专利名称：一种基于毛细管的顺序注射分析装置及其使用方法
技术领域：
本发明涉及的领域为流动分析，特别是涉及一种基于毛细管的顺序注射装置及其使用方法。
背景技术：
流动分析是六七十年代以来发展起来的一种自动化分析技术，随着社会的发展，传统的以玻璃器皿和量器为主要工具的手工操作模式逐渐无法满足人们的需求，出现了管道连续流动分析技术。Ruzicka与Hansen于1975年提出了流动注射分析(Flow injection analysis，FIA)的概念，他们利用了细管道(＜1mm内径)中液体层流状态的可控性与重现性，加上准确的时间(即流速)控制，实现了重现、但非完全的混合状态，并在此基础上来实现重现、而未必完全的化学反应.这一观念的提出大大提高了分析速度，使每小时测定上百试样成为可能，同时也促进了分析系统的微型化。顺序注射分析(Sequential Injection Analysis，简称SIA)是1990年Ruzicka和Marshall提出的。顺序注射分析系统的核心部件是一个多通道选择阀。此阀的各个通道位置分别与检测器、样品、试剂等通道相连，公共通道与一个可以抽吸和推动液体的泵相通。通过泵的作用，顺序从不同的通道吸入一定体积的区带到泵与阀之间的储存管中。然后将这些溶液区带推至检测器，在这一过程中样品和试剂的区带之间在管道中由于径向和轴向的分散作用而互相渗透引起试剂与样品带的重叠和混合，试剂与样品发生比学反应，导致反应产物的形成。在检测器中可以得到与正常流动注射分析中类似的峰型信号。
20世纪九十年代出现了基于微加工的通道网络芯片的微流控分析技术，把试样的采集、预处理、分析检测等集成在几平方厘米的面积内，可以高效、快速地完成试样分析和检测，是目前分析化学领域的热点之一。微流控分析发展之初借鉴了流动注射分析；经过十几年的发展，微流控分析有了广阔的发展，同时提出了一些基于微芯片的流动注射(Andrew M.Leach，Aaron R.Wheeler，and Richard N.Zare.Flow Injection Analysis in a MicrofluidicFormat.Analytical Chemistry，2003，75967-972)和顺序注射系统(Richard Davidsson，Frédéric Genin，Martin Bengtsson，et.al.Microfluidic biosensing systems Part I.Development and optimisation of enzymatic chemiluminescent m-biosensors based onsilicon microchips.Lab On a Chip，2004，4481-487)。在前面的专利(微分析芯片的高通量连续换样装置及其使用方法，中国专利申请号200410016224.8)中，提出了一种基于毛细管取样探针的高通量连续换样装置及其使用方法，通过在样品液槽上加工取样缺口，使得快速连续的微量可控制体积进样成为可能。基于这一技术，建立了基于微流控芯片的高通量流动注射分析系统(Wen-Bin Du，Qun Fang，Qiao-Hong He，Zhao-Lun Fang.High-Throughput Nanoliter Sample Introduction Microfluidic Chip-Based FlowInjection Analysis System with Gravity-Driven Flows.Analytical Chemistry，2005.771330-1337)。其特点是无须借助泵阀，依靠重力和表面张力作用，实现自动快速的流动注射分析；且可以实现多样品的连续快速换样。
一般流动分析的系统往往采用机械阀系统(如采样阀和多通阀等)实现试样的引入、试剂、载流的切换和混合等操作。而本发明利用了毛细管出口作为液体驱动端，利用毛细管入口作为试样、试剂和载流的顺序无阀引入端。实现了无阀多液体的顺序引入。基于这一特点，系统的结构大大简化。而相同的微流体操作如果要在微流控芯片上实现，需要加工混合通道和多个样品试剂液槽，而且成本高。
发明内容
本发明的目的在于突破以往顺序注射、流动注射基于注射泵和多通阀以及盘管的结构特点所带来的微型化局限，建立一种基于毛细管通道的快速顺序注射分析系统，不需要采用昂贵复杂的多位选择阀，即可实现纳升级无阀多液体的顺序引入，完成高通量微流控顺序注射分析操作。
本发明提供一种基于毛细管的顺序注射分析装置，由毛细管、试样管阵列液体引入系统、毛细管内液体驱动系统和毛细管内试样的检测系统组成，其特征是毛细管出口作为液体驱动端，毛细管入口作为试样、试剂和载流的顺序无阀引入端，所述毛细管入口端与试样管阵列液体引入系统的试样管出口相连通，试样管阵列液体引入系统由两个以上的试样管构成的阵列和试样管平台组成，试样管固定于试样管平台上，毛细管出口与液体驱动系统连接。
根据本发明，所述的毛细管是系统的主体部分，液体从入口端流向出口端，并在毛细管内进行混合、反应。毛细管材质可以是多种多样的，包括石英，或者玻璃，或者金属，或者高分子聚合物材料。毛细管通道内径在10纳米至5毫米之间，较佳的内径是5～250微米。毛细管管壁厚度在1微米至5毫米范围内。毛细管长度在1毫米至10米范围内，较佳的管长范围是5毫米～50厘米。
根据本发明，所述的试样管呈水平放置固定在试样管平台上。在试样管的底部需特殊加工一个宽度在10微米至30毫米范围，深度在1微米至5毫米范围的供毛细管进口端出入的试样管出口。试样管内装入液体的种类包括试样液、试剂液、载液。试剂液的作用是与试样发生化学反应，通过测定化学反应的产物间接完成对试样的定性和定量分析。试剂液的种类可以有多种。载液的作用是携带试样液和试剂液由毛细管进口端流向毛细管出口端。具体选择何类液体，以及装有这些液体的试样管的排列顺序，需要依据具体的分析体系而定。由于试样管出口的尺度较小，当试样管水平放置时，依靠表面张力的作用，装入试样管内的液体不会由试样管出口溢出。试样管的外径范围是0.5毫米至10厘米，较为常用的是在2毫米至2厘米之间。试样管内转载液体的体积范围是1纳升至100毫升，由此也决定了试样管的长度。
根据本发明，所述的试样管阵列液体引入系统中，安装有试样管的试样管平台能进行一维，或者二维，或者三维的平移运动，或者能进行二维或者三维的转动，或者能进行上述平移和转动的复合运动。移动的目的是使平台上的各试样管按一定顺序与毛细管进口端接触，实现按既定程序的多液体顺序引入。
根据本发明，装置中采用的液体驱动系统，与毛细管出口连接。驱动液体的方向为从毛细管进口向毛细管出口流动或者抽吸。驱动系统采用重力驱动动力，或者电渗驱动动力，或者机械驱动动力。采用机械驱动动力的驱动系统包括注射泵，或者蠕动泵，或者往复泵。
重力驱动流的通常方法是将毛细管出口端通过一定长度的导管与一水平废液管相连，在水平废液管与毛细管入口端形成一定的液位差，即可实现重力驱动。
驱动系统的驱动流速范围是1皮升/分钟至10毫升/分钟。
根据本发明，在所述的基于毛细管的顺序注射分析装置中，向毛细管内引入液体的方法是，移动试样管平台带动试样管与毛细管入口端接触，毛细管入口端通过试样管出口浸入试样管内液体中一定时间，在驱动系统驱动下，一定体积的试样管内液体流入到毛细管中。
采用上述方法进行液体引入，引入毛细管中液体的体积由两个因素决定，毛细管口在试样管内液体中的停留时间和液体在毛细管中的流速。通过改变上述两因素，可改变引入液体的体积。在液体引入过程中，毛细管进口在试样管液体中的停留时间范围是1毫秒至60分钟；被引入毛细管的每一种液体的体积范围是1飞升至500微升。当毛细管进口端在两个试样管之间切换时，当流速较快时，有可能将气泡吸入毛细管内影响测定。解决的方法是采用快速切换的方法，使在毛细管进口端的液体尚未缩入毛细管内而产生气泡之前就切换到下一个试样管；或者利用液体在毛细管出口端的表面张力，使得在切换过程中，毛细管内液体保持停流状态。
本发明所述的毛细管上顺序注射分析装置的使用方法是，移动试样管平台带动其上的多个试样管按一定顺序依次与毛细管入口端接触，毛细管入口端通过试样管进口浸入试样管内液体中停留一定时间，在驱动系统驱动下，使一定体积的不同试样管内的液体，种类至少包括试样液和载液，按一定顺序被引入毛细管内，液体从毛细管入口端以一定流速流向毛细管出口端，在流动的过程中，顺序引入毛细管内的试样液与其它液体之间发生物理混合，与试剂液之间发生化学反应，在毛细管出口端附近，通过对试样本身，或者试样与试剂的化学反应的产物进行检测。
对试样的测定能直接进行的分析体系，顺序注射分析过程中仅需向毛细管内引入试样液和载液两类液体(见实施例二)。对于因条件的限制，对试样的测定不能直接进行的分析体系，需借助试样与试剂的化学反应，通过测定化学反应的产物间接完成对试样的定性和定量分析。因此顺序注射分析过程中需向毛细管内引入试样液、载液和试剂液三类液体(见实施例一)。
根据本发明，对于毛细管内试样的反应产物的检测方法，通常采用柱上检测模式，或者流出检测模式。前者检测点位于毛细管上，后者检测由毛细管出口流出的试样，可以使用的检测技术包括化学发光法，荧光法，光度法，电化学方法，质谱法等。
根据不同的分析体系，试样管中装载液体的种类不同，同时试样管在平台上的排列顺序也不同，即各液体引入毛细管中的顺序和体积也不同。通过改变装有不同种类液体的多个试样管在试样管平台上的排列顺序，可改变毛细管内液体的引入顺序。不同的液体的引入顺序对分析性能有较大影响，需要在具体实验系统上通过优化实验进行选择。
与现有技术相比，本发明的优点是1.试样试剂的消耗量极低，达到微流控芯片的水平，适合于体积微小珍贵的生化样品的分析。
2.系统分析通量高，分析的重现性好。
3.本系统利用了毛细管出口作为液体驱动端，利用毛细管入口作为试样、试剂和载流的顺序无阀引入端。实现了无阀多液体的顺序引入。基于这一特点，系统的结构大大简化，系统加工简单方便，成本低。
图1本发明结构示意图；图2本发明实施例一系统进行分析得到的信号记录图；图3发明的实施例二的结构示意图；图4采用本发明优选实施例二系统进行分析得到的信号记录图。
图中毛细管1、毛细管入口端2、毛细管出口端3、试样管4、试样管缺口5、试样管平台6、标准溶液7、试剂液8、9、载液10、发光检测系统11、发光镜12、塑料软管13、废液管14、去离子水15、试样管平台阵列转盘16、荧光素标准溶液17、18、19、20、21、荧光检测系统2具体实施例方式实施例一图1为根据本发明的优选实施例一的结构示意图。采用石英毛细管(1)(内径75微米，外径375微米)构建系统，毛细管长5厘米，毛细管进口端(2)的保护层用锋利的小刀刮去，毛细管进口端(2)表面用二氯二甲基硅烷进行硅烷化处理以避免液体引入过程中的残留污染。试样管(4)由200微升塑料离心管制成，底部均加工有宽0.8毫米，深1毫米的缺口(5)。四个试样管(4)水平排列于在一维电控平移台(6)上。四个试样管(4)内分别加入100微升的试样液-过氧化氢标准溶液(7)，试剂液-鲁米诺溶液(8)(7毫摩尔/升，pH＝10.5)、试剂液-铁氰化钾溶液(9)(20毫摩尔/升)，和载液-去离子水(10)。毛细管上的化学发光检测系统采用光电倍增管(11)作为光电转换器件，放在毛细管(1)上方0.5厘米处，检测区域距毛细管出口端(3)的距离为1厘米。毛细管(1)下方用一发光镜(12)增加光电倍增管(11)收集的光量。毛细管出口端(3)与PVC塑料软管(13)(内径2毫米，20厘米长)相连，软管出口连接一水平放置的由1毫升医用注射器改装的水平废液管(14)，组成重力液流驱动系统。废液池和软管中事先充满去离子水(15)。通过调节废液管(14)相对于毛细管进口端(2)的垂直距离，调节毛细管(1)内的液体流速。
图2采用本发明优选实施例一系统进行分析得到的信号记录图。废液管(14)相对于毛细管进口端(2)的垂直距离为6厘米，在室温25摄氏度，测得流速为10.1纳升/秒。使毛细管进口端(2)通过缺口(5)浸试样管(4)内进行液体引入。计算机控制电控平移台进行一维平移运动，使毛细管进口端(2)依次浸入鲁米诺溶液(7)、过氧化氢溶液(8)、铁氰化钾溶液(9)和载液(10)。其中在前三个溶液内各停留0.5秒时间(进样量为5纳升)，在载液(10)停留5秒时间。分析通量可达到500样/小时。如图为1微摩尔/升过氧化氢标准系列的记录图，信号峰高相对标准偏差为1.0％(n＝4)。
实施例二图3为根据本发明的优选实施例二的结构示意图；
采用石英毛细管(1)(内径75微米，外径375微米)构建系统，毛细管(1)长6厘米，毛细管进口端(2)的保护层用锋利的小刀刮去，毛细管进口端(2)表面用二氯二甲基硅烷进行硅烷化处理以避免液体引入过程中的残留污染。试样管(4)由200微升塑料离心管制成，底部均加工有宽0.8毫米，深1毫米的缺口(5)。10个试样管(4)水平排列于试样管阵列转盘(16)上，盘上平均分布10个样品管(4)。试样管内依次间隔装入100微升不同浓度的荧光素标准溶液(试样液)和载液-去离子水(9)，不同浓度的荧光素标准溶液包括50纳摩尔/升(17)、100纳摩尔/升(18)、150纳摩尔/升(19)、200纳摩尔/升(20)和250纳摩尔/升(21)荧光素溶液。转盘(16)由细分步进电机驱动，通过电脑并口通讯，控制转动方向、角度和停留的时间，实现自动液体引入和进样体积的精确控制。毛细管内试样的检测采用激光诱导荧光检测系统(22)(激发光波长473纳米)。检测点距毛细管出口端(3)的距离为1厘米。毛细管出口端(3)与PVC塑料软管(13)(内径2毫米，20厘米长)相连，软管出口连接一水平放置的由1毫升医用注射器改装的水平废液管(14)，组成重力液流驱动系统。废液池和软管中事先充满去离子水(15)。通过调节废液管(14)相对于毛细管进口端(2)的垂直距离，调节毛细管(1)内的液体流速。
图4为采用本发明优选实施例二系统进行分析得到的信号记录图。废液管(14)相对于毛细管进口端(2)的垂直距离为20厘米，在室温25摄氏度，测得流速为26.4纳升/秒。计算机控制转盘(16)进行转动，使毛细管进口端(2)依次浸入荧光素溶液(21)、载液(10)、荧光素溶液(20)、载液(10)、荧光素溶液(19)、载液(10)、荧光素溶液(18)、载液(10)、荧光素溶液(17)和载液(10)。在各荧光素溶液内停留时间均为1秒(进样量为26.4纳升)，在各载液(10)内停留时间均为7.3秒。循环重复上述操作，得到50-250纳摩尔/升标准曲线(R2＝0.9998)。分析通量达到每小时400样以上。
权利要求
1.一种基于毛细管的顺序注射分析装置，由毛细管、试样管阵列液体引入系统、毛细管内液体驱动系统和毛细管内试样的检测系统组成，其特征是毛细管出口作为液体驱动端，毛细管入口作为试样、试剂和载液的顺序无阀引入端，所述毛细管入口端与试样管阵列液体引入系统的试样管出口相连通，试样管阵列液体引入系统由两个以上的试样管构成的阵列和试样管平台组成，试样管固定于试样管平台上，毛细管出口与液体驱动系统连接。
2.根据权利要求1所述的基于毛细管的顺序注射分析装置，其特征在于，装置中采用的毛细管的材质为石英，或者玻璃，或者金属，或者高分子聚合物材料；毛细管通道内径在10纳米至5毫米之间；毛细管管壁厚度在1微米至5毫米范围内；毛细管长度在1毫米至10米范围内。
3.根据权利要求1所述的基于毛细管的顺序注射分析装置，其特征在于，试样管出口宽度在10微米至30毫米范围，深度在1微米至5毫米；试样管的外径范围是0.5毫米至10厘米。
4.根据权利要求1所述的基于毛细管的顺序注射分析装置，其特征在于，试样管平台能进行一维，或者二维，或者三维的平移运动，或者能进行二维或者三维的转动，或者能进行平移和转动的复合运动。
5.根据权利要求1所述的基于毛细管的顺序注射分析装置，其特征在于液体驱动系统与毛细管出口端连接，液体从毛细管入口端流向毛细管出口端，驱动系统采用重力驱动动力，或者电渗驱动动力，或者机械驱动动力。
6.权利要求1所述的基于毛细管的顺序注射分析装置的使用方法，其特征在于，移动试样管平台带动其上的多个试样管按一定顺序依次与毛细管入口端接触，毛细管入口端通过试样管进口浸入试样管内液体中停留一定时间，在驱动系统驱动下，使一定体积的不同试样管内的液体，至少包括试样液和载液，按一定顺序被引入毛细管内；液体从毛细管入口端以一定流速流向毛细管出口端；在毛细管出口端附近，对试样或者其化学反应的产物进行检测。
7.根据权利要求6所述的基于毛细管的顺序注射分析装置的使用方法，其特征在于对毛细管内试样或者其反应产物的检测方法采用柱上检测模式，或者流出检测模式，包括化学发光法，荧光法，光度法，电化学方法，质谱法。
8.根据权利要求6所述的基于毛细管的顺序注射分析装置的使用方法，其特征在于，毛细管进口端在试样管液体中的停留时间范围是1毫秒至60分钟。
9.根据权利要求6所述的基于毛细管的顺序注射分析装置的使用方法，其特征在于被引入毛细管的每一种液体的体积范围是1飞升至500微升。
10.根据权利要求6所述的基于毛细管的顺序注射分析装置的使用方法，其特征在于在毛细管内的液体流速是1皮升/分钟至10毫升/分钟。
全文摘要
本发明涉及一种基于毛细管顺序注射分析装置及其使用方法，该装置的特征是，系统由毛细管、试样盘和毛细管出口液流驱动系统三部分组成。利用试样管阵列的移动，在毛细管内实现多试样和试剂液体的引入、在线快速混合、反应和检测。本发明的优点是系统结构简单，容易实现自动化操作，试样试剂消耗量低，分析通量高。
文档编号G01N33/48GK1818662SQ200610049830
公开日2006年8月16日 申请日期2006年3月14日 优先权日2006年3月14日
发明者方群, 杜文斌 申请人:浙江大学