专利名称：直接分析植物组织切片化学成分的方法
技术领域：
本发明涉及化学成分分析技术领域，属于植物组织切片化学成分的直 接分析方法。
背景技术：
对于中药化学成分的研究，传统的方法是采用溶剂分配和柱色谱方法 将其逐一分离为纯的单一化合物，然后进行结构鉴定。有效成分的分离主 要靠色谱法，如气相色谱、高效液相色谱等。(陈耀祖，陈绍瑗。中药现
代化研究的化学法导论，科技出版社，北京2003年，5-6)。应用这种方 法，很多中药成分得以阐明。这一技术在中药化学成分的研究上取得了丰 硕成果，但这样的分离分析由于步骤多、分离效率低、自动化程度低，一 方面比较费时，另一方面由于每一步的操作都会损失化合物，这样对微量 组分分析常十分困难。并且在提取分离过程中加热和酸碱处理都可能造成 化合物结构的改变。近年来，随着分离分析技术的发展，高效液相色谱技 术与NMR和MS联用技术得到广泛应用，实现了对植物化学成分在线分离 分析。相对于传统的分离分析方法节省了时间。但是此种方法也必须经过
对化学成分的提取，也有可能由于超声，加热，酸碱处理造成化合物结构 的改变。川乌和草乌均是中国常用中药，目前，国内常采用酸水渗漉(李
正邦等，天然产物研究与开发Vol. 9(1)， 1997， 9-14)或乙醇(丁立生等， 天然产物研究与开发Vo1.6( 3), 1994,50-54)提取乌头属植物中生物 碱。由于各类生物碱具有不同极性，所以一种溶剂很难提取完全。并且用 酸水渗漉法提取得生物碱不全面，脂类生物碱收率较低。近来有研究用不 同溶剂体系进行硅胶柱层析(刘淑莹等，专利申请号200410010819.2); 或乙醇冷浸后，用酸水处理，再用硅胶柱层析得到乌头属植物中脂类生物 碱，利用电喷雾电离-质谱分析(刘淑莹等，专利申请号200410010820. 5)。 以上提取方法都不能同时对多种不同种类生物碱进行分析。文献报道利用 电喷雾串联质谱分析附子中生物碱用乙醇冷浸48小时(Wang, Rapid Co画n. Mass Spect匿76, 2002， 2075-2082)，用时较长。对于马钱 子的研究，利用溶剂提取，柱层析，NMR技术已经分离鉴定了多个化合物
(蔡宝昌等，药学学报29 (1)， 1994， 44-48)，近年来色谱和质谱技术 被广泛用于分析马钱子中生物碱，如高效液相色谱(HPLC) (YoimgH. ,J. Ethnopharmacol. , 2004， 93: 109-112)毛细管电泳色谱质谱联用技术
(CE-MS) (FengH. ， Journal of Chromatography A. ， 2003,1014: 83-91)。 对于防己也多采用溶剂提取分离，柱层析等方法分离鉴定(肖崇厚等，中 药化学，上海科学技术出版社，146-147)。这些方法都必须首先利用各种 溶剂对植物有效成分进行提取，然后进行分析。大多样品需求量较大，灵 敏度较低而且需要繁琐的鉴定过程。并且对于微量成分或稳定性差的成分 的鉴定分析较困难。
发明内容
本发明的目的是公开一种直接分析植物组织切片化学成分的方法，无 需费时较长，且可能破坏化学成分的样品预处理，可以直接快速分析植物 化学成分，利用这一方法达到快速分析植物化学成分，特别是分析微量成
分；快速鉴别药材真伪；对植物所含化学成分进行预测给出分子量等应用。 为达到上述目的，本发明的技术解决方案是提供一种直接分析植物组
织切片化学成分的方法，其包括步骤
51、 将待检植物切成10-20Wn厚的切片，将切片放到基质辅助激光解 析飞行时间质谱仪的靶上；
52、 用移液器将基质溶液加到植物组织切片上，用量为《30W/cm2;
53、 将耙和点有基质溶液的组织切片，放到真空干燥器中，干燥后待
测；
54、 将干燥后的靶和待检植物组织切片，放入基质辅助激光解析电离 -飞行时间质谱仪进行直接分析，用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱 测定，方法是在切片上顺时针选取10个点，每个点采集30次，累加IO
个点采集的数据为测定质谱图，即可得到植物切片所含化学成分的信息。
所述直接分析植物组织切片化学成分的方法，其所述待检植物，为川 乌、草乌、马钱子或防己的植物组织切片。
所述直接分析植物组织切片化学成分的方法，其所述基质溶液的配 制，是用50: 50的乙腈/O. 1%三氟乙酸液体，将a-氰基_4-羟基肉桂酸
(CHCA、 a—cyano—4—hydroxycinnamic acid)酉己成t包禾口溶液备用。
所述直接分析植物组织切片化学成分的方法，其所述饱和溶液，是含 有《30mg/ml的a-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)溶液。
所述直接分析植物组织切片化学成分的方法，其所述用基质辅助激光 解析电离-飞行时间质谱测定，是在测定过程中尽量使用较小的激光能量， 为9-13pJ。
本发明方法通过对植物组织的直接分析，避免了利用各种溶剂费时的 提取步骤，节省时间，降低分析费用，减少或消除了化合物的损失，有利 于分析微量成分。利用本发明方法对乌头属植物川乌，草乌和马钱子，防 己等植物进行直接分析，对已知化合物的鉴别率达70%以上，并且确定多 个未知化合物的分子量。测定了植物川乌，草乌，马钱子和防己组织切片 的化学成分。并同时检测了各类生物碱，用传统方法必须通过不同极性的 溶剂和不同pH值的酸碱处理才能得到不同类的生物碱。 一些含量较低， 分离较难的生物碱也被检测到。本发明方法用时仅几分钟，提供了直接测 定不同极性不同类别的生物碱的整体检测和快速。从而达到区分药材，和 质量监督的目的。
本发明的直接分析方法和其它方法相比具有高效快速，灵敏度高，尤 其适用于含量少、不易分离得到或在分离过程中易丢失的组分，因此在药 用植物研究中具有重要意义。
图1为植物组织切片置于基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱分析革巴上待测图2为川乌切片基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱图，由图可以
看出通过组织切片分析化学成分可以直接分析大部分(70%)生物碱成分 和一些未知化合物的分子量，说明此种分析方法较好；
图3为草乌切片基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱图，由图看出 通过组织切片可以直接快速分析乌头属植物的化学成分；
图4为马钱子切片基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱图，由图看 出通过组织切片可以直接分析植物的化学成分；
图5为防己切片基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱图，由图看出 通过组织切片可以直接分析植物的化学成分。
具体实施例方式
本发明直接分析植物组织切片化学成分的方法，无需对植物样品进行 化学处理。利用基质辅助激光解析电离-质谱技术对植物组织切片进行直 接分析。此种方法处理步骤少，切片至分析仅用几分钟，节省了时间，降 低了分析成本。这样尽量减少了植物化学成分结构改变的因素。由于避免 了不同提取方法可能对化学成分造成的损失，特别是有利于微量成分的分 析。
实施例1
选取川乌1颗，用水浸润10分钟。用切片机将植物切成10-20Wn厚 的切片。放到基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪(MALDI-T0F-MS)
的靶上，如图1所示。实验前新鲜配制基质溶液乙腈/0. 1%三氟乙酸(50:
50)将a-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA、 a-cyano-4-hydroxycinnamic acid) 配成饱和溶液( 30mg/ml)备用。将基质溶液用移液器加到植物组织切片 上，用量约为3(H4/cm2。将基质溶液点到组织切片上后，将靶放到真空干 燥器中，干燥后待测。利用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪 (MALDI-T0F-MS)进行直接测定，在测定过程中尽量使用较小的激光能量， 如9-13pJ，在切片上顺时针选取IO个点，每个点釆集30次，累加10个 点采集的数据为测定质谱图，如图2所示。
实施例2:
选取草乌1颗，用水浸润10分钟。用切片机将植物切成10-20Wn厚 的切片。放到基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS) 的靶上，如图1所示。实验前新鲜配制基质溶液乙腈/0. 1%三氟乙酸(50: 50)将a-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA、 a-cyano-4-hydroxycirm柳ic acid) 配成饱和溶液( 30mg/ml)备用。将基质溶液用移液器加到植物组织切片 上用量约为3Cmi/cm2。将基质溶液点到组织切片上后，将靶放到真空干燥 器中，千燥后待测。利用基质辅助激光解析飞行时间质谱仪 (MALDI-TOF-MS)进行直接测定，在测定过程中尽量使用较小的激光能量， 在切片上顺时针选取IO个点，每个点采集30次，累加10个点采集的数 据为测定质谱图，如图3所示。
实施例3:
选取马钱子1颗，用水浸润10分钟。用切片机将植物切成10-20Mm 厚的切片。放到基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪(MALDI-T0F-MS) 的靶上，如图1所示。实验前新鲜配制基质溶液乙腈/0. 1%三氟乙酸(50: 50)将a _氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA、 a -cyano-4-hydroxycinnamic acid) 配成饱和溶液( 30mg/ml)备用。将基质溶液用移液器加到植物组织切片 上用量约为30W/cm2。将基质溶液点到组织切片上后，将靶放到真空干燥 器中，干燥后待测。利用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪 (MALDI-TOF-MS)进行直接测定，在测定过程中尽量使用较小的激光能量。 在切片上顺时针选取10个点，每个点采集30次，累加10个点采集的数 据为测定质谱图，如图4所示。
实施例4:
选取防己1块，用水浸润10分钟。用切片机将植物切成10-20刚厚 的切片。放到基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS) 的靶上，如图1所示。实验前新鲜配制基质溶液乙腈/0. 1%三氟乙酸(50: 50)将a-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA、 a-cyano-4-hydroxycinimmic acid) 配成饱和溶液( 30mg/ml)备用。将基质溶液用移液器加到植物组织切片 上用量约为30W/cm2。将基质溶液点到组织切片上后，将靶放到真空干燥 器中，干燥后待测。利用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪 (MALDI-T0F-MS)进行直接测定，在测定过程中尽量使用较小的激光能量， 在切片上顺时针选取IO个点，每个点采集30次，累加10个点采集的数 据为测定质谱图，如图5所示。
权利要求
1.一种直接分析植物组织切片化学成分的方法，其特征在于包括步骤S1、将待检植物用切片机切成10-20μm厚的切片，将切片放到基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪的靶上；S2、用移液器将基质溶液加到植物组织切片上，用量为≤30μl/cm2；S3、将靶和点有基质溶液的组织切片，放到真空干燥器中，干燥后待测；S4、将干燥后的靶和待检植物组织切片，放入基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪进行直接分析，用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱测定，方法是在切片上顺时针选取10个点，每个点采集30次，累加10个点采集的数据为测定质谱图，即得到植物切片所含化学成分的信息。
2. 如权利要求书1所述直接分析植物组织切片化学成分的方法，其特 征在于所述待检植物，为川乌、草乌、马钱子或防己的植物组织切片。
3. 如权利要求书1所述直接分析植物组织切片化学成分的方法，其特征在于所述基质溶液的配制，是用50: 50的乙腈/0. 1%三氟乙酸液体，将a _氰基-4-羟基肉桂酸配成饱和溶液备用。
4. 如权利要求书3所述直接分析植物组织切片化学成分的方法，其特征 在于所述饱和溶液，是含有《30mg/ml的a-氰基-4-羟基肉桂酸溶液。
5. 如权利要求书1所述直接分析植物组织切片化学成分的方法，其特征 在于所述用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱测定，是在测定过程中使用的激光能量为9-13uJ。
全文摘要
本发明一种直接分析植物组织切片化学成分的方法，涉及化学成分分析技术，包括步骤S1、将待检植物切成10-20μm厚的切片，取一片切片放到基质辅助激光解析飞行时间质谱仪的靶上；S2、配制基质溶液；S3、用移液器将基质溶液加到植物组织切片上；S4、将靶和点有基质溶液的组织切片，放到真空干燥器中干燥；S5、将干燥后的靶和待检植物组织切片，直接放入基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱仪进行分析，即得到植物切片所含化学成分的信息。本发明的分析方法快捷，方便，高效，全面，无需样品化学处理，避免了传统样品处理和分析方法耗时长，微量成分难于分析，可能破坏化学成分的缺点。
文档编号G01N27/64GK101196491SQ20061016487
公开日2008年6月11日 申请日期2006年12月7日 优先权日2006年12月7日
发明者巍 吴, 梁之桃, 蔡宗苇, 赵中振 申请人:蔡宗苇