专利名称：环境砷污染的生物标记监测方法
技术领域：
本发明涉及的是一种环保技术的方法，具体是一种环境砷污染的生物标记监测方法，即利用细胞色素P450作为生物标记物来监测养猪场周围环境中和使用过猪粪肥的土壤环境中砷污染的方法。
背景技术：
砷是动物体必需的一种微量元素，具有多种重要作用。近年来砷制剂已成为世界各国广泛使用的饲料添加药物，促进了畜牧业的发展，取得了较好的社会经济效益。但同时大量含砷的畜禽排泄物进入环境，对环境造成了污染。其污染对象主要是养殖场周围环境和使用过猪粪肥的土壤环境。对于环境砷污染的监测，目前主要还是化学测定法，即通过检测土壤中砷的含量来了解砷污染状况。但是化学测定法有其缺陷性，仅凭含量无法反应这些污染物的生物效应。生物标记监测法则可以弥补其不足，不仅可以反应土壤污染状况，还可以反应生物的适应性，以及污染物在分子水平上的毒性效应；等等。
生物标记物(也称生物标志物)是近年来兴起的一种较新的环境监测方法，细胞色素P450(CYP450)是其中应用最广泛的一种。细胞色素P450酶系是广泛存在于各种动物、植物、和微生物等不同生物体内的一类代谢酶系，具有极其重要的生理功能。用P450酶系的诱导或抑制作用，可以作为分子水平上敏感的生物标记物，来监测污染物对土壤生态系统的影响。目前有大量关于P450用作工业污染物如多氯联苯，多环芳烃以及重金属等环境污染的生物标志物的研究报道，但尚未见其用于土壤砷污染的研究。7-甲氧基-3-异吩噁唑酮-O-脱苄基酶(MROD)是CYP450酶系中的一种，即CYP4501A2。经研究发现蚯蚓体内该酶对土壤砷污染较敏感，而且在一定范围内该酶被抑制的程度与土壤砷含量具有相关性。可以用该酶的活性变化程度来监测土壤砷污染。
经对现有技术的查新，尚未发现与本发明主题砷污染的生物标记监测方法相同或者类似的文献报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的不足，提供一种环境砷污染的生物标记监测方法，使其可以监测含砷的猪排泄物进入养猪场周围环境，或者施用于农田土壤而作为肥料后，引起的土壤砷污染。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明首先根据要监测的地点，设计土壤采样方案；然后在各个采样点采集蚯蚓，将其装入含有采样地土壤的容器中；取采得的蚯蚓，先进行清肠，然后匀浆，离心，得上清液即为所需的含P450的提取液；在荧光分光光度计中测定MROD的活性；根据MROD活性计算土壤总砷含量，从而监测土壤的砷污染程度。
所述的首先根据要监测的地点，设计土壤采样方案，具体为首先要了解监测地点的背景资料，确定污染来源与养殖场的液体排放或粪便施肥情况。前者可以先了解排出含砷制剂残留的污染源距监测点的距离，后者可以先了解监测点施肥的方案。然后确定采样的具体方法当污染为点源污染时，可在沿污染方向的不同距离布置采样点；当污染为面源污染时，可均匀布置采样点。
所述的采集蚯蚓，具体为先采集采样点的土壤，装入容器中；然后将采出的蚯蚓放入该容器中，带回实验室，以保证蚯蚓的生活环境不发生变化，实验结果更具可靠性。
所述的含P450的提取液，其具体制备为将容器中的蚯蚓取出，放在湿滤纸上，在室温下放置1至2天，以排出肠内容物；取清肠后的蚯蚓，用滤纸吸干水分，置于玻璃匀浆器中，倒入在4℃冰箱中预冷的蚯蚓匀浆缓冲液，匀浆；将匀浆液转移入1.5ml离心管中，离心30min。弃去沉淀，上清液即为所需的含P450的提取液。
所述的测定MROD的活性，具体为在荧光比色杯中加入各反应成分，浓度分别为三羟甲基氨基甲烷(Tris)100mmol/L，烟酰胺二核苷酸磷酸(NADPH)0.5mmol/L，7-甲氧基异吩噁唑酮约10μmol/L，约0.5mg蛋白的含P450的样品提取液。反应时NADPH最后加入，加入后反应立即开始。准确进行10min后，加入0.5ml甲醇中止反应，将比色杯放入荧光比色池内，在激发波长Ex为581nm，发射波长Em为593nm条件下测定相对荧光强度。用标准曲线定量。
所述的根据MROD活性计算土壤总砷含量，具体为首先建立土壤砷含量与MROD活性的关系式，此后即可根据酶活性，计算土壤砷含量，从而监测土壤的砷污染程度。
本发明通过蚯蚓体内MROD活性的测定来监测土壤砷污染状况，既可了解土壤砷污染程度，又可以了解砷污染的生化效应，以及生物体对砷污染的反应。比直接测定土壤砷含量更具有实用价值，而且灵敏度高，适于长期监测。
图1为本发明方法流程图具体实施方式
如图1所示，本发明实施例实施步骤如下1.首先了解监测地点的背景资料，确定污染来源与养殖场的液体排放或粪便施肥情况。然后确定采样的具体方法。
2.先采集采样点的土壤，装入容器中；然后将采出的蚯蚓放入该容器中，带回实验室。
3.将容器中的蚯蚓取出，放在湿滤纸上，在室温下放置1至2天，以排出肠内容物；取清肠后的蚯蚓，用滤纸吸干水分，置于玻璃匀浆器中，倒入在4℃冰箱中预冷的蚯蚓匀浆缓冲液，匀浆；将匀浆液转移入1.5ml离心管中，离心30min。弃去沉淀，上清液即为所需的含P450的提取液。
4.在荧光比色杯中加入各反应成分，使各种反应物的浓度分别达到Tris100mmol/L，NADPH 0.5mmol/L，7-甲氧基异吩噁唑酮约10μmol/L，约0.5mg蛋白的含P450的样品提取液。反应时NADPH最后加入，加入后反应立即开始。准确进行10min后，加入0.5ml甲醇中止反应，将比色杯放入荧光比色池内，在激发波长Ex为581nm，发射波长Em为593nm条件下测定相对荧光强度。用标准曲线定量。
5.首先建立土壤砷含量与MROD活性的关系式，此后即可根据酶活性，计算土壤砷含量，从而监测土壤的砷污染程度。
以下结合本发明内容提供实施例，以某养猪场周围长期施用含砷制剂残留的猪粪肥的菜地为例，监测其中的砷污染状况。
菜地常年种植蔬菜，供猪场员工食用。该猪场的饲料中含有砷添加剂，菜地以猪粪作肥料。根据菜地的大约为正方形的形状，设计了中心1个点，周围4个点共5个采样点。采集其中的蚯蚓(为白颈环毛蚓)。带回实验室测定其体内MROD的活性。此前在实验室以相同质地未污染土壤，进行人工污染实验，建立土壤总砷含量和蚯蚓体内MROD活性的关系式A蚓＝-0.038C土+10.37其中C土为土壤总砷含量，A蚓为蚯蚓体内MROD的活性，该式适用于C土在20mg/kg～200mg/kg的范围内。菜地样品蚯蚓体内此酶活性的平均值为9.24±0.85p mol/mgprotein.min(未受污染土壤中蚯蚓体内该酶的活性为48.63±1.11p mol/mgprotein.min)，则土壤总砷含量为28.74mg/kg.而远离猪场的未受洛克沙胂污染的土壤中总砷含量为8.75mg/kg，说明菜地土壤受到了高于原来自身含量3至4倍的砷污染。此结果同时表明，在砷污染的胁迫下，蚯蚓体内的P450酶受到了抑制，抑制率达81％。这有可能导致蚯蚓对其他物质代谢的改变。用该方法进行长期监测比较灵敏。
权利要求
1.一种环境砷污染的生物标记监测方法，其特征在于首先根据要监测的地点，设计上壤采样方案；然后在各个采样点采集蚯蚓，将其装入含有采样地上壤的容器中；取采得的蚯蚓，先进行清肠，然后匀浆，离心，得上清液即为所需的含P450的提取液；在荧光分光光度计中测定7-甲氧基-3-异吩噁唑酮-O-脱苄基酶的活性；根据其活性计算土壤总砷含量，从而监测土壤的砷污染程度。
2.根据权利要求1所述的环境砷污染的生物标记监测方法，其特征是，所述的根据要监测的地点，设计土壤采样方案，具体为首先了解监测地点的背景资料，确定污染来源与养殖场的液体排放或粪便施肥情况，然后确定采样的具体方法当污染为点源污染时，在沿污染方向的不同距离布置采样点；当污染为面源污染时，均匀布置采样点。
3.根据权利要求1所述的环境砷污染的生物标记监测方法，其特征是，所述的含P450的提取液，其制备为将容器中的蚯蚓取出，放在湿滤纸上，在室温下放置1至2天，以排出肠内容物；取清肠后的蚯蚓，用滤纸吸干水分，置于玻璃匀浆器中，倒入在4℃冰箱中预冷的蚯蚓匀浆缓冲液，匀浆；将匀浆液转移入1.5ml离心管中，离心30min，弃去沉淀，上清液即含P450的提取液。
4.根据权利要求1所述的环境砷污染的生物标记监测方法，其特征是，所述的测定MROD的活性，具体为在荧光比色杯中加入各反应成分，浓度分别为Tris 100mmol/L，NADPH 0.5mmol/L，7-甲氧基异吩噁唑酮10μmol/L，0.5mg蛋白的含P450的样品提取液，反应时NADPH最后加入，加入后反应立即开始；准确进行10min后，加入0.5ml甲醇中止反应，将比色杯放入荧光比色池内，在激发波长Ex为581nm，发射波长Em为593nm条件下测定相对荧光强度，用标准曲线定量。
5.根据权利要求1所述的环境砷污染的生物标记监测方法，其特征是，所述的根据MROD活性计算土壤总砷含量，具体为首先建立土壤砷含量与MROD活性的关系式，再根据酶活性计算土壤砷含量，从而监测土壤的砷污染程度。
全文摘要
一种环保技术领域的环境砷污染的生物标记监测方法。本发明首先根据要监测的地点，设计土壤采样方案；然后在各个采样点采集蚯蚓，将其装入含有采样地土壤的容器中；取采得的蚯蚓，先进行清肠，然后匀浆，离心，得上清液即为所需的含P450的提取液；在荧光分光光度计中测定7－甲氧基－3－异吩噁唑酮－O－脱苄基酶的活性；根据其活性计算土壤总砷含量，从而监测土壤的砷污染程度。本发明既可了解土壤砷污染的程度，又可以了解砷污染的生化效应，以及生物体对砷污染的反应。比直接测定土壤砷含量更具有实用价值。而且灵敏度高，适于长期监测。
文档编号G01N21/64GK1834645SQ20061002587
公开日2006年9月20日 申请日期2006年4月20日 优先权日2006年4月20日
发明者李银生, 邱江平, 陈晓斌, 曾振灵, 陈杖榴 申请人:上海交通大学