专利名称：重污染湖泊疏竣对底泥微生物生态系统结构与功能影响的评价方法
技术领域：
本发明涉及湖泊污染治理及水生生态系统的恢复或重建，进一步说是如何评价富营养化湖泊底泥生态疏浚的生态风险，特别是一种重污染湖泊疏竣对底泥微生物生态系统结构与功能影响的评价方法。具体地说，是一种在湖泊进行底泥疏竣前、疏浚期间和疏竣后，对由于疏竣工程给底泥微生物群落结构与其功能带来的影响进行有效评价的检测方法。
背景技术：
为了控制湖泊底泥污染，防止蓝藻水华的发生，人们往往基于营养盐是蓝藻水花形成的重要因素的考虑，选用疏浚工程，作为去除底泥中积累的内源营养盐，减少蓝藻水华的发生的方法之一。欧美和日本等国家的经验表明，环保疏浚不仅可以清除湖泊重污染水体中的污染底泥，同时也可为水生生态系统的恢复或重建创造条件。但如果疏浚工艺不当，将会出现严重的生态问题。环保疏浚的关键和难点在于如何科学确定疏浚过程给周边湖泊环境带来的生态风险。目前我国几乎没有开展过此类的研究。
对湖泊进行底泥疏浚，必须对不同疏浚工艺的实施在疏浚期间以及疏浚之后对周边湖区环境将要产生的生态风险进行评估。但是由于在重污染湖区，长期的恶劣环境，导致生物群落受到很大冲击，因此运用一般的生物学和生态学方法进行此类工程的生态风险评估，很难采集到必要的样品进行分析，难以达到预期目的，需要针对重污染湖区状况，探索具有针对性和可适用性的检测和评价技术。
目前国内外还没有规范的评价富营养化湖泊的底泥疏浚所产生的潜在的生态风险的评估检测与实验技术。人们为了了解疏浚工程的生态风险，一般需要选用湖泊环境中的浮游生物、底栖动物以及底栖微生物群落的种群结构变化来表征疏浚工程对水生生态系统结构和环境要素的改变。但是这种技术应用在底泥疏浚的生态风险的评价方面不是太适用。因为湖水水体本身是流动的，是一个开放的系统，而且本来浮游生物群落的结构也存在季节和年度变化，因此在较短时间内无法区分浮游生物群落结构的变化是由于疏浚工程引起的还是其本身的季节或年度变化的结果；底栖动物的群落组成虽然相对比较稳定，但是其在重污染湖区一般生物量都比较稀少，很小的样本使得利用传统的生态学方法所得到的评价结果的可信度下降；而微生物的群落组成的检测，目前一般采用在野外采样后室内平板培养基的传统技术，但是根据有关文献，由于许多微生物无法在室内的培养基上成活，至多只能得到原位环境中微生物种群的1％的信息。由于这些不确定的原因，导致了至今还没有关于湖泊底泥疏浚的生态风险评价的统一规范，因此也就无法对底泥疏浚在解决湖泊富营养化问题方面的效果和存在的风险作出科学的评价。可见，在对重污染湖区的疏浚工程的生态风险评估时，很有必要引入新的和更有效的检测与分析方法，并进行一系列的野外和室内实验模拟研究，以预测和疏浚过程中可能出现的生态与环境问题。
发明内容
本发明目的是提供一种重污染湖泊疏竣对底泥微生物生态系统结构与功能影响的评价方法，其发明点在于借用公知的不饱和脂肪酸的生物标志物分析和与营养盐代谢有关的关键酶活性分析方法，以获取更能真实反应原位环境质量信息，能在重污染湖区的富营养化湖泊的底泥疏竣前、疏竣期间和疏竣后，对由于疏竣工程给周边湖区带来的生态与环境变化的进行明确和有效的评价，以指导疏浚工艺的选择，并评价其可行性。
本发明的上述目的是这样实现的重污染湖区富营养化湖泊疏竣对底泥微生物生态系统结构与功能影响的评价方法，其特征是选定不同疏浚工艺和深度的疏浚区，以及其临近的未疏浚区，布设监测点，采集底泥样品，对疏浚区疏浚前后及其未疏浚湖区的底泥样品进行微生物群落结构和底栖生态系统功能的变化检测，分析疏浚前后底泥中不饱和脂肪酸和与营养盐代谢有关的关键酶活性，以评价疏浚对湖泊底泥生态系统中主要营养元素循环的影响，确定底栖生态系统功能状态。
步骤如下(1)利用脂肪酸分析法评价疏浚对底泥中微生物群落结构的影响(a)样品的采集疏浚前，至少进行2次样品的采集，作为湖水质和沉积物的背景值；在疏浚过程中至少采样2次，疏浚后至少每月采样1次，整个采样过程至少持续1年，采集表层1-5cm的沉积物样品至少1kg，每点采集至少三个泥样做平行处理，样品密封冷藏运回室内低温保存，待分析；(b)脂肪酸的提取取相当于1g干重的底泥于试管中，加入NaOH甲醇溶液后，热提取至少30分钟，然后冷却至室温；再加入HCl甲醇溶液，再次热提取至少10分钟后迅速冷却至室温；在上述试管中再加入1∶1的正己烷∶甲基叔丁醚溶剂1ml，充分搅动混合，静止分层后取有机相；在试管中再加入2％NaOH水溶液对上述有机相提取物进行碱洗，然后充分搅动混合后，取出有机相于色谱采样瓶中保存，待分析；(c)脂肪酸气象色谱分析用气相色谱仪、计算机及其相应的应用软件，采用程序升温的方法进行，载气为H2，N2，O2为助燃气体；(d)结果确定用长链脂肪酸和相应的甲脂标准品对照，得到疏浚前后底泥样品中总脂肪酸含量的变化来表征湖泊底泥中微生物生物量变化；底泥样品中脂肪酸种类的变化来表征湖泊底泥中微生物种群结构的变化；(2)利用营养盐代谢的关键酶活性评价疏浚湖泊底泥生态系统功能即物质循环的影响(a)样品的采集疏浚前，至少进行2次样品的采集，作为沉积物的背景值；在疏浚过程中至少采样2次；疏浚后每月至少采样1次，整个采样过程至少持续1年，用底泥采样器，采集表层1-5cm的沉积物样品，每点至少采集三个泥样做平行处理，样品密封冷藏运回室内低温保存，待分析；(b)酶的提取取至少10g新鲜样品于已灭菌的三角瓶加入无菌去离子水，用超声波破碎器破碎，获得1∶5底泥酶提取液；(c)酶活性的分析经荧光素4-甲基伞形酮和7-氨基4-甲基香豆素染色标记的底物化合物在水解酶的催化下分解，释放出游离的荧光素MUF和AMC，用酶标仪检测底泥样品中荧光素MUF和AMC生成速率，即可计算底泥样品中相应水解酶的代谢活性；(d)结果确定以单位时间内荧光强度的变化表示底泥样品中水解酶活性；以水解酶活性的之间关系的变化表征底泥中微生物活性的大小及其种群的更替。
酶活性的分析具体方法是取一定体积的底泥酶提取液，加上相应的底物溶液，再加pH＝7.0的Tris-HCl于荧光酶标板微孔中，混匀后置于28±2℃温度条件下振荡培养，培养时间依据所测定各微生物酶活性而定，至少2min，培养结束后，用酶标仪测定其荧光强度变化速率，同时对每个底泥样品作标准曲线，用以计算荧光素MUF和AMC生成速率，以灭菌处理的底泥酶体液作空白对照，每个酶做三次重复，取三次重复的平均值。
本发明的优点及效果本案选定不同疏浚工艺和深度的疏浚区，以及其临近的未疏浚区，布设监测点采集底泥样品，对疏浚区疏浚前后及其未疏浚湖区的底泥样品进行微生物群落结构和底栖生态系统功能的变化检测。本案改变传统的培养和形态鉴定方法，借用不饱和脂肪酸的生物标志物分析方法，以解决目前一般野外采样后在室内平板培养技术无法得到所有微生物种群的问题；而通过检测疏浚前后底泥中与营养盐代谢有关的关键酶活性，以评价疏浚对湖泊底泥生态系统中主要营养元素循环的影响，来确定底栖生态系统功能状态。本发明方法对重污染的富营养化湖泊疏浚工程所带来的生态风险进行评估，在其他类似湖泊进行疏浚前，可以利用该方法，进行判断与评估，以确定是否能疏浚，如何选择疏浚工艺，并预测疏浚将带来的生态风险，可对于有关部门的决策提供重要依据。
图1是本发明实施例疏浚前后底泥中中长链脂肪酸的组成表(峰面积百分比)；图2是本发明实施例疏浚前后底泥中不同类型脂肪酸相对含量的变化；图3是本发明实施例疏浚前后底泥中不同类型脂肪酸含量分布的主成分分析；图4是本发明实施例底物试剂及其所测定的水解酶及其反应底物表；图5是本发明实施例底泥中关键性水解酶及其生态功能表；图6是本发明实施例底泥疏浚前后碳水化合物水解酶活性变化；图7是本发明实施例底泥疏浚前后酯类水解酶活性变化(酯酶活性未进行对数转换)；图8是本发明实施例底泥疏浚前后磷酸酶、蛋白酶和硫酸酶活性变化。
具体实施例方式
本发明在无锡五里湖进行疏浚前后，通过取样检测底泥样品中的脂肪酸种类，比较了底泥疏浚对五里湖底栖微生物群落构成的影响。
(1)利用脂肪酸分析法评价疏浚对底泥中微生物群落结构的影响疏浚前，需进行2-3次样品的采集，作为湖水质和沉积物的背景值；在疏浚过程中采样2-3次；疏浚后每月采样一次，整个采样过程持续1-2年。用柱状底泥采样器(直径7cm)，采集表层(1-5cm)的沉积物样品1kg。每点采集三个泥样做平行处理。样品装入塑料袋中密封，保温箱冷藏条件下运回室内4℃下保存，待分析。取相当于1g干重的底泥于带teflon盖的试管中(13×100mm)，然后进行如下处理首先向试管中加入1ml的NaOH甲醇溶液(45gNaOH加150ml甲醇配制而成)，接着在100℃下水浴加热30分钟，然后将试管放在室温的冷水中冷却至室温；在上述试管中加入2ml HCl甲醇溶液(6.0N HCl 325ml加275ml甲醇配制而成)，然后在80℃下水浴10分钟，之后迅速冷却至室温。提取溶剂为1∶1正己烷∶methyl tert-butylether(甲基叔丁醚)(MTBE)，方法是在上述经HCl处理的试管中加入1ml提取溶剂，充分搅动混合10分钟，静止分层后取有机相；碱洗在进行色谱分析前，需要对上述有机相提取物进行碱洗，方法是在试管中加入3ml 1.2％NaOH溶液(水)，然后充分搅动混合5分钟后，取出有机相于色谱采样瓶中保存，待分析。
脂肪酸分析的仪器为HP-5890气相色谱仪，计算机及其相应的应用软件；色谱柱，HP-101毛细管色谱柱(25m×0.2mm)；FID检测器。温度条件采用程序升温的方法，初始温度为170℃，以5℃/min的速度升至250℃后，接着迅速升至310℃，在该温度下保持2分钟以免色谱柱被污染。气体条件载气为H2，N2，O2为助燃气体，它们的流速依次为30，30，400ml/min。本方法所用的长链脂肪酸和相应的甲脂为美国Sigma公司产品，做保留时间的对照。依据脂肪酸分析方法的原理来判定底泥疏浚对湖区底栖微生物群落的影响疏浚前后，用底泥样品中总脂肪酸含量的变化来表征湖泊底泥中微生物生物量变化；底泥样品中脂肪酸种类的变化来表征湖泊底泥中微生物种群结构的变化。
疏浚前后底泥脂肪酸组成变化见图1。由图1可知，从疏浚前的两个样品中分别检测出22，和21种脂肪酸，从疏浚后1，2，3和4个月样品中分别检测出12，12，15，17种脂肪酸；即疏浚后五里湖底泥中微生物脂肪酸的种类有所减少。由于脂肪酸对于不同生物在组成成分上可显示出极大的差异，因此可推断疏浚后五里湖底泥中微生物群落发生了变化(Zelleset al，1993；White et al，1979)。
疏浚前后，底泥样品中各类脂肪酸含量如图2所示。疏浚前，底泥样品中羟基脂肪酸的百分含量为2.54±1.01，一元不饱和脂肪酸含量为7.44±0.92，直链脂肪酸含量为11.18±0.61，支链脂肪酸4.32±0.82，多元不饱和脂肪酸12.91±0.97；疏浚后，相应各类脂肪酸含量分别为0.46±0.44、4.23±1.39、3.80±3.76、2.38±0.07、5.21±0.43。因此，疏浚后底泥中各类脂肪酸的含量均显著降低。此外，疏浚前，底泥样品中，多元不饱和脂肪酸的含量最高，其余依次为直链脂肪酸、一元不饱和脂肪酸、支链、羟基脂肪酸，其中羟基脂肪酸含量最低；疏浚后，各类脂肪酸的含量之间的关系也发生了相应的变化。
由于一般情况下，不同微生物的细胞膜中所含脂肪酸化合物种类如下1细菌往往不含有多个不饱和键的脂肪酸，它含有的主要是链长为奇数的、带支链的、主链上含有环丙基或羟基的脂肪酸；2真菌和氰化菌所合成的脂肪酸大多数含有多个不饱和键；3革兰氏阳性菌含有较大比例的带支链的脂肪酸；4革兰氏阴性菌在其类酯多糖类A中含有较大比例的羟基脂肪酸；5还原菌可以合成缩醛酯类及鞘酯类化合物。
由此可知，疏浚前后，底泥中羟基不饱和脂肪酸、支链脂肪酸、多元不饱和脂肪酸等的含量变化，即表征者底泥中细菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌等微生物的生物量发生了变化。
为分析疏浚前后，底泥中微生物群落结构的变化，申请者采用主成分分析的方法对微生物在疏浚前后底泥样品中的分布进行了分析，结果如图3所示。图中，◇表示疏浚前底泥中包含的各种脂肪酸，▲表示疏浚后底泥中所包含的各种脂肪酸。可见，大部分脂肪酸与疏浚前底泥具有较高的相关性，即r≥0.5或r≤-0.5，主要包括羟基脂肪酸2-OH 10∶0、2-OH 16∶0、3-OH 14∶0，一元不饱和脂肪酸14∶1、16∶1、17∶1、18∶1和20∶1；直链饱和脂肪酸12∶0、15∶0、17∶0和18∶0；多元不饱和脂肪酸18∶2，20∶3，20∶4，20∶5。与疏浚后底泥具有良好相关性的脂肪酸相对较少，主要包括的羟基脂肪酸3-OH 14∶0，一元不饱和脂肪酸14∶1、15∶1、17∶1、18∶1，支链脂肪酸a15∶0和i16∶0，直链饱和脂肪酸12∶0、15∶0、17∶0、20∶0，多元不饱和脂肪酸18∶2，20∶2和20∶3。由此可见，疏浚前后底泥中微生物群落结构组成发生了很大的变化。
如果对脂肪酸进行气相色谱分离分析的同时能够借助微生物鉴定数据库系统(MIDI)，我们就可以将这些脂肪酸信息转化为简单的微生物种群信息，从而使研究结果得以简单直观的表达。目前，我们虽然未能利用底泥中脂肪酸的组成模式对其中微生物的组成简单地加以定量、定性划分，但是我们确实不仅可以利用其构成模式作为指纹在横向上评价底泥中微生物的群落结构和多样性；而且，我们也可以利用底泥中脂肪酸在时空上的差异来定性甚至半定量地评价其中微生物的动态变化。
结论由以上分析可知，疏浚不仅可减少五里湖底泥中微生物的的生物量，同时对其群落结构和生物多样性具有较大的影响。鉴于底泥微生物群落在水体生态系统中的重要性，疏浚后底泥中微生物数量的减少或者群落的结构的变更将会影响或改变底泥生态功能，从而对整个水体生态系统健全性和稳定性产生潜在的风险。
(2)利用营养盐代谢的关键酶活性评价疏浚湖泊底泥生态系统功能即物质循环的影响酶是生态过程的主要调节者，在物质的降解，能量的转化以及营养物质的循环中发挥重要作用。其中，水解酶被一致认为在由大分子物质转化为生物可利用小分子物质过程中起重要的调控作用；因此，认为其可以作为生态功能的生物标记物。Kandeler et al(1996)和Dick(1994)等许多的研究者也相继得出了类似的结论。
疏浚前，进行了两次样品的采集，作为湖水质和沉积物的背景值；在疏浚过程中采样两次；疏浚后每月采样一次，整个采样过程持续一年。用柱状底泥采样器(直径7cm)，采集表层(1-5cm)的沉积物样品1kg。每点采集三个泥样做平行处理。样品装入塑料袋中密封，保温箱冷藏条件下运回室内4℃下保存，待分析。取10g新鲜样品于已灭菌的250ml三角瓶(带盖子)加入50灭菌的去离子水用超声波破碎器在50J·s-1功率下破碎120s，即为1∶5底泥酶提取液。供试试剂所用底物试剂及测定的水解酶如图4所示。试验原理是经荧光素4-甲基伞形酮(MUF，4-Methylumbelliferyl)和7-氨基4-甲基香豆素(AMC，4-Methylumbelliferyl)染色标记的底物化合物在水解酶的催化下分解，释放出游离的荧光素MUF和AMC，用酶标仪检测底泥样品中荧光素MUF和AMC生成速率，即可计算底泥样品中相应水解酶的代谢活性。方法是取100ul底泥酶提取液+20ul相应的底物溶液(1mM)+80ul Tris-HCl(pH＝7.0)于荧光酶标板微孔中(每个样品4个平行)，混匀，然后置于28±2℃温度条件下振荡培养，培养时间在2min-2hr，具体时间依据所测定各微生物酶活性而定，培养结束后，用Bio-Teck酶标仪(USA)测定其荧光强度变化速率。同时对每个底泥样品作标准曲线，用以计算荧光素MUF和AMC生成速率，以灭菌处理的底泥酶体液作空白对照。每个酶做三次重，取三次重复的平均值。
测定条件温度28±2℃，荧光素MUF激发/发射波长，355nm/460nm；荧光素AMC激发/发射波长340/430。
酶活性的定义是单位时间内每克鲜样中荧光素MUF或AMC产生的数量，单位为μmol·g-1sediment·min-1。
Marx等研究表明该方法操作简便，灵敏度高，即便是在低荧光强度下，也检测到荧光强度的变化，因此，该方法对底物浓度要求较低；且所测定的酶活性与实际情况比较接近。
以单位时间内荧光强度的变化表示底泥样品中水解酶活性；以水解酶活性的之间关系的变化表征底泥中微生物活性的大小及其种群的更替。
本实施例所选的9种微生物水解酶涉及多糖、纤维素、酯类以及氨肽类等有机化合物的水解，并涉及到碳、磷、氮、硫等生物营养元素的循环。因此，研究这9种微生物水解酶在疏浚前后的生物活性变化，不仅可以了解疏浚前后底泥中微生物对各种有机质的降解、消除能力，同时也可以判定疏浚对底泥微生态功能的影响。所选微生物水解酶及其生态功能如图5所示。采用荧光分析法，对五里湖底泥疏浚前后9种与碳、氮、磷和硫循环有关的水解酶活性变化进行了原位分析测定。
酶活性的定义是单位时间内每克鲜样中荧光素MUF或AMC产生的数量，单位为μmol·g-1sediment·min-1。
Marx等(2001)研究表明该方法操作简便，灵敏度高，即便是在低荧光强度下，也检测到荧光强度的变化，因此，该方法对底物浓度要求较低；且所测定的酶活性与实际情况比较接近。
结果如图6-8所示。本案例的研究结果表明，底泥疏浚可导致绝大多数水解酶活性降低。这是由于水解酶是异养生物分泌的胞外酶，其活性的高低与分布，除环境因素影响外，主要与环境中生物种群的丰富度和多样性密切相关，而疏浚去除了积蓄有大量微生物及其分泌物(胞外酶)表层生物膜，使得底泥中微生物数量及其相应的胞外酶含量下降，有机质降解代谢能力降低。
由图6可知，疏浚对五里湖底泥中碳水化合物水解酶活性影响较大，疏浚后，α，β-D-葡萄糖苷酶和β-D-木糖苷酶的活性显著降低。疏浚前，α，β-D-葡萄糖苷酶和β-D-木糖苷酶活性分别为26.69±3.15、27.76±1.56、33.73±7.12μmol·g-1sediment·min-1；在疏浚后一个月内，这个三种水解酶的活性降到最低值，分别为6.58±0.69、7.10±0.84、7.60±0.47μmol·g-1sediment·min-1。其中，β-D-木糖苷酶影响程度最大，与疏浚前相比，其活性降低了77.5％。之后持续到一年的时间内，尽管其各自催化活性有所升高，但是与疏浚后一个月相比，均未有显著升高，即仍低于疏浚前其各自活性水平。由此可知，疏浚对五里湖底泥中碳水化合物水解酶及其相应的微生物种群影响较大，且这种并不可在短时间内得以恢复，即便是经历了季节的更替和温度的变化。这说明疏浚对底泥中该类微生物水解酶的生物活性影响较大，对底泥表层生物膜及其生态功能的破坏性较强。
图7表示了疏浚前后，五里湖底泥中脂肪类化合物水解酶活性变化，其中，Vmax分别表示乙酰酯酶、丁酰酯酶的活性的对数值，但对脂酶表示的是其活性的实测值。由图4可知，与疏浚前后底泥中碳水化合物水解酶活性相比，疏浚对底泥中酯酶活性影响更大。疏浚后，乙酰酯酶和丁酰酯酶的活性分别最高可降低17和18个数量级，即该类水解酶活性的降低了99％以上。同样，底泥疏浚对脂酶活性影响也相对较大，疏浚前，其活性为13.05±2.25μmol·g-1sediment·min-1，疏浚后，降至为6.17±μmol·g-1sediment·min-1。此外，ANOVA法显著性检验表明，在疏浚后1个月、3个月、5个月、7个月和一年的各底泥样品中，乙酰酯酶、丁酰酯酶和脂酶的活性均存在显著差异。这说明随着季节的更替，底泥中该类水解酶活性可发生较大的变化。分析其原因是由于该类水解酶的活性与水体中浮游藻类、藻类细菌的生物量有关(Mudryk & Skórczewski，2004)。
由图8所示，疏浚对底泥中磷酸酶、蛋白酶和硫酸酯酶活性也存在显著的影响。疏浚后一个月，底泥中磷酸酶活性最高可降低近6个数量级；蛋白酶降低了78.8％；硫酸酯酶降低了44.7％，受影响相对较低。并且，在疏浚后各底泥样品中，这三种水解酶活性均显著低于疏浚前其相应的活性水平；且除磷酸酶在最后一次采样中具有显著降低外，这三种涉及磷、氮和硫等营养元素循环的水解酶并未有显著变化。这同样说明，底泥疏浚对五里湖底泥中磷酸酶、蛋白酶和硫酸酯酶影响较大，且这种影响作用在短时间内难以恢复。
比较底泥疏浚前后各水解酶活性变化可知，疏浚对底泥中乙酰乙酯水解酶和丁酰抑制水解酶两种酯酶活性影响最大，其次为磷酸酶和蛋白酶，对碳水化合物水解酶类的影响相对较小。分析其原因可能与各微生物水解酶及其相应微生物种群在底泥不同深度中的分布特征有关(Wittman et al，2000)。此外，疏浚前后，底泥中部分水解酶之间的关系也发生了一定的改变。如，疏浚前，疏浚前，α，β-葡萄糖苷酶＞β-木糖酶＞硫酸酯酶＞脂酶；疏浚后，硫酸酯酶＞脂酶＞α，β-葡萄糖苷酶＞β-木糖酶。鉴于同微生物种群与其相应的水解酶之间具有相对专一性，因此，底泥疏浚后水解酶之间的关系的变化表征了底泥中微生物种群发生了相应的变化。
由以上分析可知，底泥疏浚对五里湖底泥微生态系统的功能以及微生物群落均有显著的影响。通过分析研究疏浚前后五里湖底泥中微生物水解酶的生物活性变化，并对其进行长期监测，不仅可分析和评价底泥疏浚对水体生态系统的影响，同时也可了解疏浚后底泥微生态系统的恢复情况。湖泊底泥表层的微生物膜是经过众多微生物群落长年富集、更替累积的形成的微生态系统，是湖泊生态系统经过漫长的演化的结果，是湖泊生态系物质微生物降解和转化的集中营。鉴于其在湖泊生态系统的重要性，该生物膜的去除和破坏必然会对湖泊生态系统的物质循环带来严重的负面影响。
权利要求
1.重污染湖泊疏竣对底泥微生物生态系统结构与功能影响的评价方法，其特征是选定不同疏浚工艺和深度的疏浚区，以及其临近的未疏浚区，布设监测点，采集底泥样品，对疏浚区疏浚前后及其未疏浚湖区的底泥样品进行微生物群落结构和底栖生态系统功能的变化检测，分析疏浚前后底泥中不饱和脂肪酸和与营养盐代谢有关的关键酶活性，以评价疏浚对湖泊底泥生态系统中主要营养元素循环的影响，确定底栖生态系统功能状态。
2.根据权利要求1所述方法，其特征是步骤如下(1)利用脂肪酸分析法评价疏浚对底泥中微生物群落结构的影响(a)样品的采集疏浚前，至少进行2次样品的采集，作为湖水质和沉积物的背景值；在疏浚过程中至少采样2次，疏浚后至少每月采样1次，整个采样过程至少持续1年，采集表层1-5cm的沉积物样品至少1kg，每点采集至少三个泥样做平行处理，样品密封冷藏运回室内低温保存，待分析；(b)脂肪酸的提取取相当于1g干重的底泥于试管中，加入NaOH甲醇溶液后，热提取至少30分钟，然后冷却至室温；再加入HCl甲醇溶液，再次热提取至少10分钟后冷却至室温；在上述试管中再加入1∶1的正己烷∶甲基叔丁醚溶剂1ml，充分搅动混合，静止分层后取有机相；在试管中再加入2％NaOH水溶液对上述有机相提取物进行碱洗，然后充分搅动混合后，取出有机相于色谱采样瓶中保存，待分析；(c)脂肪酸气象色谱分析用气相色谱仪、计算机及其相应的应用软件，采用程序升温的方法进行，载气为H2，N2，O2为助燃气体；(d)结果确定用长链脂肪酸和相应的甲脂标准品对照，得到疏浚前后底泥样品中总脂肪酸含量的变化来表征湖泊底泥中微生物生物量变化；底泥样品中脂肪酸种类的变化来表征湖泊底泥中微生物种群结构的变化；(2)利用营养盐代谢的关键酶活性评价疏浚湖泊底泥生态系统功能即物质循环的影响(a)样品的采集疏浚前，至少进行2次样品的采集，作为沉积物的背景值；在疏浚过程中至少采样2次；疏浚后每月至少采样1次，整个采样过程至少持续1年，用底泥采样器，采集表层1-5cm的沉积物样品，每点至少采集三个泥样做平行处理，样品密封冷藏运回室内低温保存，待分析；(b)酶的提取取10g新鲜样品于已灭菌的三角瓶加入无菌去离子水，用超声波破碎器破碎，获得1∶5底泥酶提取液；(c)酶活性的分析经荧光素4-甲基伞形酮和7-氨基4-甲基香豆素染色标记的底物化合物在水解酶的催化下分解，释放出游离的荧光素MUF和AMC，用酶标仪检测底泥样品中荧光素MUF和AMC生成速率，即可计算底泥样品中相应水解酶的代谢活性；(d)结果确定以单位时间内荧光强度的变化表示底泥样品中水解酶活性；以水解酶活性的之间关系的变化表征底泥中微生物活性的大小及其种群的更替。
3.根据权利要求2所述方法，其特征是酶活性的分析具体方法是取一定体积的底泥酶提取液，加上相应的底物溶液，再加pH＝7.0的Tris-HCl于荧光酶标板微孔中，混匀后置于28±2℃温度条件下振荡培养，培养时间依据所测定各微生物酶活性而定，至少2min，培养结束后，用酶标仪测定其荧光强度变化速率，同时对每个底泥样品作标准曲线，用以计算荧光素MUF和AMC生成速率，以灭菌处理的底泥酶体液作空白对照，每个酶做三次重复，取三次重复的平均值。
全文摘要
重污染湖区富营养化湖泊疏竣对底泥微生物生态系统结构与功能影响的评价方法，其特征是选定不同疏浚工艺和深度的疏浚区，以及其临近的未疏浚区，布设监测点，采集底泥样品，对疏浚区疏浚前后及其未疏浚湖区的底泥样品进行微生物群落结构和底栖生态系统功能的变化检测，分析疏浚前后底泥中不饱和脂肪酸和与营养盐代谢有关的关键酶活性，以评价疏浚对湖泊底泥生态系统中主要营养元素循环的影响，确定底栖生态系统功能状态。
文档编号G01N21/64GK1865995SQ200610040288
公开日2006年11月22日 申请日期2006年5月12日 优先权日2006年5月12日
发明者孔繁翔, 范成新, 刘爱菊 申请人:中国科学院南京地理与湖泊研究所