环境微生物快速检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种环境微生物的检测方法。１）微生物收集，微生物收集自空气滤网，２）微生物基因组提取，３）细菌16SrDNA扩增，真菌18SrDNA扩增，４）rDNA测序，５）数据分析，包括去污染序列、低质量序列，归并高相似度序列，序列注释；６）建立该环境细菌数据库，包含种类信息、序列信息和丰度信息；和该环境真菌数据库，包含种类信息、序列信息和丰度信息。本发明尤其适于对洁净区环境微生物进行普查，较常规基于培养的检测技术更加快捷、准确、灵敏，检测成本和时间大幅度降低，显著提高微生物污染监测和控制能力。另一方面，基因测序数据还提供了微生物分子水平的标记，对于追溯和判断微生物来源，准确识别污染源具有重要价值。
【专利说明】环境微生物快速检测方法
【技术领域】[0001 ] 本发明涉及一种环境微生物的检测方法，可提高微生物的检测范围、节省检测费用、大幅度缩短检测时间。
【背景技术】
[0002]微生物是自然界分布最广泛、数量最大的一类生物。它们个体微小、繁殖速度快、适应能力强。一些微生物经消化道入侵人体，比如说沙门氏菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌等，它们可造成胃肠道疾病，严重时会造成肝、脑、肾脏器损害，甚至死亡。而霉菌的危害在于它所产生的毒素，比如黄曲霉毒素、伏马菌素等，它们的毒性很强，具有很强的致癌性。另外，微生物及热原若通过粘膜或血管直接侵入人体，将对人体健康造成更严重、更直接的危害。因此，在食品及药品制造过程中，防范微生物污染至关重要。
[0003]目前，食品和制药工业普遍采用洁净技术对生产环境中的悬浮微粒、微生物、有毒有害气体进行控制。为同时确保洁净区人员的正常活动，亦须使空气温度、湿度及压力在适宜范围内。洁净厂房及设施的建造不但要采用不易产尘、便于清洁的建筑材料和结构，而且需对空气进行调温、调湿和净化处理，以满足规定净化级别要求。在这种条件下，生产环境中最大的产尘源和微生物污染源通常是操作人员、设备和物料。因此必须使洁净区空气往复循环、动态更新。在洁净区，净化空气一般来自房间顶部的送风口，流经操作区后，携带着人员、设备、设施和物料脱落的微粒(包括微生物)流向低压区域，最后进入回风口，补充新空气后，再次进入空调及过滤系统获得再生。这种有组织的、无紊流的空气流动方式被称为“单向流”。在回风口设置的滤网，可以拦截室内“脏”空气中悬浮的微生物，真实完整地反映洁净区微生物生态特征。洁净技术不但用于生产活动，在食品药品的检验，医疗服务、科学研究领域都有广泛应用。
[0004]洁净技术虽然能极大地降低食品药品受到微生物污染的风险，但并不是绝对的无菌环境，也不能杜绝外来微生物侵入被加工物料和产品。实际上，食品和口服药品均允许一定数量的非致病微生物残留。即便是无菌药品，在包装完成后，通常还要接受灭菌处理。只有非最终灭菌的无菌制品，才要求局部环境满足“绝对无菌”的要求。对洁净区或洁净室环境微生物进行监测不但是保证产品质量的要求，也是国家有关强制性法规的要求。洁净区实际上是一个特殊的生态环境，由于人员、设备、物料和大环境相对固定，微生物种群分布相对稳定，但也会随季节、房间消毒措施有规律地变化。了解微生物的种类及数量分布信息，掌握其变化规律，对于针对性地防范微生物污染具有重要意义。如生产环境中是否存在病原微生物；又如在处理淀粉和蛋白质含量较高的物料时，需关注是否存在某些霉菌；又如在生产热消毒产品时，需关注是否存在耐热微生物。此外，当发现产品受到特定微生物污染时，生产环境微生物监测数据将帮助技术人员找到潜在的污染源，进而采取有效的预防措施。另外在微生物检验时，环境而非样品中的微生物会造成检验结果的失真，如果有检验环境背景微生物信息(且具有分子水平的特征信息)，就能对检验结果进行甄别。
[0005]然而，我国绝大多数的食品、药品生产企业的微生物检验能力还停留在细胞水平。这些检验方法是为适应产品放行检验而建立起来的，在开展微生物污染过程控制的检验方面普遍存在能力不足的情况。同时，传统的微生物学方法只能培养环境中不超过10%的微生物，不仅检测时间长，结果准确率差，而且效率低，工作量大。虽然业界已经开发了一些全自动微生物鉴定仪器，但是它们的鉴定范围受限于已知的微生物数据库。因此传统方法不能真实揭示微生物群落的多样性。总体上看，食品药品工业对于微生物污染处于相对被动的地位，不但缺乏对微生物侵染模式(如微生物种类、数量和途径)进行调查的手段，也缺乏量化的风险评价指标。实际生产中一味采用过度消毒(灭菌)措施，不但盲目低效，而且增加了环境污染和人员安全风险。对超标产品除了报废销毁，别无它途，也难以对后续生产起到指导作用。
【发明内容】
[0006]为监测洁净区微生物的种类和数量分布情况，提供背景环境的微生物信息，本发明提供了一种基于大规模基因测序技术的环境微生物快速检测方法。
[0007]环境微生物检测方法，所述的环境为一个单向空气流向的环境，步骤如下:
1)微生物收集，所述的微生物收集自空气滤网，
2)微生物基因组提取，
3)细菌16S rDNA扩增，真菌18S rDNA扩增，
4) rDNA 测序，
5)数据分析,包括去污染序列、低质量序列，归并高相似度序列,序列注释；
6)建立该环境细菌数据库，包含种类信息、序列信息和丰度信息；和该环境真菌数据库，包含种类信息、序列信息和丰度信息。
[0008]优选地，所述的环境为需控制空气微粒和微生物污染的洁净区。
[0009]优选地，步骤I )微生物收集的方法如下:定期收取单向流空气回风口的滤网，对在空气滤网上的微生物进行洗脱后，洗脱液先经过纱布进行初级过滤，去除大颗粒干扰物，过滤液再通过0.22 μ m滤膜，最终收集滤膜及其拦截的微生物作为待检测样本。
[0010]优选地，步骤2 )微生物基因组提取的方法如下:样本按照下列方法提取微生物基因组，将收集的微生物离心沉淀后，重悬于无菌PBS中，加入50μ L溶菌酶(10 mg/mL),
6μ L 变溶菌素(25000 U/mL), 3 μ L 溶葡球菌酶(4000 U/mL),和 41 μ L ΤΕ50 溶液(10 mMTris.HCL和50 mM EDTA, pH 8.0),37° C消化一小时；然后加入0.1-mm-直径的石英砂，在振荡仪上2100转，振荡5分钟，振荡后提取DNA。
[0011]优选地，步骤3 )中，对于细菌扩增Vl到V3区域，正向引物序列AGAGTTTGATCCTGGCTCAG (SEQ ID NO I)，反向引物序列:TTACCGCGGCTGCTGGCAC (SEQ ID NO2)，
对于真菌扩V4区域，正向引物序列GGCAAGTCTGGTGCCAG (SEQ ID NO 3 )，反向引物序列:ACGGTATCTRATCRTCTTCG (SEQ ID NO 4 )。
[0012]优选地，步骤4 )中，rDNA测序，测序仪优先采用Roche454、Illumina的Miseq,Hiseq 二代测序仪。
[0013]优选地，步骤5)中，对于拼接完的序列分别提交到greengenes.lbl.gov上的NAST和Bellerophon 3比对程序，和www.ncb1.nlm.nih.gov上的Nt/Nr库比对，过滤掉比对污染序列，剩余的序列利用BLAST软件和Greengenes数据库中已知的16S/18S序列数据库进行比对，一致性在95%以上的序列注释为相应的系统群，不满足的则为新的系统群；BLAST序列比对的具体判断标准为(a)与某种系的代表参照序列相比，未知菌株序列的相似性> 99%，未知菌株鉴定为该种；(b)与某种系的代表参照序列相比，未知菌株序列的相似性> 97%，但〈99%，未知菌株鉴定为该属；(c)如未知菌株序列相似性< 97%，未知菌株不能鉴定为该种或属；(d)如存在两个或两个种系以上参照菌株与未知菌株序列相似性^ 99%，且两者相似性相差< 0.5%，则暂将未知菌株归为其中相似性较高种系，但不排除未知菌株为另一种的可能性。
[0014]优选地，相对于所述步骤I )搜集的微生物的对照样本的收集方法，利用细菌、真菌培养基，收集了该环境各个角落的微生物，包括沉降菌和悬浮菌，将所有的培养基的微生物混合后作为对照样本；同时,平板收集的微生物样本既可以作为对滤网收集的微生物进行有效性评估，还可以增加微生物的检测范围；滤网收集可以在72小时内得到结果，包括可培养和不可培养的微生物，平板收集晚于滤网收集但得到的菌种可以做进一步分析和保藏。
[0015]本发明的有益效果:在食品和药品制造行业，目前仍采用传统的基于培养的微生物监测方法。菌物采集主要依靠定量空气浮游菌采样法、沉降菌法和表面取样法，需要在洁净区多个位点及多个时间采样。然后分别用适于细菌和真菌生长的培养基进行培养，要经历疒14天的时间，才能通过菌落数量评价环境质量。这样的监测方式不但繁琐、复杂，而且对正常生产会产生影响，检验结果也显著滞后，且不能精确提供微生物种类信息。
[0016]本发明提出的基于大规模基因测序技术的环境微生物集群分析方法，尤其适于对洁净区环境微生物进行普查，如用于药品及食品生产和检验的洁净厂房或洁净室、或手术室。较常规基于培养的检测技术更加快捷、准确、灵敏，检测成本和时间大幅度降低，将帮助制药企业占据微生物污染攻防斗争的主动地位，显著提高微生物污染监测和控制能力。另一方面，基因测序数据还提供了微生物分子水平的标记，对于追溯和判断微生物来源，准确识别污染源具有重要价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
[0018]图1是:工作流程图。
[0019]图2是:滤网中微生物计数结果。将滤网中收集的微生物涂布在马铃薯平板，在48小时后观察发现有较多酵母，未见霉菌。总菌数IO5 Cfu /ml。
[0020]图3是:可培养微生物计数结果。将平板微生物挑取混匀后，涂布在马铃薯平板，在48小时后观察发现有较多酵母，未见霉菌，基本与所挑菌落种类一致。
[0021]图4是:真菌分析维恩图。表示滤网中的真菌种类完全覆盖培养皿中的真菌种类。
[0022]图5是:细菌分析维恩图。表示滤网中的细菌种类能覆盖绝大多数完全覆盖培养皿中的真菌种类。
【具体实施方式】
[0023]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
[0024]如图1所示，本发明的流程如下: (I)微生物收集
收取回风口的空气滤网，利用无菌PBS对在滤网上的微生物进行洗脱后，洗脱液先经过纱布进行初级过滤，去除大颗粒的纤维等干扰物。过滤液再通过0.22 μ m滤膜，最终收集滤膜。作为待检测样本。
[0025](2)微生物基因组提取
两组样本，分别按照下列方法提取微生物基因组。将收集的微生物离心沉淀后，重悬于0.5mL无菌PBS中，加入50 μ L溶菌酶(lyzosyme, 10 mg/mL), 6yL变溶菌素(mutanolysin, 25000 U/mL; Sigma- Aldrich), 3 μ L 溶葡球菌酶(lysostaphin, 4000U/mL; Sigma- Aldrich),和41 μ L TE50溶液(10 mM Tris.HCL和50 mM EDTA, pH 8.0)，37° C消化一小时。然后加入0.1-mm-直径的石英砂，在振荡仪上2100转，振荡5分钟。振荡后的容易利用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)提取DNA。
[0026](3)细菌16S rDNA扩增，真菌18S rDNA扩增，扩增得到不同来源的微生物群落16S/18S rRNA 序列
细菌检测Vl到V3区域。正向引物序列AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，反向引物序列:TTACCGCGGCTGCTGGCAC ；
真菌扩增引物X区域。正向引物序列GGCAAGTCTGGTGCCAG，反向引物序列:ACGGTATCTRATCRTCTTCG。
[0027]对于不同来源的样本，我们用带有不同Barcode的引物扩增，如，对于某一样本，我们的扩增引物将为:Bact-8F ACAGACAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG 和 Bact_533RACAGACAGACGGGCGGTGTGTRCA, ACAGACA就为标记物，在最终得到的测序产物中，用于识别不同来源的样本。
[0028](4) rDNA测序:增产物纯化，定量后，可采用454高通量测序仪或者其他类似的二代测序仪。
[0029](5)对于测序结果进行数据分析，包括去污染序列、低质量序列，归并高相似度序列，序列注释以及菌种鉴定。
[0030]测序所得到的结果将低质量的结果去除后，根据不同的Barcode对序列的来源进行分类，然后拼接。对于拼接完的序列分别提交到greengenes.lbl.gov上的NAST和Bellerophon 3比对程序，和www.ncb1.nlm.nih.gov上的Nt/Nr库比对，过滤掉比对污染序列。剩余的序列利用BLAST软件和Greengenes数据库中已知的16S/18S序列数据库进行比对，一致性在95%以上的序列注释为相应的系统群，不满足的则为新的系统群。BLAST序列比对的具体判断标准为(a )与某种系的代表参照序列相比，未知菌株序列的相似性^ 99%，未知菌株鉴定为该种；(b)与某种系的代表参照序列相比，未知菌株序列的相似性> 97%，但〈99%，未知菌株鉴定为该属；(c)如未知菌株序列相似性< 97%，未知菌株不能鉴定为该种或属；(d)如存在两个或两个种系以上参照菌株与未知菌株序列相似性^ 99%，且两者相似性相差< 0.5%，则暂将未知菌株归为其中相似性较高种系，但不排除未知菌株为另一种的可能性。(e)建立所测到的微生物的DNA指纹文库，用于今后的溯源等分析。[0031]6 )建立该环境细菌数据库，包含种类信息、序列信息和丰度信息；和该环境真菌数据库，包含种类信息、序列信息和丰度信息。
[0032]实施例1用测序方法进行空气滤网微生物鉴定
a、在生物安全柜内，用无菌剪刀把每块滤膜剪成1.8—2.5X4.0-4.5cm，放入无菌大口玻璃瓶内，加入约500ml无菌的0.85%生理盐水，收集洗涤滤膜的菌液。并先用滤布粗过滤，收集的粗滤液。
[0033]b、收集的粗滤液，用0.22Mm的细菌滤膜抽气过滤，去滤液，收集滤膜(一旦滤液流出速度慢，就得换过滤膜)，到无菌试剂瓶内，加入约100ml无菌的0.85%生理盐水，用力震荡洗涤滤膜。
[0034]C、收集滤膜洗脱液，按常规方法取样，10倍稀释法进行细菌，真菌的培养计数，并进行培养。霉菌未检出；酵母较多，未计数；总菌数IO5 Cfu /ml。培养结果如图2所示:
d、其余的滤膜洗脱液经11000转离心10分钟，去掉上清液，用少量0.85%生理盐水洗下沉淀的菌体，装入1.5ml无菌的离心管内，贴上2013-05_q2，放入_20°C冰箱。
[0035]e、将收集的微生物离心沉淀后，重悬于0.5mL无菌PBS中，加入50 μ L溶菌酶(lyzosyme, 10 mg/mL), 6 μ L 变溶菌素(mutanolysin, 25000 U/mL; Sigma- Aldrich),
3μ L溶葡球菌酶(lysostaphin, 4000 U/mL; Sigma- Aldrich),和 41 μ L ΤΕ50 溶液(10mM Tris.HCL和50 mM EDTA, pH 8.0),37° C消化一小时。然后加入0.1im-直径的石英砂，在振荡仪上2100转，振荡5分钟。振荡后的容易利用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)提取DNA。
[0036]f、扩增得到不同来源的微生物群落16S/18S rRNA序列，采用454高通量测序仪。
[0037]g、对于测序结果进行数据分析、菌种鉴定，结果如下表1 (真菌，由于18S rDNA鉴定除真菌外，还有动物、植物等，但在此不做表述)和表2 (细菌，主要鉴定到属，但其序列特征可以保证其很好的溯源性)。
[0038]表1空气滤网微生物鉴定真菌鉴定结果
【权利要求】
1.一种环境微生物检测方法，其特征在于，所述的环境为一个单向空气流向的环境，步骤如下: .1 )微生物收集，所述的微生物收集自空气滤网， . 2)微生物基因组提取， 3)细菌16S rDNA扩增，真菌18S rDNA扩增， . 4) rDNA 测序， .5)数据分析,包括去污染序列、低质量序列，归并高相似度序列,序列注释； .6)建立该环境细菌数据库，包含种类信息、序列信息和丰度信息；和该环境真菌数据库，包含种类信息、序列信息和丰度信息。
2.根据权利要求1所述的方法，所述的环境为需控制空气微粒和微生物污染的洁净区。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤I)微生物收集的方法如下:定期收取单向流空气回风口的滤网，对在空气滤网上的微生物进行洗脱后，洗脱液先经过纱布进行初级过滤，去除大颗粒干扰物，过滤液再通过0.22 μ m滤膜，最终收集滤膜及其拦截的微生物作为待检测样本。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)微生物基因组提取的方法如下:样本按照下列方法提取微生物基因组，将收集的微生物离心沉淀后，重悬于无菌PBS中，加入50μ L溶菌酶(10 mg/mL), 6 μ L变溶菌素(25000 U/mL)，3 μ L溶葡球菌酶(4000 U/mL)，和 41 μ L ΤΕ50 溶液(10 mM Tris.HCL 和 50 mM EDTA, pH 8.0) ,37° C 消化一小时；然后加入0.1-mm-直径的石英砂，在振荡仪上2100转，振荡5分钟，振荡后提取DNA。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，对于细菌扩增Vl到V3区域，正向引物序列AGAGTTTGATCCTGGCTCAG (SEQ ID NO I)，反向引物序列:TTACCGCGGCTGCTGGCAC (SEQ ID NO 2)， 对于真菌扩增V4区域，正向引物序列GGCAAGTCTGGTGCCAG (SEQ ID NO 3 )，反向引物序列:ACGGTATCTRATCRTCTTCG (SEQ ID NO 4 )。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，rDNA测序，测序仪优先采用Roche454、Illumina 的 Miseq, Hiseq 二代测序仪。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中，对于拼接完的序列分别提交到 greengenes.lbl.gov 上的 NAST 和 Bellerophon 3 比对程序，和 www.ncb1.nlm.nih.gov上的Nt/Nr库比对,过滤掉比对污染序列，剩余的序列利用BLAST软件和Greengenes数据库中已知的16S/18S序列数据库进行比对，一致性在95%以上的序列注释为相应的系统群，不满足的则为新的系统群；BLAST序列比对的具体判断标准为(a)与某种系的代表参照序列相比，未知菌株序列的相似性> 99%，未知菌株鉴定为该种；(b)与某种系的代表参照序列相比，未知菌株序列的相似性> 97%，但〈99%，未知菌株鉴定为该属；(c)如未知菌株序列相似性< 97%，未知菌株不能鉴定为该种或属；(d)如存在两个或两个种系以上参照菌株与未知菌株序列相似性> 99%，且两者相似性相差< 0.5%，则暂将未知菌株归为其中相似性较高种系，但不排除未知菌株为另一种的可能性。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，相对于所述步骤I)搜集的微生物的对照样本的收集方法，利用细菌、真菌培养基，收集了该环境各个角落的微生物，包括沉降菌和悬浮菌，将所有的培养基的微生物混合后作为对照样本；同时，平板收集的微生物样本既可以作为对滤网收集的微生物进行有效性评估，还可以增加微生物的检测范围；滤网收集可以在72小时内得到结果，包括可培养和不可培养的微生物，平板收集晚于滤网收集但得到的菌种可以做 进一步分析和保藏。
【文档编号】C12Q1/68GK103627800SQ201310564815
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月14日 优先权日:2013年11月14日
【发明者】陈欢, 刘雳, 郭红樱, 张遐耘, 张启坤, 方序, 钱兵 申请人:浙江天科高新技术发展有限公司