专利名称：一种检测酒精中毒和酒精成瘾易感性的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种疾病易感性检测用的试剂盒，尤其是一种检测酒精中毒和酒精成瘾易感性的试剂盒， 通过检测乙酵脱氢酶2基因(aldehyde dehydrogenase 2 family, ALDH2)的单核苷酸多态性(SNP)位点 来预测个体对酒精中毒和酒精成瘾的易感性。
背景技术：
饮酒是人类重要的生活方式之一。当一次饮入过量的酒精或酒类饮料，引起的中枢神经系统由兴奋转 为抑制的状态，称为酒精中毒或乙醇中毒。
酒精中毒会对中枢神经系统产生抑制作用，引起昏睡和昏迷，极高浓度乙醇抑制延脑中枢会引起呼吸、 循环功能衰竭。另外乙醇在肝细胞内代谢生成大量还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH),使之与氧化型的 比值(NADH/NAD)增高，甚至可髙达正常的2 3倍。相继可发生如乳酸增高、酮体蓄积导致的代谢性酸中 毒；糖异生受阻后可出现低血糖。
酒精成瘾会造成饮酒后产生轻松、兴奋的欣快感。继续饮酒后，产生耐受性，需要增加饮酒量才能达 到原有的效果。同时会造成对酒精的心理依赖和躯体依赖为了获得饮酒后的特殊快感，渴望饮酒，这是 心理依赖，躯体依赖是指反复饮酒使中枢神经系统发生了某种生理、生化变化，以致需要乙醇持续地存在 于体内，以避免发生特殊的称之为戒断综合征的病征。长期大量饮酒时进食减少，可造成明显的营养缺乏。 同时乙醇对粘膜和腺体分泌有刺激作用，可引起食管炎、胃炎、胰腺炎。乙醇在体内代谢过程中产生自由 基，可引起细胞膜脂质过氧化，造成肝细胞坏死，肝功能异常。
ALDH2为aldehyde dehydrogenase 2 family (mitochondrial)(乙醛脱氢酶2，线粒体乙醛脱氨酶) 编码基因，主要功能是在肝脏内将乙醇代谢产物乙醛进一步脱氢成为乙酸，进入外周组织的三羧酸循环， 分解产生C02和水。该基因的缺陷或活性下降会导致大量饮酒后体内的乙醛无法被及时代谢，从而导致一 系列对肝脏、血管、中枢神经系统的损伤。该基因的缺陷型在东亚人群包括中国、韩国、日本具有广泛 的分布，带有这类基因型的个体通常更容易发生酒精中毒，而较少发生酒精成瘾和因此而引起的酒精性疾 病。SNP(single nucleotide polymorphism),即单核苷酸多态性标记，是一类基于单碱基变异引起的DNA 多态性，被遗传学界称为第三代遗传标记。主要是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性， 包括单碱基转换、颠换，以及单碱基的插入/缺失等。它是基因组中最为广泛存在的一类多态性标记，占 大约90%。这些基因组序列变异可以导致个体间表型的差异以及不同个体对疾病，特别是复杂疾病的易感 性、和对环境因素、药物反应的差异。
关于中国人群关联分析均一致表明，ALDH2缺陷基因型与饮酒不适，酒后脸红相关。国内外大样本研 究均表明ALDH2基因上的rs671号SNP位点(SEQ ID NO: 1所示序列中第161位)基因型与ALDH2基因发 生缺陷有显著关系，rs671号SNP位点是位于第十二号染色体上ALDH2基因上的一个G/A多态，引起ALDH2 基因编码的蛋白第504个氨基酸由Arg(R)变为Lys(K)。低频等位基因型A编码的蛋白活性较低，对乙醛 代谢的能力下降，引起饮酒的不适感，脸红综合症等，容易导致酒精中毒。另外一方面，低频等位基因型 A携带者由于饮酒的不适感使得该种人不易酒精成瘾，酒精性疾病反而减少。
因此ALDH2基因上的rs671号SNP位点的多态性可用于评估个体对酒精中毒和酒精成瘾的易感性，目 前已通过中国科学院国家生物基因检测技术应用评估认证中心的认证。
发明内容
基于ALDH2基因上的rs671号SNP位点的多态性可用于评估个体对酒精中毒和酒精成瘾的易感性的基 础上，本发明提供一种检测酒精中毒和酒精成瘾易感性的试剂盒。
该试剂盒包括检测ALDH2基因SEQ ID NO: 1中第161位SNP位点基因型的特异性引tl对及特异性
荧光探针、TaQ醸、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
本试剂盒中所述的特异性引物对是指针对SEQ ID NO: 1中第161位SNP位点而设计，能特异性扩增 出包含SEQ ID NO: 1中第161位SNP位点的DNA片段的引物对。设计这类引物对是本领域技术人员能够 轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO: 2和3所示序列的引物对。特异性引物对可用常规 的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的引物不限于这一对引物。
本试剂盒中所述的特异性荧光探针是指针对SEQ ID NO: 1中第161位SNP位点而设计，能通过荧光 定量PCR技术特异性检测出这个SNP位点酒精中毒易感基因型的探针。设计这类探针是本领域技术人员能 够轻易完成的。优选地，试剂盒中包含具有SEQ ID NO: 4所示序列的T叫man探针。特异性荧光探针可用 常规的合成技术进行合成。本领域的技术人员能够理解，本发明的特异性荧光探针不限于这一条探针，所 有可用于荧光定量PCR检测SEQ ID NO: 1中第161位SNP位点基因型的探针均在本发明范围内。
本发明试剂盒的组分和含量包括 ljxl 10 X荧光定量PCR反应缓冲液， 0.1^1 25mM dNTP混合液， 0.5nl 25mM MgCl2溶液， 0.02nl (5units/nl) Taq DNA聚合酶， 20nM特异性引物对各0. 225^1, l(HiM特异性荧光探针O. 25nl, 去离子水5. 68fd。
本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20'C 。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规 条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例l.检测试剂盒的使用 步骤l: DNA模板的抽取 用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。 步骤2:荧光定量PCR反应
使用可检测酒精中毒和酒精成瘾易感性的荧光定量PCR检测试剂盒，其中，含有下列引物对和荧光探
针
有义引物5' - TTTGGTGGCTACMGATGT -3， (SEQ ID NO: 2) Tm值为 54*C
反义引物5， - CTCCGAGCCACCAGCA -3' (SEQ ID NO: 3) Tm值为54°C
荧光操针5， - GCTGCAGGCATACACTAMGT -3， (SEQ ID NO: 4) Tm值为62'C
荧光定量PCR反应体系为总体积10nl，包含浓度为20ng/nl的DM模板2^1、 1 pi 10 X荧光定量PCR 反应缓冲液、0. lul 25mM dNTP混合液、0.5^1 25raM MgCl2溶液、0.02^1 (5units/nl) Taq DNA聚合酶、 20nM的有义引物0.225^1、 20nM的反义引物0.225nl、 10jxM的荧光探针0. 25^x1,去离子水5.68pl。
在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为5(TC、 2分钟，95'C、 10分钟，进行60个循环的 95'C、 30秒，60'C、 l分钟。反应结束后在ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。
步骤3: SNP基因型分析
将荧光定量PCR仪上显示的最终样品荧光量和正常对照相对比，荧光探针最终的荧光信号明显高于正 常对照，说明被检测DNA的ALDH2基因上的rs671号SNP位点基因携带有A型，为酒精中毐易感型，同时
也是酒精成瘾不易感型。
实施例2.指导人们主动预防酒精中毒和酒精成瘾的服务 目前在上海主健生物工程有限公司已经开展了这项服务。 步骤l: DNA提取
对被检测者进行服务前咨询，由被检测者签署知情同意书，填写饮酒习惯问巻调査表。依照取样盒中 的指示使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。
步骤2:基因分型检测
使用本发明提供的试剂盒，对被检测者DNA的ALDH2基因上的rs671号SNP位点进行荧光定量PCR检 测，确定该SNP位点的基因型。
步骤3:指导人们主动预防酒精中毒和酒精成瘾
通过对被检测者SNP基因型的分析，出具基因分型检测报告和被检测者个体化健康指导报告。基因检 测报告详细说明了被检测者酒精中毒和酒精成瘾易感程度的高低。个体化健康指导报告以被检测者的基因 分型检测结果为基础，结合其饮酒习惯问巻调査结果，评估被检测者酒精中毒和酒精成瘾遗传易感的相对 风险。同时制定出针对于被检测者的个性化健康行动方案，方案包括在饮酒习惯、生活方式上的改进建议 等，并为被检测者普及预防酒精中毒和酒精成瘾的健康知识。
序列表
<110〉上海主健生物工程有限公司
<120〉 一种检测酒精中毒和酒精成瘾易感性的试剂盒
<160> 4
<210> 1 <211> 240 <212〉 DNA
<213〉人属,人种(Homo sapiens, human) 〈400〉 1
gggagtgtaa cccataaccc ccaagagtga tttctgcaat ctcgtttcaa attacagggt 60 caactgctat gatgtgtttg gagcccagtc accctttggt ggctacaaga tgtcggggag 120 tggccgggsg ttgggcgagt acgggctgcs ggcatacact gaagtg3aaa ctgtgagtgt 180 gggscctgct gggggctcag ggcctgttgg ggcttg鄉g tctgctggtg gctcggeigcc 240
<210〉 2 <211> 19 <212> ■ <213>人工序列
<220>
<223〉引物 <400〉 2
tttggtggct acaag8tgt 19
〈210〉 3 <211> 16 <212〉 DNA <213>人工序列
<220>
<223〉引物 ■〉 3
ctccgagcca ccagca 16
<210〉 4 <211> 21 <212〉 DNA <213>人工序列
<220>
<223>探针 <400> 4
gctgcaggca tacactaaag t 2权利要求
1.一种检测酒精中毒和酒精成瘾易感性的试剂盒，包括检测ALDH2基因SEQ ID NO1中第161位SNP的特异性引物对及特异性荧光探针、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性引物对是指针对SEQIDNO: 1中第161 位SNP位点而设计，能特异性扩增出包含SEQ ID NO: 1中第161位SNP位点的DNA片段的引物对。
3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的特异性荧光探针是指针对SEQ ID NO: l中第 161位SNP位点而设计，能通过荧光定量PCR技术特异性检测出这个SNP位点酒精中毒易感基因型的探针。
4. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性引物对选自具有SEQ ID NO: 2和3所 示序列的引物对。
5. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所含的特异性荧光探针选自具有SEQ IDNO: 4所示 序列的Taqman探针。
6. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括lul 10 X荧光定量PCR反 应缓冲液，0. lpl 25mM dNTP揮合液，0. 5^1 25raM MgCL溶液，0. 02^1 (5units/jil) Taq DNA聚合酶， 20jiM特异性引物对各0.225nl， 10nM特异性荧光探针0.25jxl，去离子水5.68fil。本试剂盒供一人份检测 应用，试剂盒的保存温度为-20'C。
全文摘要
本发明公开了一种检测酒精中毒和酒精成瘾易感性的试剂盒。该试剂盒包括检测ALDH2基因SEQ ID NO1中第161位SNP位点基因型的特异性引物对及特异性荧光探针、用于荧光定量PCR检测的常规组件等。本发明的试剂盒通过检测分析个体的ALDH2基因上SNP位点基因携带型来预测个体对酒精中毒和酒精成瘾的易感性。
文档编号G01N33/68GK101109705SQ20061002920
公开日2008年1月23日 申请日期2006年7月21日 优先权日2006年7月21日
发明者冯哲民, 屹 楼, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司