室，使每 个管接收来自多孔板1140的不同孔的细胞。在该实施方式中，可以 利用压力密封板1150密封整个腔室，使得单驱动气压能够一次驱动 多个孔。
或者，密封板1150，可以放置在多孔板的孔的上方，使得每个孔 能够被分开驱动，如图11C所示。
根据一种实施方式，多孔板可以夹在整体式粒子处理盒上，使得 每个细胞获取管1122分别密封在每个孔上，并且能够分别控制每个 孔中的压力。该系统可以包括分开的气动控制管，用于提供这种分开 的控制。
在用平行芯片实现盒中的单元处理时，多孔变型盒也是非常合适 的。例如，如果芯片是96个微分选器的光学微分选器阵列，则该系 统可以将一个4敬分选器通向96孔一反中的一个孔。
图12A至12D是本发明示例性实施方式的整体式粒子处理盒的 原型的照片。如图12A和12B所示，处理芯片IIOO和芯片支架1110 可以使用软管1122连接到多腔室盒体IOO上。
图13示出了用于处理粒子的整体式粒子处理盒的另一应用。在 图13的实施方式中，盒系统1300允许在芯片外聚集已处理的样品。 示例性的芯片1310包括宽度等级为大约10 idm至400 pm的微通道阵 列。用于将芯片与盒1300连接的芯片支架1340优选包括宽度等级为 大约lOOiam至大约2毫米的腔室和管。盒1300包括宽度等级为大约 0.5mm至大约10mm的管，和体积等级为大约1毫米到大约5000毫 米的腔室。
图13仅为了说明目的示出了芯片1310的一个通道1322的剖视
芯片支架1340包括用于接收已处理样品或输入样品的聚集室或 通道1345。聚集通道1345连接到优选为相等或较大规格的流体路径 (图中以软管1360示出)，然后进入盒1300中的腔室1334中。优 选地，腔室1334的容积为大约1毫升至大约5000毫升。
可替代的，芯片支架1340上的腔室可以将芯片1310上的通道连 接到芯片支架1340上的腔室，后者然后连接到软管或其它流体路 径。多个软管然后聚集到盒中的腔室内。
图13的实施方式因此以减少堵塞的方式提供了分开处理的并行 的样品聚集。
通常，本发明示例性实施方式的整体式粒子处理盒是除了特定孔 外针对盒内或盒外液体转移密封的单个物体，这些特定孔只在特定标 准操作程序(SOP)中使用，确保它们的使用不会影响盒内部的分离或 内部样品渗漏到外部。
在一种实施方式中，整体式粒子处理盒通过放置在机器或系统 ("操作机器，，)中而运行，该机器或系统可以向盒施加致动和感测手 段，对加入到盒中的悬浮液进行一个或多个"单元处理操作"。使用盒 进行的单元处理操作可以改变悬浮液的状态，测定悬浮液的某些性 质，同时改变悬浮液的状态和测定悬浮液的选择的性质，或者对加入 盒中的悬浮液进行另外的适当的处理。适合本发明示例性实施方式的 整体式盒使用的单元处理的例子包括但不限于测定悬浮液中的细胞 数，测定悬浮液中的液体量，测定悬浮液中细胞的类型(可以是细胞 计数操作)，分选悬浮液中的细胞，收集悬浮液中的细胞亚组，加热 悬浮液中的细胞，过滤悬浮液以提高其中细胞的浓度，以及改变悬浮 液中的液体或其化学成分。
在整体式粒子处理盒上运行的操作机器可以使用电、机械、气、 光学、磁或其它本领域公知的合适的致动或感测手段来对盒中的悬浮 液进行单元处理操作。适合在本发明示例性实施方式的整体式盒的操 作机器中使用的致动或感测手段的例子包括但不限于气动手段，机 械手段，光学手段，磁手段，和电手段。为了使用气动手段致动或感
测，可以通过无菌过滤器注入空气，以将液体悬浮液从一个腔室驱动 到另一个腔室，或者通过诸如大小过滤器等部件从一个腔室驱动到第 二腔室。为了使用机械手段致动或感测，蠕动泵压头可以构建在盒 内，使得外转子可以配合到该压头内，并且通过使其旋转，将液体或 气体从一个腔室泵送到另一个腔室。为了使用光学手段致动或感测， 可以相对于盒设置光束通过盒内的微通道，以计数通过该微通道的细 胞或粒子，并且在其通向光检测器的路径上暂时阻断或散射光线。为 了使用》兹手段致动或感测，可以使旋转磁体靠近含有传统-磁力搅拌棒 的腔室，使该搅拌棒旋转并且搅拌或混合该腔室中的悬浮液。为了使 用电手段致动或感测，可以在盒内构建常规硅压力或温度传感器，它 们的电导线可以连接到外部触针上。操作机器然后可以向这些触针施 加电压并读取其电压，以使传感器工作。或者，可以使用电手段，如 果对于盒本身来说可以给予记录功能或智能功能来支持其使用或用于 操作该盒的标准操作程序，则可以在盒内构建数据存储工具，它可以 是微控制器或CPU的一部分，是数字或模拟的。这些装置的电力可 以来自于操作机器或来自于位于整体式盒内的电池或电力储存装置。 在用于对加入盒内的悬浮液进行处理的机械手段的另一实施方式中， 两个腔室可以通过管连接，该管具有一个含有软壁的区，形成阀。然 后，操作机器可以用机械板或其他适当的工具按压该区，以暂时或持 久地弯曲该区域，从而选择性地阻断液体或气体从一 个腔室流向另一 个腔室。
使用该盒可使操作机器与处理子系统和流体接触表面分离并位于 其外部。以这种方式，操作机器可以反复使用，而流体接触表面可以 是一次性的。
本发明能够定制整体式盒，以便通过只向盒内构建需要的单元处 理来优化用于任何特定细胞处理方案的盒。
对于细胞或粒子处理方案特定的或不依赖于该方案的化学试剂、 珠子和/或粒子可以在盒内储存和运输，供使用者处理。或者，在选择
的操作中使用的物质可以与盒分开运输，在中间阶段由技术人员或在 最后阶段由最终使用者插入盒中。
已经参照示例性的实施方式说明了本发明。由于在不背离本发明 范围的情况下可以对上述结构进行一定的改变，因此上述说明中包括 的或在附图中显示的所有主题都被解释为示例性的，而不是限制性 的。
还应当理解，下面的权利要求书覆盖了本文描述的本发明的所有 一般和具体特征，和由于语言问题可能被认为落在它们之间的本发明 范围的所有陈述。
权利要求
1.一种用于对样品进行处理的整体式粒子处理盒，包括整体式粒子处理盒，其上形成有用于处理样品的粒子处理部件；和封装在该整体式粒子处理盒中的多个流体接触表面，其中整体式粒子处理盒中的所有流体接触表面都被封装且相对于外部环境密封。
2. 如权利要求1所述的整体式粒子处理盒，其中多个流体接触表 面中的至少一个包括用于向所述盒中输入待处理样品的可密封的样品 输入口 。
3. 如权利要求1所述的整体式粒子处理盒，其中多个流体接触表 面中的至少 一 个包括用于将已处理的样品从所述盒中取出的可密封的 样品提取口 。
4. 如权利要求1所述的整体式粒子处理盒，其中多个流体接触表 面中的至少 一 个包括用于在处理之前储存样品的样品输入室。
5. 如权利要求1所述的整体式粒子处理盒，其中多个流体接触表 面中的至少一个包括用于在处理后储存样品的已处理样品室。
6. 如权利要求5所述的粒子分选系统，其还包括设置在已处理样 品室下游的用于从已处理样品室中取出上清液的过滤器。
7. 如权利要求6所述的粒子分选系统，其中被取出的上清液再循 环回到为处理部件提供鞘流体的鞘流体贮存器中。
8. 如权利要求6所述的粒子分选系统，其还包括用于从移出的上 清液中清除微生物的截留过滤器。
9. 如权利要求8所述的粒子分选系统，其中所述截留过滤器可从 盒中:f又下，以对上清液进行;敞生物^r测。
10. 如权利要求1所述的整体式粒子处理盒，其中多个流体接触 表面中的至少一个包括处理工具室，该处理工具室用于储存使用粒子 处理部件处理样品的处理工具。
11. 如权利要求1所迷的整体式粒子处理盒，其中所迷粒子处理 部件包括粒子分选部件，该粒子分选部件用于从样品中分选出具有预 定特性的粒子，与样品中不具有预定特性的粒子分离。
12. —种粒子分选系统，其包括 整体式盒，在其上形成有粒子分选部件；位于粒子分选部件上游的粒子源，用于为粒子分选部件提供 待分选的粒子；鞘流体贮存器，用于提供悬浮粒子的鞘流体；和 位于粒子分选部件下游的保持室，用于收集分选后的粒子。
13. 如权利要求12所述的粒子分选系统，其中所述盒封装所有流 体接触表面使其不暴露于环境。
14. 如权利要求12所述的粒子分选系统，其还包括至少一个气 孔，该气孔用于给流体路径施加压力，以促4吏流体向该系统流动。
15. 如权利要求12所述的粒子分选系统，还包括 在盒上形成的第一加入口 ，用于向鞘流体贮存器提供鞘流体； 在盒上形成的第二加入口，用于向粒子源提供粒子；和 在盒上形成的提取口 ，用于从保持室中取出至少一种粒子或流体。
16. 如权利要求12所述的粒子分选系统，在流体路径中还包括过滤器。
17. 如权利要求16所述的粒子分选系统，其中所述过滤器设置在 粒子源和分选部件之间以防止堵塞。
18. 如权利要求16所述的粒子分选系统，其中所述过滤器设置在 保持室的下游以从保持室中取出鞘流体。
19. 如权利要求14所述的粒子分选系统，其中被取出的鞘流体再 循环回鞘流体贮存器中。
20. 如权利要求12所述的粒子分选系统，其还包括设置在盒上用 于推动流体通过该系统流动的至少 一 个泵。
21. —种处理样品的方法，其包括以下步骤 将整体式粒子处理盒插入操作机器中；和指示该操作机器对密封在整体式粒子处理盒内的样品进行处理。
22. 如权利要求21所述的方法，其还包括以下步骤 将样品加入到所述盒中；和在所述将整体式粒子处理盒插入操作机器中的步骤之前，密封该盒。
23. 如权利要求21所述的方法，其还包括以下步骤 通过提取口从整体式粒子处理盒中取出已处理的样品。
24. 如4又利要求21所述的方法，其还包^fe以下步^^: 通过提取口从整体式粒子处理盒中取出废物。
25. 如权利要求21所述的方法，其中所述操作机器使用电、机 械、气、光学和磁手段之一对样品进行单元处理。
26. —种粒子处理系统，其包括粒子处理芯片，包括对多个样品进行平行处理的多个微通道和处 理工具；盒，含有对粒子处理芯片提供物质和从粒子处理芯片接受物质的 多个腔室和流体^各径；支架，用于将粒子处理芯片安装到盒上，使该盒的腔室和流体路 径与微通道流体连通；和多个聚集管，用于从微通道接收和聚集已处理的样品。
27. 如权利要求26所述的粒子处理系统，其中粒子处理芯片上的 每个微通道都具有专用的出口 。
28. 如权利要求26所述的粒子处理系统，其中所述聚集管聚集支 架内已处理的样品。
29. 如权利要求26所述的粒子处理系统，其中所述聚集管聚集盒 内已处理的样品。
30. —种对样品进行处理的整体式粒子处理盒，其包括 整体式粒子处理盒，在其上形成有用于处理样品的粒子处理部件； 封装在整体式粒子处理盒中的多个流体接触表面，包括至少 一个流体室和至少 一 个流体路径，其中整体式粒子处理盒中的所有流体接触表面都被封装，且相对于外部环境密封；和用于对储存在该盒腔室中的样品进行处理的化学试剂。
31. 如权利要求30所述的盒，其中所述化学试剂对使用粒子加工 部件进行的细胞或粒子处理方案是特定的。
32. 如权利要求30所述的盒，其中所述化学试剂不依赖于使用粒 子加工部件进行的细胞或粒子处理方案。
33. 如权利要求30所述的盒，其中所述化学试剂包括珠子用以进 行亚组的富集或减除。
34. —种用于对样品进行处理的整体式粒子处理盒，其包括 整体式粒子处理盒，在其上形成有用于处理样品的粒子处理部件；封装在整体式粒子处理盒中的多个流体接触表面，包括至少 一个流体室和至少 一 个流体路径，其中整体式粒子处理盒中的所有流 体接触表面都被封装，且相对于外部环境密封；和用于对样品进行基于珠子的减除或检测的珠子，其中所述珠 子储存在该盒的第一腔室中。
35. 如权利要求34所述的盒，其中所述珠子是涂覆有与表达CD4 的细胞结合的抗CD4抗体的》兹珠。
36. 如权利要求34所述的盒，其中所述珠子在第一腔室中与从盒 上的第二腔室施加到第 一腔室中的细胞悬浮液混合。
37. 如权利要求36所述的盒，其还包括在与珠子反应后接收细胞 悬浮液的第三腔室。
38. 如权利要求34所述的盒，其中所述粒子处理部件是基于预先 确定的特性对样品中的粒子进行分选的微流粒子分选芯片。
39. —种处理样品的方法，其包括以下步骤 提供密封的整体式粒子处理盒； 在生物安全拒中，将待处理的样品和用于对样品进行处理的处理工具加至密封的整体式粒子处理盒中；将密封的整体式粒子处理盒插入操作机器中；操作该操作机器，其中该操作机器利用所述处理工具实现对密封在整体式粒子处理盒中的样品的处理；从操作机器中取下密封的整体式粒子处理盒；在生物安全拒中，将已处理的样品从密封的整体式粒子处理盒中 取出。
40. 如权利要求39所述的方法，其中该方法包括基于预先确定的 特性分选粒子。
41. 如权利要求39所述的方法，其还包括从密封的整体式粒子处 理盒中取出废物的步骤。
42. 如权利要求39所述的方法，其中在加样之前将试剂加到密封 的整体式粒子处理盒中。
全文摘要
一种用于对粒子进行处理如粒子分选的整体式一次性盒，将所有流体接触表面封装在盒中，供微流粒子处理技术使用。该盒与操作系统通过界面连接，用于实现粒子处理。流体接触表面的封装确保、改善或促进了操作者分离和/或产物分离。该盒可以使用任何合适的技术处理粒子。
文档编号G01N15/00GK101099082SQ200580046282
公开日2008年1月2日 申请日期2005年12月5日 优先权日2004年12月3日
发明者D·博普雷, H·莱维斯, J·R·吉尔伯特, J·特里克哈, M·德施潘德 申请人:赛托诺姆公司