专利名称：整体活体动物中神经系统的非侵入性体内荧光成像的制作方法
整体活体动物中神经系统的非侵入性体内荧光成像发明领域本发明涉及包括对转基因动物中表达的荧光蛋白进行非侵入性成像 的方法。发明背景帕金森病(PD)是位于阿耳茨海默痴呆症之后居于第二位的最常见的 神经变性病症。据估计，仅在美国就有超过一百万个体患有这种致残疾 病，并且每年出现超过50,000新病例(Fahn and Przedborski, 2000)。作为 一种以运动徐緩、静止性震颤、强直和步态障碍为特征的进行性、年龄 相关的神经变性疾病，PD还以黑质中多巴胺能神经元的大量进行性破坏 为特征。如同很多其它的神经退行性疾病，PD自身主要表现为偶发情况， 意味着不存在任何遗传连锁，但是在罕见病例中，PD也可以作为简单的 孟德尔性状出现，与多种基因的缺陷连锁。尽管临床上和病理学上偶发和家族性PD可以在几个重要方面不同， 4旦是它们共有相同的生化脑部异常，即脑多巴胺的显著减少(Dauer and Przedborski, 2003)。 PD患者显示低水平脑多巴胺的原因源于黑质紋状体 多巴胺能途径的退化，所述多巴胺能途径由多巴胺能神经元构成，其细 胞体位于黑质中，伸出的轴突和神经末梢可见于紋状体中(Vila and Przedborski, 2004)。PD的最佳表征模型已经通过使用神经毒素MPTP而开发出来(Bloem et al., 1990， Flint Beal， 2001)。对MPTP的发现发生在1982年，当时加利 福尼亚的一群吸毒者表现出严重帕金森综合征的急性发作。研究发现该 综合征是由于自身注射一种合成的海洛因类似物而引起，而这种海洛因 类似物在制造过程中被副产物MPTP污染。随后，MPTP给药显示在小 鼠和灵长类动物中模拟PD。 MPTP为高度亲脂的，其可容易地穿过血脑 屏障。随后，其被B型单胺氧化酶转化为其活性代谢物一l-曱基-4-苯基吡啶鑰(MPP+)，然后该活性代谢物被高亲和性多巴胺和去曱肾上腺素摄 取系统摄取，并由此在黑质紋状体多巴胺能细胞的线粒体内聚集。这可 导致对细胞功能的多种有害作用，引起神经细胞死亡(Tatton and Kish， 1997， Tanji et al., 1999)。在小鼠中，2'-CH3-MPTP是比常规MPTP更为有 效的神经毒素，显示严重的组织病理学变化，包括细胞质膨胀、间质水 肿、多巴胺能神经元减少以及反应性小神经胶质细胞增殖和神经胶质增 生(Abdel-Wahab， 2005)。尽管对PD的大部分研究集中于成体进行， 一些报告令人信服地证实 对新生小鼠的全身MPTP注射导致永久的脑损伤，在成年期也还有痕迹。 发育中的脑对MPTP损伤敏感的事实还值得进一步研究。除了 MPTP,也已报道了多种其它的化学品在成体小鼠脑的不同区域 引起神经损伤。这些化学品包括一系列结构和功能上不同的化合物，从 工业上有毒的化合物、农业杀虫剂到食品添加剂。同样，迄今为止进行 的大部分神经毒性研究基于成体模型。但是，值得注意的是，具有较不 完整血脑屏障的发育中的脑更易于受到已知神经毒素的损伤，更关键的 是，该施加的损伤不能由发育中的脑完全和正确地代偿。因此，对于测 试化合物在发育中的脑中的潜在神经毒性而言，其重要性无论如何强调 也不过分，尤其是在处理沉默神经毒性(即，早期暴露于神经毒剂，但是 直至成年期才有临床症状)的问题时。美国环保局的发育神经毒性测试指 南(Developmental Neurotoxicity Testing Guideline, DNTG)进一步强调了 这点。最近，欧委会采纳了用新的欧盟管理框架来通过严格制度测试所 有的化学品的建议，据估计新措施耗资高至70亿欧元并需要至少10年 来实施。O'Callaghan(O'Callaghan， 1988)已提出，在中枢神经系统(CNS )的 星形细胞中优势表达的中间纤维蛋白 一胶质纤维酸性蛋白(GFAP),为监 测成体啮齿类动物脑中由各种神经毒剂(包括l-曱基-4-苯基-l,2,3,6-四氢 吡啶(MPTP))引起的神经损伤的早期和灵敏的生物标记(Reinhard et al., 1988， Araki et al.， 2001， Chen et al., 2002， Fields and tevens-Graham, 2002, Kurosaki et al., 2004)。 GFAP表达上调与神经学损伤增加相关。用于分析内源GFAP表达的常规方法主要包括免疫细胞化学、Northern印迹、 Western印迹和ELISA (O'Callaghan, 1991， Eng et al.， 2000)。GFAP基础启动子包括TATA和CAAT盒。增强子和沉默子序列可 见于-250和-80 bp之间以及-1980和-1500 bp之间。这些正调节区含有很 多转录因子的共有序列，包括cAMP应答元件和Sp-l、 NF-1、 AP-1以及 AP-2转录因子的结合位点。组织特异性由位于-1980至-1500bp区域的人 GFAP共有序列所赋予。反应性神经胶质增生(星形胶质增生)在应答对中枢神经系统(CNS)的 几乎任何物理或化学损伤中产生，以星形细胞体及其细胞突的肥大为特 征，伴随有GFAP表达的增加。反应性神经胶质增生伴随有GFAP的上 调。在外周神经系统创伤和毒性损伤后发生类似的GFAP增加。随着小鼠转基因学的进展和新的报告基因的获得，包括/3-半乳糖苷 酶(lacZ)、绿色荧光蛋白(GFP)和荧光酶(LUC)在内的几种报告基因被引入 转基因小鼠中在GFAP启动子控制下，并被证实是体内研究神经M增 生过程中GFAP转录活性的有用替代手段(Brenner et al., 1994， Zhuo et al.， 1997, Zhuetal., 2004)。WO 00/02997和US 6,501,003描述了在神经胶质细胞中表达绿色焚 光蛋白的转基因小鼠的产生。作者描述了在全包埋组织或者其切片中体 外检测视神经、脑、视网膜、坐骨神经和角膜中的焚光。发明内容出于有助于研究PD的发育方面和神经毒性的目的，本发明人建立了 非侵入性系统，其包括GFAP-GFP转基因小鼠模型和可购得的成像系统， 其使得能够在活体动物中研究神经学疾病、损伤和毒性的各个方面。该 系统还使以有效方式筛选大量化学品对发育中神经系统的神经毒性危险 成为可能。通过采用表达荧光蛋白的转基因动物(其中该荧光蛋白位于来自通常 在动物神经系统中表达的蛋白的启动子控制下)，本发明人已证实在整体 活体转基因动物中的荧光4企测可用于监测刺激物和测试物对来自该启动子的荧光蛋白表达的影响。这相对于现有技术有显著改进，其使得能在 体内实时或接近实时地监测测试物对完整动物神经系统的影响。最概括而言，本发明涉及在转基因动物中非侵入性检测来自荧光蛋 白的萸光的方法。根据本发明的第一方面，提供了一种涉及检测动物中目的荧光蛋白 表达的方法，其中所述动物为转基因动物，在其基因组中具有编码所述 荧光蛋白的核酸，所述编码所述荧光蛋白的核酸可操作地连接来自通常 在所述动物神经系统中表达的蛋白的启动子核酸，所述方法包括非侵入 性检测在所述动物中表达的所述蛋白的焚光的步骤。相应地，还提供了转基因动物在非侵入性检测在所述动物中表达的 所述荧光蛋白的荧光的方法中的用途，其中所述转基因动物在其基因组 中具有编码所述荧光蛋白的核酸，所述编码所述荧光蛋白的核酸可操作 地连接来自通常在该动物神经系统中表达的蛋白的启动子核酸。所述方法优选用于研究向所述动物给予测试物或施用测试刺激物的 作用，其中所述方法包括在非侵入性检测荧光的步骤之前向所述动物给 予所述测试物或刺激物的步骤。优选地，所述方法用于研究测试物或刺 激物对动物的神经学状况的影响。因此，本发明的方法可以提供用于筛 选神经学调节剂的方法。该方法优选包括将从不给予所述测试物的对照动物检测的荧光和给较的步骤。对不给予测试物情况下的焚光的检测使得能提供对照值或基础读数 (例如自体焚光)，其可以与给予测试物后的焚光检测一起使用，出于标准 化的目的计算相对荧光值。所述对照值可以在转基因动物例如其中待测 试测试物的相同类型转基因动物中检测，或者在非转基因动物中检测。 所述动物优选为相同类型，例如小鼠，最优选相同品系。为了获得对照 值，可以向对照动物给予安慰剂，例如盐水。因此，在一个优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤 (i)在给予测试物之前非侵入性检测所述转基因动物中的荧光以提 供对照；(ii) 在给予测试物之后非侵入性检测所述相同动物中的荧光；以及(iii) 将在(i)中检测的荧光与在(ii)中检测的荧光进行比较。 在另一可选的优选实施方案中，所述方法包括以下步骤(i) 非侵入性检测第一动物中的荧光以提供对照；(ii) 向第二转基因动物给予测试物，接着非侵入性检测所述动物中的 荧光；以及(iii) 将在(i)中检测的荧光与在(ii)中检测的荧光进行比较。 所述第一动物可以为转基因的或非转基因的。 在一个优选的实施方案中，提供了本发明的方法用于确定测试物的神经毒性。在另 一优选的实施方案中，提供了本发明的方法用于测试测试物促 进治疗或调节神经学损伤。相应地，所述方法包括以下步骤(i) 在所述转基因动物中诱导神经学损伤；(ii) 在给予测试物之前非侵入性检测来自(i)的所述神经学损伤动物 中的荧光，以提供对照；(iii) 在给予测试物之后非侵入性检测来自(ii)的所述相同动物中的荧 光；以及(iv) 将在(ii)中检测的荧光与在(iii)中检测的荧光进行比较。 或者，所述方法可以包括以下步骤(i) 在第一动物中诱导神经学损伤并且非侵入性检测所述神经学损 伤动物中的荧光，以提供对照；(ii) 在第二动物中诱导神经学损伤，并且向所述动物给予测试物，接 着非侵入性检测所述动物中的荧光；以及(iii) 将在(i)中检测的荧光与在(ii)中检测的荧光进行比较。 所述第一动物可以是转基因的或者非转基因的。 所述神经学损伤可以是对神经系统的任何损伤或伤害，无论是如何产生的。优选地，所述损伤是针对中枢神经系统，更优选针对脑。 所述神经学损伤可以是反应性神经胶质增生。所述神经学损伤可以是通过向动物给予选择的化学品而化学诱导的，所述化学品例如神经毒素，如MPTP、 2'-CHrMPTP、 6-羟基多巴胺 (6-OHDA)、红藻氨酸(Kainic acid， KA)、三曱基锡(Trimethytin)，农药 (pesticides),如毒死蜱(CPF)，杀真菌剂，如亚乙基双二硫代氨基曱酸锰(代 森锰或MB),杀虫剂(insecticides),如鱼藤酮，除草剂，如百草枯(N，N',-二曱基_4-4'-联吡咬総)，有机氯，如聚氯联苯(PCBs),食品添加剂，如谷 氨酸单钠盐(MSG)、工业化学品，如3，3'-亚氛基二丙腈(IDPN)、曱苯(曱 基苯)。本领域技术人员能够选择合适量的化学品用于向动物给药并且能 够设计适合的给药方案，以便诱导神经学损伤。举例而言，可以给予单 一或多(如2、 3、 4、 5或更多)剂量的所选化学品。多剂量可以以预定的 时间间隔给药，例如l、 2、 3、 4、 5、 6或更多个小时。还是通过举例， 每一剂量可以选自2、 4、 6、 7、 8、 12或14mg/kg。或者，可以通过对动物的头和/或颈和/或背部施以物理力来诱导神经 学损伤，例如挤压伤。可以通过减少对动物神经系统的供氧导致中风和/ 或大脑缺血来诱导神经学损伤。其它的诱导神经学损伤的手段可以包括 环境刺激、机械力、暴露于病毒粒子或遗传因子。在优选的实施方案中，所述神经学损伤会提供所选疾病的动物模型。 例如，所述疾病可以选自帕金森病、阿耳茨海默病或亨廷顿病。帕金森 病的动物模型可以通过给予MPTP(l-曱基-4-苯基-l， 2, 3, 6-四氢吡咬)或 2'-CH3-MPTP来化学诱导。在其它的实施方案中，提供了本发明的方法用于测试测试物促进神 经系统疾病治疗的能力。相应地，在一个优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤(i) 提供所述转基因动物，其中所述动物也是神经系统疾病的动物模型；(ii) 在给予测试物之前非侵入性检测来自(i)的所述动物中的荧光；(iii) 在给予测试物之后非侵入性检测来自(ii)的所述相同动物中的焚 光；以及(iv) 将在(ii)中检测的荧光与在(iii)中检测的荧光进行比较。 或者，所述方法包括以下步骤(i) 提供第一和第二动物，其中两动物均为神经系统疾病的动物模型；(ii) 在来自(i)的第一动物中，非侵入性检测所述动物中的荧光以提供 对照；(iii) 在来自(ii)的第二动物中，向所述动物给予测试物，接着非侵入 性检测所述动物中的荧光；以及(iv) 将在(ii)中检测的焚光与在(iii)中检测的焚光进行比较。 所述第一动物可以是转基因的或非转基因的。在其它优选的实施方案中，提供了本发明的方法用于测试对神经系 统的治疗。相应地，在一个优选的实施方案中，所述方法包括以下步骤(i) 提供所述转基因动物，其中所述动物也是神经系统疾病的动物模型；(ii) 在实施治疗之前，非侵入性检测来自(i)的所述动物中的荧光，以 提供对照；(iii) 在实施治疗之后，非侵入性检测来自(ii)的所述相同动物中的荧 光；以及(iv) 将在(ii)中检测的荧光与在(iii)中检测的荧光进行比较。 或者，所述方法可以包括以下步骤(i) 提供第一和第二动物，其中两动物均为神经系统疾病的动物模型；(ii) 在来自(i)的第一动物中，非侵入性检测所述动物中的荧光，以提 供对照；(iii ) 在来自(i)的第二动物中，对所述动物进行治疗，接着非侵入性 ;险测所述动物中的荧光；以及(iv) 将在(ii)中检测的荧光与在(iii)中检测的荧光进行比较。 所述第一动物可以是转基因的或者非转基因的。优选地，所述神经系统疾病为神经系统肿瘤，其可以选自神经胶质 瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、室管膜瘤、神经鞘瘤、神经纤维肉瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤。神经系统肿瘤的动物^f莫型 可以通过本领域技术人员熟知的肿瘤异种移植技术产生。适合地，所进行的治疗可以包括应用放射治疗，例如X射线或7射线，或者化疗药物。当本发明的方法包括使用具有神经学损伤或神经系统疾病的动物这种情况下，所述方法不涉及这类动物的产生，而涉及其用途。所述动物(转基因的和非转基因的)优选为非人哺乳动物，例如兔、豚 鼠、大鼠、小鼠或其它啮齿类动物(包括啮齿目中的任何动物)、猫、狗、猪、绵羊、山羊、牛、马、非人灵长类动物；或任何其它非人脊推动物。 最优选地，所述动物(转基因的和非转基因的)为小鼠。在任何给定的方法 中，相同类型的动物如小鼠优选用作对照和测试动物。这些动物的区别 可以在于， 一个可以为转基因的，另一个为非转基因的，但测试动物总 是转基因的。对照和测试动物都可以是转基因的。启动子核酸来自通常在动物神经系统中表达的蛋白。尽管启动子的 核酸序列可以相对于野生型被加以改变，例如通过核苷酸的置换、添加、 删除(截短)、插入或替换，但是启动子核酸的特征在于当可操作地连接编 码蛋白的核酸时能够调节所述蛋白的神经系统表达。最优选地，与野生 型启动子相比，所述启动子保留了调节神经系统组织中转录(以及因而蛋 白表达)的相应能力。在本说明书中，术语"可操作地连接"可以包括这样的情况，其中 所选择的核苷酸序列(如蛋白编码序列)和调节核苷酸序列(如启动子)如此 共价连接，以使得将所选的核苷酸序列的表达置于调节序列的影响或控 制下。因而，当调节序列能够影响形成所选核苷酸序列的一部分或全部 的蛋白编码序列的转录时，所述调节序列可操作地连接所选的核苷酸序 列。如果需要，得到的转录本可以被翻译成需要的蛋白或多肽。最优选地，所述启动子为GFAP启动子。GFAP启动子序列为本领域 技术人员所熟知。Bre皿er和Messing, Methods: A Companion to Methods in Enzymology 10, 351-364 (1996)中描述了 GFAP启动子的实例和它们在构建GFAP转基因中的用途，其中蛋白的表达被置于GFAP转录控制区域 的控制下，通过引用将该文献并入本文。所述荧光蛋白可以是任何荧光蛋白。很多适合的荧光蛋白为本领域 技术人员所知，如绿色、蓝色、青蓝色、黄色、橘色和红色荧光蛋白(例 如，参见 http: 〃www.microscopvu.com/articles/livecellimaging/fi3intro. html)。最优选地，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白(GFP),如hGFP-S65T 绿色荧光蛋白基因、EGFP-1荧光蛋白基因、或EYFP-1绿色荧光蛋白基 因，或具有哺乳动物相容性或人源化的序列(例如，密码子改变，其使得 构建体与哺乳动物核糖体翻译更具有相容性)并具有增加其光发射系数的 突变的任何其变体。在本说明书中，"转基因动物"包括其中编码荧光蛋白的核酸通过 使用重组核酸技术被引入生物体基因组的动物，所述编码焚光蛋白的核 酸可操作地连接来自通常在所述动物神经系统中表达的蛋白的启动子核 酸。产生非人转基因哺乳动物的技术为本领域技术人员所熟知。在本发 明的方法中，所述动物优选为新生的，即从出生起不超过四周龄。更优 选地，所述新生动物从出生起不超过三周龄，更优选从出生起不超过14 天龄。任选地，所述新生动物可以为从出生起l至14天龄，优选从出生 起1至7天龄，或者从出生起7至14天龄。新生动物可以为从出生起1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11,12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27或28天龄。通过使用新生动物，可以监测神经系统的发育，尤其是测试物对发 育中的神经系统的影响。在本发明的方法中，通过非侵入性成像检测荧光。所述成像技术为 非侵入性的，这是因为所述动物从所述动物的外部成像，在萸光的检测 中不涉及任何手术介入。因此所述动物在成像期间保持完整和完好。尽 管为了检测荧光所述动物可任选地被麻醉，但是所述动物优选在荧光检 测中为可活动的。用于非侵入性荧光成像的适合仪器和技术为本领域技 术人员已知，例如IVIS⑧成像系统100系列(Xenogen Corp., Alameda, USA)。可以在给予测试物之前或之后的任何方{更时间点进行焚光冲企测，以 得到对照或测试值。通常，优选进行一系列的给药后检测，以便监测荧 光随时间的变化。任选地，可以例如从给予了安慰剂而不是测试物的动 物在每一对应时间点进行对照读数。例如，可以在给予测试物之前立即 或不久例如最多至1小时进行检测，接着进行定期检测，例如每隔1小 时。或者，给予测试物之后的检测可以每天一次、每天两次、每天三次或每天四次，且持续研究者所希望的天H例如1、 2、 3、 4、 5或更多天。优选对来自动物的目的区域(ROI)进行焚光检测。所述ROI优选为研 究者感兴趣的区域。优选的ROI为中枢神经系统或其部分，最优选脑或 其部分。任选地，ROI可以不包括视神经、视网膜、坐骨神经、角膜或 哺乳动物眼的任何部分中的一种或多种。对应的ROI优选用于比较在对 照和测试动物中的焚光检测的目的。检测对照动物中的荧光提供了动物自体荧光的基础读数。可以进行 基础读数与测试读数之间的直接比较。但是，在一个尤其优选的实施方 案中，可以计算相对荧光(RF)值，并用于比较目的。RF值优选作为在给 予测试物后的时间点在转基因小鼠中从ROI检测的总荧光与在对照小鼠 中检测的组织自体荧光(任选地，在相同时间点，例如在给予安慰剂的情 况下)的比值来计算，所述对照小鼠可以为转基因的或非转基因的。在优选的实施方案中，所检测的荧光的增加表明神经学损伤的增加， 神经毒性或神经系统疾病的进展。在其它实施方案中，荧光的减少可以 表明神经学损伤的增加。荧光的4企测可以为定量和/或定性的。在本说明书中，对动物神经系统的提及可以包括中枢神经系统或外 周神经系统。更优选地，其为中枢神经系统，更优选脑和/或脊髓。测试物可以为任何物质、材料、组合物、化合物、药物、药剂、蛋 白、肽、抗体、核酸、小分子、工业化学品、杀虫剂、食品添加剂或防 腐剂。测试物可以为手术才直入测试动物的材料或组织，例如人造生物材 料。本发明的方法可以用于监测测试物对动物的影响，并且可以用于-设计疾病的诊断； -"i:殳计疾病的预后；-监测和/或定量脑内化学诱导的神经胶质增生和/或损伤的进展；-诊断和预测帕金森病的进展；-开发治疗剂，例如抗帕金森病药物或基因治疗药物；-监测和定量脑内神经毒剂诱导的神经胶质增生和/或损伤的进展；-测量用于移植和组织工程的人造生物材料的发育神经毒性；-在药物开发期间测量药物化合物的发育神经毒性；-测量测试物的药物动力学和/或药效学性能。本发明包括所描述的各方面和优选特征的组合，除非这种组合显然不可能或者明确避免的。现在将通过举例以及参照附图对本发明的各方面和实施方案进行解释。其它的方面和实施方案对本领域技术人员而言是显而易见的。通过引用将在本文中提到的所有文献并入本文。优选实施方案的详细说明在本发明优选的实施方案中，所述转基因动物的基因组具有可操作 地连接GFAP启动子的编码绿色荧光蛋白的核酸。这种类型的转基因小 鼠在Zhou et al 1997 Developmental Biology 187, 36-42,和WO 00/02997 和US 6,501,003中有描述，通过引用将它们都整体并入本文。所述GFAP 启动子驱动该荧光蛋白在诸如星形细胞、Schwann细胞和Mueller细胞的 神经胶质细胞中的表达。转基因小鼠被改造为表达编码人源化绿色荧光蛋白的转基因，所述 转基因可操作地连接胶质纤维酸性蛋白启动子。在所述转基因小鼠中， 在应答神经学损伤时，绿色焚光蛋白特别在诸如星形细胞、Schwann细 胞和Mueller细胞的神经胶质细胞中上调。通过将遗传构建体插入哺乳动物受精卵的前核并使稳定的基因组整 合天然发生来构建转基因小鼠。然后将受精卵转移至接纳子宫，并使其 发育成熟。所述遗传构建体包括提供神经胶质细胞特异表达的全长胶质纤维酸性蛋白启动子。所述启动子位于编码绿色荧光蛋白的突变基因的5'，并 与其可操作地连接，位于所述绿色焚光蛋白编码基因3'的DNA片段含有 用于正确RNA剪接和多腺香酸化的信号序列。进行动物的非侵入性成像以获得针对自体荧光的对照值和在给予测 试物后的测试值一例如参见实施例1的材料和方法。荧光的增加表明神经毒性或神经学损伤的增加。附图简要i兑明以下将参照附图讨论解释本发明原理的实施方案和实验，其中
图1.(A) —对转基因和非转基因新生小鼠的体内荧光成像。从转基因小 鼠脑中ROI检测总的GFP荧光，从非转基因小鼠检测组织自体荧光。采 用Living Image⑧软件(Xenogen Corp.)以光子/秒/cm2/球面度(sr)对辐射 定量。(B) —对转基因和非转基因新生小鼠的离体脑荧光成像。图2.GFAP-GFP转基因新生小鼠的非侵入性体内神经成像。采用盐水(对 照)和12 mg/kg的2'-CH3-MPTP处理小鼠，并如文中所述成<象。在给予2' -CH3- MPTP之前0小时对小鼠成像。荧光成像的采集时 间为10秒。对于每对小鼠，转基因小鼠位于右侧，非转基因小鼠位于左 側。图3.比较经2' -CH3-MPTP处理组和对照组(均值士标准误，11=5)之间 从转基因小鼠中ROI检测的总GFP荧光与从非转基因小鼠中ROI检测的 组织自体荧光的比例，所述表示为相对荧光(RF)。将RF标准化至0小时。 *表明2'-CH3-MPTP处理组相对于对照组有统计学显著性(P0.05)。 ** (P<0.01),与对照组相比。斯氏(Student's)双尾配对t检验。图4.海马中GFAP免疫染色的共聚焦成像，显示(A)在nTg小鼠中无 GFP表达，刻度条=100 /mi; (B， C) 2'-CH3-MPTP处理后6小时Tg小鼠 中GFP表达增加，采用10x物镜，刻度条二200/mi; (D， E)采用40x物镜，刻度条=50 jixm。 GFAP免疫阳性星形细胞和内源GFAP-GFP转基因标记 星形细胞的细胞突定位以箭头表示。 图5.黑质致密区(SNC)中TH免疫染色的共聚焦成像，显示(A)在nTg 小鼠中无GFP表达，刻度条=100 /mi; (B, C) 2'-CHrMPTP处理后6小时 Tg小鼠中GFP表达增加，采用20x物镜，刻度条=100 /xm; (D, E)采用 40x物镜，刻度条-50/xm。图6,GFAP-GFP成年小鼠的体内皮瓣成^f象(Skin flap imaging)。 (A)脑；(B)肝。图7.转基因(Tg)和非转基因(nTg)小鼠的离体成像(A)脑，(B)肝，(C)坐 骨神经，(D)肾。 图8,GFAP-GFP转基因新生小鼠的非侵入性体内神经成像。釆用盐水(对 照)和8mg/kg的MPTP处理小鼠，并按文中所述成像。在给予MPTP之 前0小时对小鼠成像。荧光成像的采集时间为10秒。对于每对小鼠，转 基因小鼠位于右侧，非转基因小鼠位于左侧。图9.对以1 x 12 mg/kg、4x8 mg/kg MPTP处理组和各自对照组(均值士标 准误，11 = 5)之间从转基因小鼠中ROI检测的总GFP荧光与从非转基因小 鼠中ROI检测的组织自体焚光的比例进行比较，所述比例表示为相对荧 光(RF)。将RF标准化至O小时。*表明MPTP处理组相对于对照组有统 计学显著性(PO.Ol)。斯氏双尾配对t检验。图10.(A)采用Western印迹研究MPTP(4 x 8mg/kg)对GFAP和GFP表达 的影响。道(a)未处理的转基因小鼠。道(b)MPTP处理后24小时，转基因 小鼠。道(c)未处理的非转基因小鼠。道(d)MPTP处理后24小时，非转基 因小鼠。(B)采用Western印迹膜的IVIS成像研究MPTP对GFAP和GFP表 达的影响。 图11,(A) 采用实时RT-PCR检测的MPTP(4 x 8mg/kg)对转基因和非转基 因小鼠中GFAP基因表达的影响。结果为相对对照(未经处理)的标准化 值，以获得增强倍数土标准误。*p<0.01; n = 4;双尾样品t检验。(B) 采用实时RT-PCR检测的MPTP (4 x 8mg/kg)对转基因小鼠中 GFP基因表达的影响。结果为相对对照(未经处理)的标准化值，以获得增 强倍数士标准误。图12.给予MPTP(4 x 8 mg/kg)之前和之后新生脑中不同区域的内源GFP。 图13.8-10周龄成体转基因小鼠中IHC抗TH结果(黑质致密区) 图14.(A) 采用Western印迹研究MPTP(l x 12 mg/kg)对GFAP和GFP表 达的影响。道(a)未处理的转基因小鼠。道(b)MPTP处理后6小时，转基 因小鼠。道(c)未处理的非转基因小鼠。道(d)MPTP处理后6小时，非转 基因小鼠。(B) 采用Western印迹膜的IVIS成像研究MPTP对GFAP和GFP表达的影响，单位以光子/秒/cmV球面度表示。 图15.采用实时RT-PCR检测的MPTP(l x 12 mg/kg)对转基因小鼠中GFAP 和GFP基因表达的影响。结果为相对对照(未经处理)的标准化值，以获 得增强倍数士标准误。*p<0.01 **p<0.001; n = 5;双尾样品"企验。图16.GFAP-GFP转基因新生小鼠的非侵入性体内神经成像。采用盐水(对 照)和2 mg/kg的KA处理小鼠，并如文中所述成像。在给予KA之前0小 时对小鼠成像。荧光成像的采集时间为10 s。对于每对小鼠，转基因小 鼠位于右侧，非转基因小鼠位于左侧。图17.将2 mg/kg KA处理组和对照组(均值士标准误，n = 4)之间从转基因小 鼠中ROI检测的总GFP荧光与从非转基因小鼠中ROI检测的组织自体荧 光的比例进行比较，所述比例表示为相对荧光(RF)。将RF标准化至0小 时。*表明KA处理组相对于对照组有统计学显著性(P0.05)。 ** (PO.01), 与对照组相比。斯氏双尾配对U企-验。图18.(A) 采用Western印迹研究KA(l x 12 mg/kg)对GFAP和GFP表达的 影响。道(a)未处理的转基因小鼠。道(b)KA处理后6小时，转基因小鼠。 道(c)未处理的非转基因小鼠。道(d)KA处理后6小时，非转基因小鼠。(B) 采用Western印迹膜的IVIS成像研究KA对GFAP和GFP表达 的影响。单位以光子/秒/cm々球面度表示。图19.采用实时RT-PCR检测的KA(lx 2 mg/kg)对转基因小鼠中GFAP和 GFP基因表达的影响。结果为相对对照(未经处理)的标准化值，以获得增 强倍数士标准误。*p<0.05 **p<0.01; n = 5;双尾样品t检验。图20.海马区域中GFAP免疫染色的共聚焦成像，显示CA1(A， B); CA2 和CA3(C, D)。 (B,D)显示，与未经处理的小鼠(A, C)海马区域相比，KA 处理后6小时转基因(Tg)小鼠中GFP表达增加，采用20x物镜。刻度条 =50 /mi,采用20x物镜。GFAP免疫阳性星形细胞和内源GFAP-GFP转 基因标记星形细胞的细胞突定位以箭头表示。发明详细说明以下将通过举例来说明本发明人认为的用于实施本发明的最佳模式的具 体细节。对本领域技术人员来说显而易见的是，本发明的实施不限于这 些具体细节。实施例1为了开发用于上述筛选目的的非侵入性荧光成像系统，我们将 2'-CH3-MPTP用作转基因GFAP-GFP小鼠新生脑中的模型神经毒剂，这 种小鼠先前由Zhuoetal., 1997建立。这里，我们证实，当与适合的体内光学成像系统联合时，转基因GFAP-GFP小鼠模型可可靠地检测转基因 小鼠中的GFAP-GFP标记，并且可对其应答MPTP诱导时以剂量和时间 依赖方式的上调定量。这种具有适度处理量的非侵入性光学荧光系统会 在研究帕金森病和其它神经变性疾病、发育神经毒理学以及在临床前化 合物筛选方面有广泛应用。材料和方法转基因GFAP-GFP小鼠按先前所描述的(Zhuo et al., 1997)进行转基因GFAP-GFP小鼠的建 立和基因分型。在本项研究中使用4天龄、重2.0 g - 2.5 g的FVB/N背 景的新生小鼠。动物饲养由新加坡国立大学实验动物维持单位动物房 (animal holding unit facility)提供。涵盖本研究的实验方案获得实验动物管 理及4吏用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee )的i午可。神经毒剂和给药从(Sigma-Aldrich, M-103)购得测试化合物2'-CHrMPTP——种比常 步见MPTP (Abdel-Wahab, 2005)更有效的类似物。新生小鼠在0小时接受 2'-CH3-MPTP (12 mg/kg，盐水中)单次皮下(sc)注射。将盐水用作对照组 的载体。随后在处理后2小时、4小时、6小时和8小时进行神经成像。体内神经成像采用IVIS成像系统100系列(Xenogen Corp., Alameda, CA, U.S.A.)进 行非侵入性成像。包括转基因和非转基因新生小鼠的2'-CH3-MPTP处理 对并排放置并通过使用带子物理限制小鼠下背来使其保持在适当位置， 不麻醉。这是根据一项最近的研究，其报道广泛用于儿科麻醉的氯胺酮 (ketamine)通过增加神经元凋亡的速率而显示在新生大鼠中的发育神经毒 性(Scallet et al., 2004)。然后，该对新生小鼠用配备有IVIS系统的GFP 滤境组荧光成像。图像釆集时间为10秒。相同的操作也应用于注射有盐 水的对照对。2'-CH3-MPTP对小鼠的神经毒性作用结果表示为相对荧光 (RF)，即从转基因(Tg)小鼠中目的区域(ROI)检测的总GFP荧光信号与从非转基因(nTg)小鼠中ROI检测的组织自体荧光信号之间的比例 (TgROI/nTgROI)。两种小鼠的ROI区域完全相同并且在定量辐射的研究中 所用的所有ROI始终相同。为了使成像系统引起的任何波动最小化，对 每对处理的小鼠和对照小鼠获取三个图像，所得到的均值用作该特定对 的定量读数。对照组(n = 5对小鼠)和处理组(n = 5对小鼠)的值表示为均 值士标准误，采用斯氏双尾配对t检验来评估统计学显著性。免疫组织化学为了确定光子是否是从CNS中星形细胞发出的，收集脑并在4。C使 用于0.1 M磷酸盐緩冲盐水(PBS， pH 7.4)中的4%多聚曱醛固定4小时。 然后将脑在PBS中洗涤三次，每次孵育时间是15 min,接着于4。C在30% 蔗糖中浸泡过夜。在封固和釆用恒冷切片才几(Leica Microsystems, Nussloch GmbH; CM-3050S)将它们切片之前，将组织浸入液氮后，所有的脑被包 埋在冷冻介质中。根据Atlas of Mouse brain (Franklin and Paxinos， 2001)， 将黑质(前囱-3.16mm,耳间0.64 mm)的20/xm厚度的冠状冷冻切片用于 免疫组织化学。对照组和处理组各含有4个动物(n = 3)。对于酪氨酸羟化酶(TH)和GFAP免疫染色，采用了兔抗TH多克隆 抗体(Chemicon International, Temecula, CA, USA; Ab-152)和兔抗GFAP多 克隆抗体(DakoCytomation, Denmark; Z-0334)。将冷冻切片在0.15 M 1 x PBS中洗涤5 min,接着于4°C在含有0.1% (v/v) Triton X-100和10%未 免疫山羊血清的PBS封闭液中孵育4小时。然后在0.15MlxPBS中洗 涤冷冻切片三次，每次15 min。接着，于4°C将脑切片与抗TH抗体(1:200) 和抗GFAP抗体(1:200)—起在含有0.01% (v/v) Triton X-100和1%未免疫 山羊血清的1 x PBS中孵育过夜。在1 x PBS中洗涤三次(每次15 min)后， 在室温下，将切片与1:100稀释度的德克萨斯红偶联的山羊抗兔多克隆第 二 IgG抗体一起在含有0.01% (v/v) Triton X-100和1%未免疫山羊血清的 PBS中孵育2小时。再次在1 xPBS中洗涤三次(每次15min)后，用盖玻 片使切片位于10 Jul的荧光介质中，并在共聚焦激光扫描显微镜下观察 (Olympus Optical Co. Ltd. Tokyo, Japan; IX-71)。结果
2'-CH3-MPTP对GFP荧光水平的影响
从小鼠脑中ROI 4企测固有GFP焚光，并采用Living Image IW+ (Xenogen Corp.)将来自神经区域的辐射以光子/秒/cmV球面度(sr)定量，如 图1A所示。为了确定光子是否是从CNS中星形细胞发出的，在最后的 体内成像时间点后取出脑并离体成像(图1B)。采用这个平台，使对照和 经处理的转基因小鼠的GFP荧光间的定性和定量比较成为可能。
如图2中的体内成像显示的，在处理后6小时，接受了单次剂量 2'-CH3-MPTP(12 mg/kg sc)的转基因新生小鼠相对于其非转基因对应小鼠 以及转基因对照小鼠显示了 ROI中GFP焚光(光子/秒/cmV球面度)的最显 著增加。图3中显示的GFP荧光定量进一步加强了在之前图中得到的观 察结果，其中在处理后4小时、6小时和8小时时记录了 2'-CHrMPTP 处理组和对照组之间相对焚光(RF)的显著差异，处理组在处理后6小时 时显示了相对于对照组的22。/。均值的最显著增加(P0.01)。类似地，在 2'-CH3-MPTP组中，与0小时相比，在处理后4小时、6小时和8小时， 出现了 RF的显著增加，其中在处理后6小时时出现了 17%均值的最显 著增加(PO.0001)。在对照组中，不同时间点之间未出现RF的显著差异(图 3)。
GFAP免疫组织化学
海马中GFAP免疫染色的代表性图像显示在图4中。在一次 2'-CH3-MPTP(12 mg/kg sc)处理后6小时时，在脑室和海马中星形细^^的 GFP表达显著增加。在非转基因小鼠中不存在GFP表达(图4A)。为了证 实GFP表达细胞确实是星形细胞，我们在相同切片上进行了 GFAP免疫 染色，发现GFAP免疫阳性的海马沟处血管周围星形细胞与内源GFP标 记的星形细胞之间的共定位主要发生在细胞突而不是细胞体中(在图4D 和4E中双标记细胞突的实例用箭头指出)。
TH免疫组织化学染色黑质致密区(SNC)中TH免疫染色的代表性图像显示在图5中。带有 TH抗体的多巴胺能神经元(约20 /mi)在尺寸上比非IHC染色的内源GFP 标记星形细胞(约10 /mi)大，在经2'-CH3-MPTP处理的新生小鼠SNC中 可容易地检测到。多巴胺能细胞的细胞体或细胞纤维与SNC中明显的免 疫阳性细胞突一起被密集染色。在2'-CH3-MPTP (12 mg/kg sc)处理后6小 时未观察到TH免疫阳性纤维和细胞体中的可见减少。但是，与0小时 相比，处理后6小时，可明显看到星形细胞中GFAP-GFP转基因表达的 上调。如图5A中所显示的，非转基因小鼠的SNC中多巴胺能神经元对 TH是免疫阳性染色，但是神经胶质细胞不产生转基因的表达。TH免疫 阳性多巴胺能神经元和非IHC染色的内源GFP标记星形细胞之间没有共 定位。
实施例2 -转基因GFAP-GFP成体小鼠的成像 皮瓣体内成像
在麻醉的转基因GFAP-GFP成体小鼠上制做皮瓣(从身体撕下的一 块皮肤，该皮肤的一侧仍保持连接)。
采用IVIS成像系统100系列(Xenogen Corp., Alameda, CA, U.S.A.), 在脑和肝的皮瓣区成功进行了体内成像。将低荧光的黑色纸用于阻挡来 自小鼠其它部分的组织自体荧光，仅暴露脑(图6A)和肝(图6B)的皮瓣区。
离体成像
如在图2A-2D的图像中所显示的，取出转基因(Tg)和非转基因(nTg) 成体小鼠的脑、肝、肾和坐骨神经并采用IVIS成像系统离体成像。从对 应于发射的光子数的数值的假彩色图像，可观察到Tg和nTg小鼠间的显 著差异。目前，正在进行成体小鼠替代性的成像方式的可行性研究。
实施例3 -在新生转基因小鼠中研究帕金森病和神经毒性的非侵入性脑 成4象方法实验操作 动物
本项研究在4天龄新生小鼠上进行(实验时3-5 g体重)。动物自由进 食和饮水，尽量使所使用的动物数量和它们的痛苦减至最小。
毒素注射
所用的神经毒素为2'-CH3-MPTP。每隔2小时进行8 mg/kg MPTP的 皮下给药，进行4次，在处理后24小时、48小时和72小时获得体内 神经图像。
BCAtm蛋白测定和Western印迹
对于进行BCAtm蛋白测定和Western印迹，将小鼠在处理后24小时 处死。取出脑，然后在含有磷酸盐緩冲盐水(PBS)和蛋白酶抑制剂的样品 緩沖液中裂解。采用牛血清白蛋白(BSA)作为标准品，通过二辛可宁酸 (BCA)法测定总蛋白。然后采用NuPAGE Novex Bis-Tris凝胶(4%-12%) 对样品进行NuPAGE Bis-Tris电泳。每个样品含有15 /ig蛋白。电泳后， 将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。将膜在4。C下用于PBS中的5%脱脂奶 粉和0.1% Tween 20(PBS-T)封闭过夜。然后将膜在室温下于1:1000稀释 度的多克隆兔抗GFAP抗体(Dako)/多克隆兔抗GFP抗体(abcam)孵育1 小时，然后洗涤并与PBS-T—起孵育3 x 15 min。在室温下与1:2000稀 释度的山羊抗兔IgG-HRP第二抗体(SantaCruz)—起孵育1小时后，重复 5分钟的孵育和洗涤过程3次。通过使用化学发光检测试剂(ECL Plus, Amersham)和放射自显影膜观察第二抗体。进行Western印迹后，将硝酸 纤维素膜置于IVIS仪器下成像。当采用ECL Plus检测试剂时，组合的 HRP和过氧化物催化的Lumigen PS-3 Acridan底物的氧化每分钟产生数 千的吖啶鎗酯中间体。这些中间体在轻度碱性条件下与过氧化物反应， 产生持续的高密度化学发光，最大发射在430 nm。这种化学发光信号可 采用IVIS成像系统采集。获得了具有描绘发光密度的颜色的膜图像。实时RT-PCR
对于实时RT-PCR,在处理后24小时处死小鼠。取出脑，然后在緩 沖液RA1和/3-巯基乙醇中裂解。采用NucleoSpin RNAII试剂盒分离来 自脑的总RNA。用随冲几六聚物进4亍总RNA逆转录，对cDNA进行实时 RT-PCR以定量基因表达。
实验结果
MPTP (4x8 mg/kg) 体内神经图像
如图8所示，检测来自小鼠脑中目的区域(ROI)的固有GFP荧光，并 采用Living 11^经6@软件(乂611(^611 Corp.)对来自神经区域的辐射以光子/秒 /cmV球面度(sr)定量。如在体内图像中显示的，接受了 4剂MPTP (8 mg/kg sc)的转基因新生小鼠相对于对照小鼠在处理后24小时显示了 ROI中GFP 荧光(光子/秒/cmV球面度)的最显著增加。对显示在图9中的GFP荧光的 定量显示，在处理后24小时记录到MPTP处理组和对照组之间的相对荧 光(RF)的显著差异，与对照组相比有15%均值的统计学显著性增加 (pO.Ol)。对于接受了单剂量MPTP(12 mg/kg sc)的转基因新生小鼠以及 对照组中，不同时间点之间未出现RF显著差异(图9)。 Western印迹结果
从显示在图10A中的western印迹结果可见，在约51 kDa处检测到 带，其与采用Dako抗兔GFAP抗体报告的小鼠GFAP分子大小相对应。 在约27 kDa处也检测到带，其与采用Abeam抗兔GFP抗体报告的小鼠 GFP分子大小一致。从带的浓度可看出在转基因小鼠中GFAP和GFP蛋 白的量从0至24小时是增加的(比较道a和b)。在非转基因小鼠中，GFAP 蛋白的量从0至24小时也是增加的(比较GFAP western印迹中道c和d)。 由于没有转基因，在非转基因小鼠中没有检测到GFP蛋白(GFP western 印迹中道c和d)。当采用IVIS对western印迹膜成像时，彩色描绘的蛋白存在量给出了相同结果(参考图IOB)。这支持了这样的事实，即在给千 MPTP后GFAP被上调，其又导致GFP的上调。
实时RT-PCR结果
mRNA的研究与BCA和western印迹中的蛋白研究结果是一致的， 就更长的研究周期而言，与体内神经成像也是一致的。如图IIA所示， 发现MPTP处理后24小时GFAP基因表达的增强对于转基因和非转基因 小鼠都具有统计学显著性，相对于未经处理的小鼠分别为约91。/。(p0.01) 和88%(p<0.01)。但是，发现MPTP处理后24小时GFP的基因表达与未 处理小鼠相比没有统计学显著的增强(图IIB)。这解释了 MPTP处理后 48小时和72小时神经图像的相对荧光的减弱(参见图8和9)。
内源GFP和TH免疫iE织4匕学 结果显示在图12和13中。
实施例4 -在新生转基因小鼠中研究帕金森病和神经毒性的非侵入性脑 成寸象方法
实验操作
动物
;Mf究在4天龄新生小鼠上进行(实验时3-5 g体重)。动物自由进食 和饮水，尽量使所使用的动物数量和它们的痛苦减至最小。
毒素注射
所用的神经毒素为2'-CH3-MPTP和卡因酸(KA)。 MPTP以12 mg/kg 的剂量给药，注射一次。KA以2mg/kg的剂量使用，注射一次。所有的 注射均为皮下注射。
BCAtm蛋白测定和Western印迹对于经MPTP (1 x 12 mg/kg)处理的小鼠，在处理后6小时处死。取 出脑，然后在含有磷酸盐緩沖盐水(PBS)和蛋白酶抑制剂的样品緩沖液中 裂解。采用牛血清白蛋白(BSA)作为标准品，通过二辛可宁酸(BCA)法测 定总蛋白。然后采用NuPAGE Novex Bis-Tris凝胶(4%-12%)对样品进行 NuPAGEBis-Tris电泳。每个样品含有15/xg蛋白。电泳后，将蛋白转移 至硝酸纤维素膜上。将膜在4°C下用于PBS中的5%脱脂奶粉和0.1% Tween 20(PBS-T)封闭过夜。然后将膜在室温下于1:1000稀释度的兔抗 GFAP多克隆抗体(Dako)/兔抗GFP多克隆抗体(abcam)孵育1小时，然后 洗涤并与PBS-T—起孵育3 x 15 min。在室温下与1:2000稀释度的山羊 抗兔IgG-HRP第二抗体(Santa Cruz)—起孵育1小时后，重复5分钟的孵 育和洗涤过程3次。通过使用化学发光检测试剂(ECLPlus， Amersham)和 放射自显影膜观察第二抗体。对于以KA (1 x 2mg/kg)处理的小鼠，进行 相同的操作。进行Western印迹后，将硝酸纤维素膜置于IVIS仪器下成 像。当采用ECL Plus检测试剂时，组合的HRP和过氧化物催化的Lumigen PS-3 Acridan底物的氧化每分钟产生数千的吖啶鑰酯中间体。这些中间体 在轻度碱性条件下与过氧化物反应，产生持续的高密度化学发光，最大 发射在430nm。这种化学发光信号可采用IVIS成像系统采集。获得了带 有描绘发光密度的颜色的膜的图像。
实时RT-PCR
对于以MPTP(l x 12mg/kg)处理的小鼠，在处理后2小时将它们处死。 取出脑，然后在緩冲液RA1和/3-巯基乙醇中裂解。采用NucleoSpin RNA II试剂盒分离来自脑的总RNA。用随机六聚物进行总RNA逆转录，对 cDNA进行实时RT-PCR以定量基因表达。对于以KA (1 x 2mg/kg)处理 的小鼠，进行同样的操作。
实验结果
MPTP(l x 12mg/kg) Western印迹结果从显示在图14A中的western印迹结果可见，在约51 kDa处检测到 带，其与采用Dako抗兔GFAP抗体报告的小鼠GFAP分子大小相对应。 在约27 kDa处也检测到带，其与采用Abeam抗兔GFP抗体报告的小鼠 GFP分子大小相对应。从带的浓度可看出在转基因小鼠中GFAP和GFP 蛋白的量从0至6小时是增加的(比较道a和b)。在非转基因小鼠中，GFAP 蛋白的量从0至6小时也是增加的(比较GFAP western印迹中道c和d)。 由于没有转基因，在非转基因小鼠中没有检测到GFP蛋白(GFP western 印迹中道c和d)。当采用IVIS对western印迹膜成像时，彩色描绘的蛋 白存在量给出了相同结果(参考图14B)。这支持了这样的事实，即在注射 MPTP后GFAP被上调，其又导致GFP的上调。 实时RT-PCR结果
mRNA的研究与BCA和western印迹中的蛋白研究结果是一致的。 当GFAP和GFP蛋白上调在6小时达到峰值时，发现GFAP和GFP mRNA 的上调在早至MPTP处理后2小时就出现了 。这个时间差异说明了 mRNA 被翻译成蛋白所需的时间。如图15所显示的，发现在MPTP处理后2小 时GFAP和GFP基因表达的增加均具有统计学显著性，分别为约47% (pO.OOl)和20% (p<0.01)。
KA (1 x 2mg/kg)
体内神经成4象
如图16所示，检测来自小鼠脑中ROI的固有GFP荧光，并采用Living 111^§6@软件(乂61108611 Corp.)对来自神经区域的辐射以光子/秒/cmV球面度 (sr)定量。如在体内图像中显示的，接受了单次剂量KA(2mg/kgsc)的转 基因新生小鼠相对于其非转基因对应小鼠以及转基因对照小鼠在处理后 6小时显示了 ROI中GFP荧光(光子/秒/cm"球面度)的最显著增加。对显 示在图17中的GFP荧光的定量显示，在处理后4小时和6小时记录到 KA处理组和对照组之间的相对荧光(RF)的显著差异，与对照组相比，在 处理后6小时处理组有25。/。均值的最显著增加(p0.01)。类似地，KA组 中与0小时相比时，处理后6小时出现了 RF的显著增加，在处理后6小时出现最显著的22。/。均值增加(P0.05)。对照组内，不同时间点之间未 出现RF的显著差异(图17)。 Western印迹结果
/人显示在图18A中的western印迹结果可见，在约51 kDa处检测到 带，其与采用Dako抗兔GFAP抗体报告的小鼠GFAP分子大小相对应。 在约27 kDa处也4企测到带，其与采用Abeam抗兔GFP抗体才艮告的小鼠 GFP分子大小相对应。从带的浓度可看出在转基因小鼠中GFAP和GFP 蛋白的量从0至6小时是增加的(比较道a和b)。在非转基因小鼠中，GFAP 蛋白的量从0至6小时也是增加的(比较GFAP western印迹中道c和d)。 由于没有转基因，在非转基因小鼠中没有检测到GFP蛋白(GFP western 印迹中道c和d)。当采用IVIS对western印迹膜成像时，彩色描绘的蛋 白存在量给出了相同结果(参考图18B)。这支持了这样的事实，即在注射 KA后GFAP ^皮上调，其又导致GFP的上调。
实时RT-PCR结果
mRNA的研究与BCA和western印迹中的蛋白研究结果是一致的。 当GFAP和GFP蛋白的上调在6小时达到峰值时，发现GFAP和GFP mRNA的上调在早至KA处理后2小时就出现了 。这个时间差异说明了 mRNA被翻译成蛋白所需的时间。如图19所显示的，发现在KA处理后 2小时GFAP和GFP基因表达的增加具有统计学显著性，分别为约21% (p〈0.01)和22% (p<0.05)。
GFAP免疫组织化学
海马CA1、 CA2和CA3亚区域中GFAP免疫染色的代表性图像显示 在图20A-D中。在一次KA (2 mg/kg sc)处理后6小时，海马各个区域星 形细胞中GFP表达明显增加。为了证实GFP表达细胞确实是星形细胞， 我们对相同切片进行了 GFAP免疫染色，发现海马CA1区域GFAP免疫 阳性细胞和内源GFP标记星形细胞之间的共定位主要出现在细胞突而不 是细胞体中(如图20B中，双标记的细胞突的实例以箭头指出)。实施例讨论
在转基因小鼠模型中，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)启动子驱动绿色荧 光蛋白(GFP)的表达。GFAP是主要在中枢神经系统(CNS)星形细胞中表 达的中间纤维蛋白。这些神经胶质细胞的变化可用于监测神经元活性。 对CNS中神经元的损伤是GFAP的有效诱导者。但是，通过体外测定来 监测GFAP需要处死动物。我们已经证实GFAP-GFP表达的非侵入性体 内神经成像使得能够长期监测GFAP,并且减少了该过程中所处死动物的 数量。
2'-CH3-MPTP是引起黑质致密区中多巴胺能神经元变性的神经毒素。 卡因酸是引起兴奋性脑中毒损伤的神经毒素。已知这两种神经毒素均使 GFAP表达升高。这可被开发成非侵入性体内成像模型，用于诊断和筛选 治疗，即候选药物和疗法；以及用于研究发育神经毒性。向新生小鼠注 射这些神经毒素，并采用IVIS成像系统研究随后由于神经毒素的作用新 生脑中GFAP-GFP转基因的萸光增加。为了支持非侵入性体内神经成像 模型在研究神经发育方面是可靠的这个结论，还进行了体外测定。进行 了 BCATM蛋白测定(GFP)和westem印迹以定量蛋白表达，而实时RT-PCR 用于定量基因表达。这些测定可用于跟踪在新生小鼠中由于给予神经毒 素而发生的变化，其结果可与体内神经成像的结果进行比较。
在过去的半个世纪，细胞生物学和分子生物学分析是针对在培养皿 中生长的细胞并通过细胞外分析包括基因和蛋白在内的细胞组分而进行 的。使用光学探针来体内跟踪和报告分子、蛋白和细胞的功能信息是新 的和快速发展的技术。这项技术有广泛应用，包括研究传染性疾病、肿 瘤学、药物动力学、药效学、毒理学以及转基因动物中生物发光或焚光 才艮告子的基因表达(Contag et al.， 2000, Rehemtulla et al., 2000， Yang et al.， 2000， Zhang et al" 2001, Bhaumik and Gambhir， 2002, Bouvet et al., 2002， Ntziachristos et al., 2002)。如Hoffinan(Hoffinan， 2004)所阐述的，GFP作 为报告基因的来临使细胞和分子生物学发生范式转变成为可能。引入快 速和可进入临床前研究的成像技术将使每次实验设计产生更多和更高质 量的实验数据，这通过增加可收集定量数据的次数来实现。通过在多个 时间点对整体完好的活体动物成像，研究者可在完好器官背景下分析生物分子过程。额外的优点是，采用这些方法，较少的动物就可产生具有
更高统计学显著性和更低压力(lower stress)的数据。非侵入性方法可用于 产生更具有预测性的动物模型，它们共有纵向研究设计、内部实验性对 照、分子信息和定量数据的特征，这些方法有益于科学调查和人道的动 物使用。此外，成像可通过指导用于组织学或生化分析的合适的终点组 织取样而进一 步改进这些方法。
本研究所面对的一个问题是自体荧光源。通常，由动物组织中包括 弹性蛋白、胶原、色氨酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、卟啉和黄素 在内的内源生色团引起的组织自体荧光比仪器的自体荧光高得多，尤其 是在可见光范围内(Troyeta1.，2004)。对于体内成像，组织自体焚光是主 要问题，这是由于其影响了检测目的荧光探针的能力。如在这项研究中 所看到的，来自新生小鼠的自体荧光随着小鼠从出生发育至成体而增加。 于是，本发明人设计了安全防护系统来监测信噪(s/n)比，其通过使用来自 非转基因小鼠的自体荧光将来自转基因小鼠的总GFP荧光标准化而产生 相对荧光(RF)来实现。如果RF突破了从转基因小鼠检测的GFP信号的 阈值以下1.3或30%,则该特定数据可被认为是具有过低的s/n比，因而 过于不可靠而不能用于产生精确的定量结果。
采用2'-CH3-MPTP作为模型化合物，通过非侵入性体内神经成像模 型获得的数据与组织学测定的存在上调的星形细胞一致。有大量文献才艮 道，MPTP在体内可特异地诱导中脑多巴胺神经元的神经变性死亡，导致 动物的帕金森病或人类帕金森病(Damier et al.， 1999， German et al., 1999, Olanow and Tatton， 1999)。之前的证据提示了星形细胞在MPTP诱导的帕 金森病病理过程中的可能作用。例如，全身注射了 MPTP的成体小鼠显 示了星形细胞中显著的GFAP升高，同时脑紋状体区内多巴胺能神经元 中多巴胺减少(Reinhard et al" 1988, Chen et al" 2002, Dervan et al., 2004， Kurosaki et al.， 2004)。值得注意的是，在相同遗传背景的较老小鼠中观察 到脑更易受到MPTP伤害(Ali etal.， 1993)。与成体小鼠脑中MPTP作用的 研究相比，只有有限量的关于新生脑中星形细胞如何对MPTP作出反应 的文献，推测是由于缺乏允许在脑发育过程中反复非侵入性测量GFAP 转录活性的合适方法。但是，少数报道确实证实对新生小鼠全身MPTP注射导致在成年期的7Jc久脑损伤，如所测量的(Ali et al., 1993, Fredriksson etal., 1993, Schwartz and Nishiyama， 1994)。尽管如此，这些早期的才艮道产 生了这样的观点，即发育中的脑也易受到MPTP伤害，值得仔细研究。 因此，本文描述的模型提供了在活体动物中研究神经元变性的新的可能 性。在本发明中，现在可能监测各种药物的作用，以防止由于活体动物 中中风和挤压伤导致的神经损伤。此外，由于GFAP上调出现在阿尔茨 海默病(Vanzani et al.， 2005)和亨廷顿病(Ishiguro et al.， 2001)的各个模型 中，可使用这种GFAP-GFP转基因新生小鼠来研究GFAP上调，并且非 侵入性监测各种药物治疗的神经保护作用。除了神经变性，这些小鼠还 可以用于研究脑肿瘤的治疗。Kalamarides等人最近的文章(Kalamarides et al.， 2002)描述了小鼠脑膜瘤模型，其中Nf2基因在蛛网膜细胞中是失活 的。当GFAP侵入脑组织并生长时，其表达在围绕该肿瘤的星形细^<中 被上调(Pekny and Nilsson， 2005)。本发明的其它优点是没有麻醉剂被引入 到新生小动物，因而避免了对小鼠任何可能的神经毒性作用。在2' -CH3-MPTP处理小鼠的SNC和腹侧被盖区中没有检测到TH样免疫反应 性的明显变化，提示黑质紋状体多巴胺神经元的变性在2'-CH3-MPTP注 射后6小时仍不明显。这与Araki等人的观察(在MPTP处理后5天出现 多巴胺能神经元的减少)和Kurosaki等人的发现(仅在MPTP处理后1天 紋状体和黑质中TH免疫阳性纤维和细胞体减少)很好地相符。集中于2' -CH3- MPTP的全身给药以及处理后24、 48和72小时期间对GFAP和 TH免疫染色的影响的其它研究将扩展我们对该领域的认识。
除了 MPTP，还报道了导致成体小鼠脑各个区域中神经元损伤的多种 其它化学品，如通过GFAP升高所证实的。这些化学品包括一系列结构 和功能上不同的化合物，从工业上有毒的化合物如三曱基锡(O'Callaghan, 1988)和曱基汞(0'Callaghan， 1988, Barone Jr. et al., 1998， Garcia et al.， 2002)、农业杀虫剂(Garcia et al., 2002)到食品添加剂(Ostergren et al., 2005)。与成体中经发育的脑相比，具有较不完整血脑屏障的发育中脑更 易于受到已知神经毒素的伤害，更关键的是受多种化合物的伤害，这些 化合物可进入人类食物链和环境而未经首先适当地检测其神经毒性。对 于测试化合物在发育中的脑中的潜在神经毒性而言，其重要性无论如何强调也不过分(Olney, 2002)，尤其是在处理沉默神经毒性(Costa et al., 2004))的问题时。(Tilson， 2000)评述过的美国环保局的发育神经毒性测试 指南(Developmental Neurotoxicity Testing Guideline, DNTG)进一步强调了 这点。最近，欧委会采纳了用新的欧盟管理框架来通过严格制度测试所 有的化学试剂的建议，据估计新措施耗资高至70亿欧元并需要至少10 年来实施(European， 2003)。但是，对于使用常规的GFAP技术试图评估 大量化合物在体内对发育中CNS的神经毒性风险来说，是个难以克服的 挑战，尤其是考虑到该测定方法必须以适当的处理量以及工业(Kaufinann，
2003) 和管理机构(Hass， 2003)都可接受的成本提供合理的科学依据时。 由于在脑的所有主要区域中显示独特的神经胶质细胞表达模式(Suetal.,
2004) 的经证实的GFAP-GFP转基因小鼠模型(Zhuo et al.， 1997)与合适的 体内光学生物成像系统的整合，有可能非侵入性研究神经变性疾病、发 育神经毒理学，实时筛选化学化合物，以及对诸如创伤后伤口愈合、中 风和肿瘤生长的其它CNS病理学的潜在治疗介入。
参考文献
1. Abdel-Wahab， M. H.， 2005. Potential neuroprotective effect of t誦butylhydroquinone against neurotoxicity 國 induced by l-methyl-4-(2'-methylphenyl) -1, 2， 3， 6-tetrahydropyridine (2'國methyl隱MPTP) in mice. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology (叔丁基氢醌在小 鼠中抗l-曱基-4-(2'-曱基苯基)-1, 2, 3， 6-四氢吡啶(2'-曱基-MPTP)诱导的 神经毒性的潜在神经保护作用).19, 32-41.
2. Ali, S. F.， David, S. N. and Newport, G. D., 1993. Age-related susceptibility to MPTP画induced neurotoxicity in mice (小鼠对MPTP诱导的 神经毒性的年龄相关易感性).Neurotoxicology. 14, 29-34.
3. Araki, T" Mikami, T.， Tanji， H.， Matsubara, M.， Imai, Y" Mizugaki， M. and Itoyama, Y., 2001. Biochemical and immunohistological changes in the brain of l-methyl-4-phenyl-l, 2， 3， 6-tetrahydropyridine (MPTP) -treated mouse (经l-甲基-4-苯基-l， 2， 3, 6-四氢吡啶(MPTP)处理的小鼠脑中的生 化和免疫组织学变化)，European Journal of Pharmaceutical Sciences. 12, 231-238.4. Barone Jr" S.， Haykal-Coates, N., Parran, D. K. and Tilson， H. A., 1998. Gestational exposure to methylmercury alters the developmental pattern of trk國like immunoreactivity in the rat brain and results in cortical dysmorphology(妊娠期暴露于曱基汞改变大鼠脑中trk样免疫反应性的发 育模式并导致皮质畸形).Developmental Brain Research. 109, 13-31.
5. Bhaumik， S. and Gambhir, S. S.， 2002. Optical imaging of renilla luciferase reporter gene expression in living mice (对活体小鼠中renilla荧光 素酶才艮道基因表达的光学成1象).Proceeding of the National Academy of Sciences. 99， 337-382.
6. Bloem， B. R" Irwin， I" Buruma， O. J. S" Haan，丄，Roos， R. A. C, Tetrud， J. W. and Langston, J. W.， 1990. The MPTP model: versatile contributions to the treatment of idiopathic Parkinson's disease (MPTP模型 对治疗自发性帕金森病的多方面贡献).Journal of Neurological Sciences. 97， 273-293.
7. Bouvet， M., Wang, J" Nardin， S. R" Nassirpour, R" Yang, M" Baranov， E., Jiang, P., Moossa， A. R. and Hoffinan， R. M.， 2002. Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model (原发性肺瘤生长和月夷腺癌原位才莫型中 多重转移事件的实时光学成像).Cancer research. 62, 1534-1540.
8. Brenner, M.， Kisserberth， W. C, Su, Y.， Besnard， F. and A, M., 1994. GFAP promotor directs astrocyte-specific expression in transgenic mice. Journal of Neuroscience (转基因小鼠中GFAP启动子指导星形细胞特异性 表达).14, 1030-1037.
9. Chen, L. W.， Wei， L. C, Qiu, Y., Liu， H. L., R， R. Z., Ju， G. and Chan， Y. S., 2002. Significant up-regulation of nestin protein in the neostriatum of MPTP-treated mice. Are the striatal astrocytes regionally activated after systemic MPTP administration (经MPTP处理的小鼠新紋状体中巢蛋白的 显著上调。全身MPTP给药后紋状体星形细胞被局部活化？ ) Brain Research. 925， 9-17.10. Contag, C. H., Jenkins, D.， Contag， P. R. and Negrin, R. S.， 2000. Use of reporter genes for optical measurements of neoplastic disease in vivo (使用报告基因对胂瘤性疾病的体内光学测量).Neoplasia. 2, 41-52.
11. Costa, L. G.， Aschner, M,， Vitalone， A.， Syversen， T. and Soldin， O. P.， 2004. Developmental neuropathology of environmental agents (环境因素 的发育神经病理学).Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 44， 87-110.
12. Damier， P., Hirsch, E. C， Agid， Y. and Graybiel， A. M， 1999. The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine画containing neurons in Parkinson's disease (人月亩6勺,繁、质。II.巾白金 森病中含有多巴胺的神经元的丧失模式).Brain Research. 122, 1437-1448.
13. Dauer, W. and Przedborski, S., 2003. Parkinson's disease: mechanisms and models (帕金森病才几制和才莫型) Neuron. 39， 889-909.
14. Dervan， A. G,, Meshul, C. K., Beales, M.， McBean, G. J., Moore, C， Totterdell, S.， Snyder, A. K. and Meredith, G. E., 2004. Astroglial plasticity and glutamate fimction in a chronic mouse model of Parkinson's disease-Experimental Neurology (帕金森病慢性小鼠才莫型中星形胶质细月包可塑性 和谷氨酸功能).190， 145-156.
15. Eng, L F.， Ghirnikar, R. S. and Lee， Y. L， 2000. Glial Fibrillary Acidic Protein: GFAP Thirty-One Years (1969-2000)* (胶质纤维酸性蛋白 GFAP 31年(l969-2000)*). Neurochemical Research. 25, 1439-1451.
16. European, C， 2003. Proposal for a regulation of the European Parliament and of the council concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (欧盟议会和欧盟理事会关于化 学品登记、评估、授权和限制(REACH)的管理提案).COM 2003 0644 (03).
17. Fahn, S. and Przedborski, S., 2000. Merritt's neurology. Lippincott Williams and Wilkins, New York.
18. Fields, R. D. and Stevens-Graham, B.， 2002. New insights into neuron-glia communication (关于3申经元國月交质通ifl的杀斤见解).Science. 298, 556-562.19. Flint Beal， M.， 2001. Experimental models of Parkinson's disease (巾白 金森病的实'睑才莫型).Nature Reviews Neuroscience. 2， 325-332.
20. Franklin, K. and Paxinos, G.， 2001. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates (小鼠脑功能区定位坐标).Academic Press.
21. Fredriksson， A., Fredriksson, M. and Eriksson, P.， 1993. Neonatal exposure to paraquat or MPTP induces permanent changes in striatum dopamine and behavior in adult mice (新生时暴露于百草枯或MPTP导致成 体小鼠紋状体多巴胺和行为的永久变化).Toxicology and Applied Pharmacology. 122, 258-264.
22. Garcia, S. J.， Seidler, F. J.， Qiao, D. and Slotkin， T. A.， 2002. Chlorpyrifos targets developing glia: effects on glial fibrillary acidic protein (毒死蜱靶向发育中的胶质对胶质纤维酸性蛋白的影响).Developmental Brain Research. 133， 151-161.
23. German, D. C, Nelson, E. L., Liang, C. L.， Speciale， S. G.， Sinton， C. M. and Sonsalla, P. K.， 1999. The neurotoxin MPTP causes degeneration of specific nucleus A8， A9 and A10 dopaminergic neurons in the mouse (神经毒 素MPTP导致小鼠中特异性核A8、 A9和A10多巴胺能神经元的变性). Neurodegeneration. 5， 299- 312.
24. Hass, U.， 2003. Current status of developmental neurotoxicity: regulatory view (发育神经毒性的当前状况法头见角度).Toxicology Letters. 140-141, 155-159.
25. Hoffman, R. M.， 2004. In vivo imaging with fluorescent proteins: the new cell biology (利用荧光蛋白的体内成像新细胞生物学) Acta Histochemica. 106， 77-87.
26. Ishiguro, H., Yamada, K., Sawada， H., Nishii, K., Ichino， N., Sawada， M., Kurosawa, Y.， Matsushita, N., Kobayashi， K.， Goto, J,, Hashida, H., Masuda， N.， Kanazawa， I. and Nagatsu, T., 2001. Age-dependent and tissue-specific CAG repeat instability occurs in mouse-knock-in for a mutant Huntington's disease gene. Journal of Neuroscience Research (基因敲入小鼠中出现突变的亨廷顿病基因的年龄相关和组织特异性CAG重复不稳定). 65, 289-297.
27. Kalamarides, M.， Niwa-Kawakita， M.， Leblois, H., Abramowski， V.， Perricaudet, M., Janin， A., Thomas, G.， Gutmann， D. H. and Giovannini, M., 2002. Nf2 gene inactivation in arachnoidal cells is rate-limiting for meningioma development in the mouse (蛛网膜细月包中Nf2基因失活对小鼠 中脑膜瘤的发展具有限速性).Genes and development. 16,1060- 1065.
28. Kaufmann, W., 2003. Current status of developmental neurotoxicity: an industry perspective (发育神经毒性的当前状况工业观点).Toxicology Letters. 140-141， 161-169.
29. Kurosaki, R., Muramatsu， Y.， Kato, H. and Araki, T., 2004. Biochemical, behavioral and immunohistochemical alterations in MPTP-treated mouse model of Parkinson's disease (经MPTP处理的帕金才籴 病小鼠模型中的生化、行为和免疫组织化学变化).Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 78, 143-153.
30. Luellen, B. A., Miller, D. B., Chisnell, A. C, Murphy, D. L.， O'Callaghan， J. P. and Andrews, A. M., 2003. Neuronal and astroglial responses to the serotonin and norepinephrine neurotoxin: l-methyl-4- (2 ' aminophenyl)誦l， 2, 3, 6國tetrahydropyridine (对血清素和去曱肾上腺素神 经毒素1-曱基-4- (2'-氨基苯基)-1， 2， 3, 6-四氢吡啶的神经元和星形胶质 纟田胞反应).Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 307， 923-931.
31. Ntziachristos, V.， Tung， C. H,, Bremer, C. and Weissleder, R,， 2002. Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo (焚光 分子断层摄影解析蛋白酶的体内活性).Nature Medicine. 8, 757- 760.
32. O'Callaghan, J. P.， 1988. Neurotypic and gliotypic proteins as biochemical markers of neurotoxicity 0申经型和月交质型蛋白作为4申经毒'l"生 的生^:才示i己).Neurotoxicology and Teratology. 10， 445-452.
33. O'Callaghan, J. P.， 1991. Quantification of glial fibrillary acidic protein: comparison of slot-immunobinding assys with a novel sandwichELISA (胶质纤维酸性蛋白的定量比较狭缝免疫结合测定和新型夹心 ELISA). Neurotoxicology and Teratology. 13, 275-281.
34. Olanow， W. and Tatton， W. G., 1999. Etiology and pathogenesis of Parkinson's disease (巾白金森病的病因学和发病学).Annual Review of Neuroscience. 22， 123-144.
35. Olney， J. W., 2002. New insights and new issues in developmental neurotoxicology (发育神经毒理学的新见解和新问题).Neurotoxicology. 23, 659-668.
36. Ostergren, A., Fredriksson, A. and Brittebo， E. B.， 2005. Norharman-induced motoric impairment in mice: neurodegeneration and glial activation in substantia nigra (去曱哈尔满(norharman)诱导的小鼠中运动 缺陷黑质中神经变性和神经胶质活化).Journal of Neural Transmission. 印刷前的在线发表(2005年8月3曰).
37. Pekny, M. and Nilsson， M.， 2005. Astrocyte activation and reactive gliosis (星形细胞活化和反应性神经胶质增生).Glia. 50， 427-434.
38. Rehemtulla， A., Stegman, L. D.， Cardozo， S. J" Gupta， S., Hall, D. E.， Contag， C. H. and Ross, B. D., 2000. Rapid and quantitative assessment of cancer treatment response using in vivo bioluminescence imaging (采用体内 生物发光成像快速和定量评估癌症治疗反应).Neoplasia. 2, 491-495.
39. Reinhard， J. F. J., Miller, D. B. and O'Callaghan, J. P.， 1988. The neurotoxicant MPTP (l-methyl-4-phenyl-l, 2, 3， 6- tetrahydropyridine) increases glial fibrillary acidic protein and decreases dopamine levels of the mouse striatum: evidence for glial response to injury (神经毒剂MPTP (l-曱 基_4_笨基_1, 2， 3， 6-四氢吡啶)增加胶质纤维酸性蛋白和减少小鼠紋状体 的多巴胺水平对损伤的胶质反应的证据).Neuroscience Letters. 95, 246-251.
40. Scallet， A. C, Schmued， L. C， Slikker， W.， Grunberg, N.， Faustino, P. J., Davis, H., Lester, D.， Pine, P. S.， Sistare, F. and Hanig, J. P., 2004, Developmental neurotoxicity of ketamine: Morphometric confirmation, exposure parameters, and multiple fluorescent labeling of apoptotic neurons(氯胺酮的发育神经毒性形态测定确认、曝光参数和凋亡神经元的多重 焚光标记).Toxicological Sciences. 81， 364-370.
41. Schwartz, J. P. and Nishiyama, N.， 1994. Neurotrophic factor gene expression in astrocytes during development and following injury (发育过禾呈 中和损伤后星形细胞中神经营养因子基因的表达).Brain Research Bulletin. 35, 403-407.
42. Su， M.， Hu, H.， Lee, Y., d'Azzo, A., Messing, A. and Brenner， M.， 2004. Expression specificity of GFAP transgenes (GFAP转基因的表达特异 性).Neurochemical Research. 29， 2075-2093.
43. Tanji， H.， Araki, T., Nagasawa， H. and Itoyama， Y.， 1999. Differential vulnerability of dopamine receptors in the mouse brain treated by MPTP (经MPTP处理的小鼠脑中多巴胺受体的差异易损性).Brain Research. 824， 224-231.
44. Tatton， N. A. and Kish， S. J.， 1997. In situ detection of apoptotic nuclei in the substantia nigra compacta of l-methyl-4-phenyl-l， 2, 3, 6-tetrahydropyridine-treated mice using terminal deoxynucleotidyl transferase labelling and acridine orange staining (采用末端脱氧才亥苦酸寿争4多酶才示i己和 吖咬橙染色原位4企测经l-甲基-4-苯基-l， 2, 3, 6-四氢吡啶处理的小鼠的黑 质致密区中凋亡核).Neuroscience. 77， 1037-1048.
45. Tilson, H. A., 2000. The role of developmental neurotoxicology studies in risk assessment (发育神经毒理学研究在风险评估中的作用). Toxicologic Pathology. 28, 149-156.
46. Troy， T.， Jekic隱McMullen, D., Sambucetti， L and Rice, B.， 2004. Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models (定量比较动物才莫型中荧光和生 物发光报告子检测的灵敏度).Molecular Imaging. 3， 9-23.
47. Vanzani, M. C， Iacono， R. F.， Caccuri, R. L. and Berria， M. I.， 2005. Immunochemical and morphometric features of astrocyte reactivity vs.plaque location in Alzheimer's disease (阿尔茨海默病中星形细胞反应 性的免疫化学和形态测定特征与斑定位).Medicina-Buenos Aires. 65， 213-218.
48. Vila, M. and Przedborski， S.， 2004. Genetic clues to the pathogenesis of Parkinson's disease (帕金森病发病的遗传线索).Nature Medicine. 10 (Suppl), S58-S62.
49. Yang， M.， Baranov， E.， Jiang, P., S叫F. X.， Li, X. M.， Li， L, Hasegawa, S.， Bouvet, M., Al-Tuwaijri， M., Chishima， T., Shimada, H,， Moossa, A. R., Penman, S. and Hoffman, R. M.， 2000. Whole body optical imaging of green fluorescent protein- expressing tumors and metastases沐达 绿色荧光蛋白的肿瘤和转移灶的整体光学成像).Proceeding of the National Academy of Sciences. 97， 1206-1211.
50. Zhang, W., Feng, Q. J" Harris, S. E.， Contag, P. R,, Stevenson, D. K. and Contag， C. H., 2001. Rapid in vivo functional analysis of transgenes in mice using whole body imaging of luciferase expression (采用对焚光素酶表 达的整体成像来对小鼠中转基因进行体内快速功能分析).Transgenic Research. 10， 423-434.
51. Zhu， L., Ramboz， S.， Hewitt, D.， Boring, L.， Grass, D. S. and Purchio: A. F.， 2004. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice (对小鼠神经元损伤后GFAP表达的非侵入性成《象). Neuroscience Letters. 367, 210-212.
52. Zhuo, L, Sun, B., Zhang, C. L.， Fine, A,， Chiu, S. Y. and Messing, A., 1997. Live astrocytes visualized by green fluorescent protein in transgenic mice (通过绿色荧光蛋白观察转基因小鼠中的活星形细胞). Developmental biology. 187, 36-42.
权利要求
1. 涉及检测动物中目的荧光蛋白表达的方法，其中所述动物为转基因动物，在其基因组中具有编码所述荧光蛋白的核酸，所述编码所述荧光蛋白的核酸可操作地连接来自通常在所述动物神经系统中表达的蛋白的启动子核酸，所述方法包括非侵入性检测在所述动物中表达的所述蛋白的荧光的步骤。
2. 如权利要求l所述的方法，其中所述启动子为GFAP启动子。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其中所述荧光蛋白为绿色荧光蛋 白(GFP)。
4. 如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述方法用于研究 向所述动物给予测试物的影响，所述方法包括在非侵入性检测焚光的步 骤之前向所述动物给予所述测试物的步骤。
5. 如权利要求4所述的方法，其中所述方法包括以下步骤将来自 未给予所述测试物的对照动物的荧光与向所述转基因动物给予所述测试 物后来自所述转基因动物的荧光进行比较。
6. 如权利要求4或5所述的方法，其中所述方法包括以下步骤(i) 在给予所述测试物之前非侵入性检测所述转基因动物中的荧光， 以提供对照；(ii) 给予所述测试物之后非侵入性检测所述相同动物中的荧光；以及(iii) 将在(i)中检测的荧光与在(ii)中检测的荧光进行比较。
7. 如权利要求4或5所述的方法，其中所述方法包括以下步骤 (i)非侵入性检测第一动物中的荧光，以提供对照；(ii) 向第二转基因动物给予测试物，接着非侵入性检测所述动物中的焚光；以及(iii) 将在(i)中检测的荧光与在(ii)中检测的荧光进行比较。
8. 如权利要求4至7中任一项所述的方法，其中所述方法用于确定 所述测试物的神经毒性。
9. 如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述方法用于测试 测试物促进神经学损伤的治疗或调节神经学损伤的能力，其中所述方法 包括以下步骤(i) 在所述转基因动物中诱导神经学损伤；(ii) 在给予所述测试物之前非侵入性检测来自(i)的所述神经学损伤 动物中的荧光，以提供对照；(iii) 在给予所述测试物之后非侵入性检测来自(ii)的该相同动物中的 焚光；以及(iv) 将在(ii)中检测的荧光与在(iii)中检测的荧光进行比较。
10. 如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述方法用于测试 测试物促进神经学损伤的治疗或调节神经学损伤的能力，其中所述方法 包括以下步骤(i) 在第一动物中诱导神经学损伤，且非侵入性检测所述神经学损伤 动物中的荧光，以提供对照；(ii) 在第二转基因动物中诱导神经学损伤，并向所述动物给予所述测 试物，接着非侵入性检测所述动物中的荧光；以及(iii) 将在(i)中检测的荧光与在(ii)中检测的荧光进行比较。
11. 如权利要求9或IO所述的方法，其中所述神经学损伤是通过向 所述动物给予选择的化学品而诱导的。
12. 如权利要求11所述的方法，其中给予所述化学品以便提供所选 疾病的化学诱导动物模型。
13. 如权利要求12所述的方法，其中所述疾病选自帕金森病、阿尔 茨海默病或亨廷顿病。
14. 如权利要求11至13中任一项所述的方法，其中所述化学品选自 MPTP、 2'-CH3-MPTP、 6-羟基多巴胺(6-OHDA)、红藻氨酸、三曱基锡、 毒死蜱(CPF)、乙烯双二疏代氨基曱酸锰(代森锰或MB)、鱼藤酮、百草 枯(N，N'-二曱基-4-4'-联吡啶鑰)、聚氯联苯(PCBs)、 3,3'-亚氨基二丙腈 (IDPN)、曱苯(曱基苯)。
15. 如权利要求9或IO所述的方法，其中所述神经学损伤是通过对 所述动物的头和/或颈和/或背施加物理力而诱导的。
16. 如权利要求9或IO所述的方法，其中所述神经学损伤是通过减 少对所述动物神经系统的供氧导致脑缺血而诱导的。
17. 如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述方法用于测试 测试物促进神经系统疾病治疗的能力，其中所述方法包括以下步骤(i) 提供所述转基因动物，其中所述动物也是所述神经系统疾病的动 物模型；(ii) 在给予所述测试物之前非侵入性检测来自(i)的所述动物中的荧 光，以提供对照；(iii) 在给予所述测试物之后非侵入性检测来自(ii)的该相同动物中的 荧光；以及(iv) 将在(ii)中检测的荧光与在(iii)中检测的荧光进行比较。
18. 如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述方法用于测试 测试物促进神经系统疾病治疗的能力，其中所述方法包括以下步骤(i) 提供第一和第二动物，其中这两动物均为所述神经系统疾病的动 物模型；(ii) 在来自(i)的第一动物中，非侵入性检测所述动物中的荧光，以提 供对照；(iii) 在来自(i)的第二转基因动物中，向所述动物给予所述测试物， 接着非侵入性检测所述动物中的荧光；以及(iv) 将在(ii)中检测的焚光与在(iii)中检测的焚光进行比较。
19. 如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述方法用于测试 对神经系统疾病的治疗，其中所述方法包括以下步骤(i) 提供所述转基因动物，其中所述动物也是所述神经系统疾病的动 物模型；(ii) 在进行所述治疗之前非侵入性检测来自(i)的所述动物中的焚光， 以提供对照；(iii) 在进行所述治疗后非侵入性检测来自(ii)的所述相同动物中的焚 光；以及(iv) 将在(ii)中检测的焚光与在(iii)中检测的荧光进行比较。
20. 如权利要求4或5所述的方法，其中所述方法用于测试对神经系 统疾病的治疗，其中所述方法包^r以下步骤(i) 提供第一和第二动物，其中这两动物均为所述神经系统疾病的动 物模型；(ii) 在来自(i)的第一动物中，非侵入性检测所述动物中的焚光，以提 供对照；(iii) 在来自(i)的第二转基因动物中，对所述动物进行治疗，接着非 侵入性检测所述动物中的荧光；以及(iv) 将在(ii)中检测的荧光与在(iii)中检测的焚光进行比较。
21. 如权利要求19或20所述的方法，其中所述治疗包括应用X射 线或7射线。
22. 如权利要求17至21中任一项所述的方法，其中所述神经系统疾 病是神经系统肿瘤。
23. 如权利要求22所述的方法，其中所述肺瘤选自神经胶质瘤、成 神经管细胞瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤、室管膜瘤、神经鞘瘤、神经纤维 肉瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤。
24. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述动物为哺乳动物。
25. 如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述动物为新生动物。
全文摘要
本发明公开了一种涉及检测动物中目的荧光蛋白表达的方法，其中所述动物为转基因动物，在其基因组中具有编码所述荧光蛋白的核酸，所述编码所述荧光蛋白的核酸可操作地连接来自通常在所述动物神经系统中表达的蛋白的启动子核酸，所述方法包括非侵入性检测在所述动物中表达的所述蛋白的荧光的步骤。
文档编号G01N33/68GK101287365SQ200680038231
公开日2008年10月15日 申请日期2006年9月27日 优先权日2005年10月19日
发明者何炎坤, 朗 卓 申请人:科技研究局