专利名称：一种检测耐除草剂大豆中epsps基因的酶联免疫试剂盒及其使用方法
技术领域：
本发明涉及酶联免疫试剂盒领域，具体的说，涉及一种检测耐除草剂大豆中EPSPS基因的酶联免疫试剂盒及其使用方法。
背景技术：
根据农业生物技术应用国际服务组织(ISAAA)的报告，2006年全球转基因作物的种植面积达1.02亿公顷。在已实现商品化生产的转基因作物中，转基因耐除草剂大豆种植面积最大。这种大豆由于转入了5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)基因，该基因编码的酶是除草剂草甘磷的靶酶，从而使这种转基因大豆能在除草剂草甘磷的环境中正常生长。
随着转基因作物的商品化发展，许多国家(包括我国)加强了对其安全性评估和风险性分析，并制定了相应的管理法规。转基因产品的检测已纳入国内外检验检疫部门的检测项目。由于大豆在食品加工中具有广泛的应用，因此有很有必要建立对转EPSPS基因大豆的检测技术。
目前对转基因产品的检测主要有基于DNA水平的PCR方法和基于蛋白水平的免疫学检测方法。PCR方法具有灵敏度高的优点，但同时也存在操作繁琐(需要进行复杂的DNA提取步骤)、对操作人员素质要求较高、结果容易出现假阳性、检测成本较高等缺点。因此，PCR方法不适用于转基因产品的快速大量检测和口岸检疫。
转基因产品的免疫学检测方法主要有试纸条法和酶联免疫吸附法(ELISA)。试纸条法虽可部分克服上述PCR方法的不足(如美国Envirologix Incorporated，Strategic Diagnostics，Inc.和重庆金标生物技术有限公司生产的试纸条)，但试纸条只能进行简单的定性检测，无法实现定量，且检测灵敏度较低。
酶联免疫吸附法具有灵敏度高、操作简便、可定量检测等优点，现已成为常用的筛选方法。目前应用酶联免疫吸附方法检测转基因大豆已有报道(Rogan G等1999，Food Control 10407-414)，其设计原理是先在微孔条上包被针对EPSPS的单克隆抗体，然后加入标准品和待检样品，再加入兔抗EPSPS多克隆抗体，之后加入生物素标记的鼠抗兔IgG，再加入HRP标记的亲合素，最后加底物显色。操作过程太过繁琐，检测时间太长，故根本无法应用于实际工作中。另外，国外已经商品化的转基因大豆ELISA检测试剂盒(美国Agdia公司)则无法实现定量检测，且价格昂贵，使其推广应用受到限制。因此研制操作简单、准确高效、廉价的转基因大豆ELISA检测试剂盒非常有必要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高特异性、高灵敏度、价格低廉、操作简单，能大批量快速检测转基因大豆的酶联免疫检测试剂盒。
本发明的另一目的是提供上述酶联免疫检测试剂盒的使用方法。
一种检测耐除草剂大豆中EPSPS基因的酶联免疫试剂盒，包括抗EPSPS多克隆抗体、包被有抗EPSPS单克隆抗体的酶标板、酶标二抗。所述的包被有单克隆抗体的酶标板所用的包被缓冲液为pH9.6、0.05mol/L碳酸盐缓冲液。
在上述酶联免疫试剂盒中，所述试剂盒还包括转EPSPS基因大豆阳性质控品、非转基因大豆阴性质控品、显色剂、浓缩洗涤液、终止液。所述浓缩洗涤液优选0.01M，pH7.4，含有0.8～1.2％吐温20和0.5％硫柳汞防腐剂的磷酸盐缓冲液；所述终止液优选1～2mol/L的硫酸或氢氧化钠溶液；所述百分含量均为质量百分含量。
当标记酶为辣根过氧化物酶时，显色剂由显色液A液和显色液B液组成，显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，显色液B为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为1～2mol/L的硫酸；当标记酶为碱性磷酸酯酶时，显色液为4-硝基酚磷酸盐缓冲液，终止液为1～2mol/L氢氧化钠溶液。
在上述酶联免疫试剂盒中，所述抗EPSPS多克隆抗体是由如下方法制备而成(1)制备抗原重组EPSPS蛋白通过PCR方法从转基因大豆中扩增出CP4-EPSPS基因，使其在大肠杆菌中表达，再经Ni离子层析柱纯化，最后经过透析复性得到；(2)将得到的EPSPS蛋白免疫兔、鸡、羊、或马后，从动物血液中分离抗血清，再经过硫酸铵沉淀、脱盐得到纯化的抗EPSPS多克隆抗体。
在上述酶联免疫试剂盒中，所述抗EPSPS单克隆抗体是由如下方法制备而成(1)制备抗原重组EPSPS蛋白通过PCR方法从转基因大豆中扩增出CP4-EPSPS基因，使其在大肠杆菌中表达，再经Ni离子层析柱纯化，最后经过透析复性得到；(2)将得到的EPSPS蛋白免疫小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选杂交瘤细胞，克隆化后获得稳定的单克隆杂交瘤细胞株，再制备腹水，腹水经过离心、硫酸铵沉淀、脱盐、过Protein A亲和层析柱得到纯化的抗EPSPS单克隆抗体。
上述检测耐除草剂大豆中EPSPS基因的酶联免疫试剂盒的使用方法，包括以下步骤(1)加入待检测样品和系列标准品，使其中的EPSPS蛋白与固相载体上的单抗结合，洗去未结合的非特异性杂蛋白；(2)加入纯化的多抗，使其与EPSPS蛋白结合，洗去未结合的多余抗体及杂蛋白；(3)加入酶标二抗，使其与多抗结合，洗去未结合的酶标抗体及杂蛋白；(4)加入底物，室温作用，检测酶标记抗体的催化活性；(5)绘制标准曲线，从标准曲线上读出待检样品的转基因含量。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明建立的双抗体夹心ELISA检测转基因大豆中EPSPS蛋白可以达到1％的检测限，并能达到定量检测；本发明中免疫动物的抗原是直接从转基因大豆中克隆、体外表达并经过复性，保证了免疫抗原与天然抗原的一致性，因而制备了高特异性的抗体；本发明的免疫检测试剂盒对样品的前处理要求低，能同时快速检测大量样品；本发明的试剂盒结构简单，携带便利，价格便宜，适合于大量样品筛选的定性、定量检测。
图1为EPSPS蛋白的检测标准曲线图；图2为转基因大豆的检测结果图。
具体实施例方式
实施例1 本发明的检测试剂盒的建立过程一、抗原的制备(1)从转基因大豆中克隆CP4-EPSPS基因根据已公开的转基因大豆中CP4-EPSPS基因的序列，从基因的开放阅读框架两端设计引物，并分别加上HindIII和SalI酶切位点，设计的引物序列为引物F5’TTTGTCGACATGTCGCACGGTGCAAGGAGC 3’引物R5’AAAGCTTCAGGCAGCCTTCGTATGGGAG 3’按CTAB法从转基因大豆幼苗叶中抽提总DNA，以其作为模板，利用上述引物进行PCR扩增以克隆CP4-EPSPS基因。PCR反应参数为94℃预变性5min，然后按94℃30sec——62℃30sec——72℃1.5min循环35次，最后72℃10min。PCR产物连接到PMD-T18载体中，转化大肠杆菌，对阳性克隆进行测序。
(2)CP4-EPSPS基因在大肠杆菌中表达及纯化经测序确定正确的克隆，抽提质粒，用HindIII和SalI双酶切，切出目的片段，纯化，连接入PQE-9表达载体，转化大肠杆菌M15菌株。通过碱裂解法初步鉴定阳性克隆，质粒酶切法进一步鉴定，最后对阳性克隆进行测序以确认。
挑取阳性克隆入3ml LB液体培养基，37℃摇菌过夜，再转入300ml LB液体培养基，37℃摇至菌液OD600值为0.6，加入IPTG使其终浓度为1μmol/L，37℃诱导4小时。诱导后取1ml菌液在2％SDS中变性裂解，用SDS-PAGE电泳检测蛋白质表达水平。表达后的菌液在8mol尿素的条件下裂解、取上清，过Ni离子亲和层析柱，在pH 5.9条件下洗脱目标蛋白质。
(3)EPSPS蛋白的复性采用透析去除尿素的方法对EPSPS蛋白进行复性。按照尿素浓度8mol/L、6mol/L、4mol/L、2mol/L、0mol/L的梯度进行透析，每一浓度在4℃下透析12小时。复性产物离心去沉淀，上清部分用SDS-PAGE电泳检测纯度，再用BCA法检测蛋白浓度。
二、单克隆抗体的制备(1)动物免疫采用Balb/c小鼠为免疫动物，以纯化复性的EPSPS蛋白为免疫原，免疫剂量为50ug/只，首免时将免疫原与等量弗氏完全佐剂混合成乳化剂，皮下多点注射，间隔2周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，四免后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞。
(2)细胞融合与克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按5～10∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
(3)杂交瘤细胞核型分析与单抗亚型鉴定在杂交瘤细胞中加入秋水仙素(终浓度为0.1～0.4ug/ml)，经低渗处理、甲醇-冰醋酸固定、制片和Giemsa染色后，在油镜下计数100个分散较好且完整的中期分裂相细胞的染色体数目，求其均值。
利用HBT公司提供的单克隆抗体亚类测定试剂盒，检测杂交瘤细胞培养上清，以确定Ig类别和亚类。
(4)细胞冻存和复苏取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成1～5×106个/ml的细胞悬液，分装于冻存管，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
(5)腹水制备采用体内诱生法，将Balb/c小鼠(8周龄)腹腔注射灭菌石蜡油0.5ml/只，7～14天后腹腔注射杂交瘤细胞约5×106个/只，7～10天后采集腹水。
(6)抗体纯化腹水先经4℃12000rpm离心15分钟，去除杂质，再经50％、33％硫酸铵沉淀。沉淀物通过透析除盐，过Protein A亲和层析柱，用pH4.0的枸椽酸缓冲液洗脱IgG，并用适量固体Tris直接中和含有IgG的洗脱液。纯化抗体小量分装后放-20℃保存。
三、多克隆抗体的制备采用新西兰大白兔为免疫动物，以纯化并复性的EPSPS蛋白为免疫原，免疫剂量为1mg/只，首免时将免疫原与等量弗氏完全佐剂混合成乳化剂，皮下多点注射，间隔2周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫三次，四免后对兔子进行颈动脉采血，血液37℃下放置2小时，4℃过夜后离心得到抗血清。
抗体血清经过50％硫酸铵沉淀一次、33％硫酸铵沉淀两次后透析脱盐，小量分装后放-20℃保存。
四、酶联免疫吸附检测体系的建立及使用(1)包被用pH9.5碳酸盐缓冲液稀释前述纯化单克隆抗体(终浓度1.25ug/ml)，100ul/孔，4℃包被过夜。
(2)封闭每孔加入5％脱脂奶粉200ul，放37℃2小时，洗板。
(3)加样取100ul待检样品和系列标准品加入反应孔，放37℃2小时，洗板。
(4)加入前述纯化兔多克隆抗体(1∶3000)，100ul/孔。样品稀释液1％脱脂奶粉，37℃作用1小时，洗板。
(5)加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(1∶10000)，100ul/孔，洗板。
(6)加底物，底物中含0.1M柠檬酸缓冲液、0.01％TMB(W/V)、0.002％过氧化氢尿素(W/V)，室温反应10分钟，加入2M H2SO4终止反应，50ul/孔。测定OD450，空白孔调零。
(7)根据每个标准品溶液的浓度和吸光度绘制标准曲线，从标准曲线上读出待检样品的转基因含量。参见图1、图2。
实施例2转基因大豆酶联免疫检测试剂盒的精密度、准确度和保存期实验一、精密度实验取转基因大豆与非转基因大豆混合成10％、5％、2.5％三个浓度(w/w)，分别取实施例1制备的三个不同批次的试剂盒各三个，每个浓度重复5次，分别计算变异系数。结果如下，批内变异系数为5.12％，批间变异系数为10.3％。
二、准确度实验取三个浓度的EPSPS蛋白标准品(50ug/L、100ug/L、200ug/L)，添加到非转基因大豆样品中，进行添加回收实验，每个浓度做5个重复，分别计算准确度。结果表明，试剂盒回收率范围在80.7～110.2％之间。
三、保存期实验将试剂盒在37℃条件下放置4天，进行加速老化实验，然后对2％、5％、10％的转基因大豆进行检测，测定结果表明试剂盒各项指标符合要求。按通常法则，生物试剂在37℃每放置一天，相当于4～8℃保存一个半月。因此，试剂盒在4～8℃条件下至少可保存6个月。
权利要求
1.一种检测耐除草剂大豆中EPSPS基因的酶联免疫试剂盒，其特征在于包括抗EPSPS多克隆抗体、包被有抗EPSPS单克隆抗体的酶标板、酶标二抗。
2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括转EPSPS基因大豆阳性质控品、非转基因大豆阴性质控品、显色剂、浓缩洗涤液、终止液。
3.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述抗EPSPS多克隆抗体是由如下方法制备而成(1)制备抗原重组EPSPS蛋白通过PCR方法从转基因大豆中扩增出CP4-EPSPS基因，使其在大肠杆菌中表达，再经Ni离子层析柱纯化，最后经过透析复性得到；(2)将得到的EPSPS蛋白免疫兔、鸡、羊、或马后，从动物血液中分离抗血清，再经过硫酸铵沉淀、脱盐得到纯化的抗EPSPS多克隆抗体。
4.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述抗EPSPS单克隆抗体是由如下方法制备而成(1)制备抗原重组EPSPS蛋白通过PCR方法从转基因大豆中扩增出CP4-EPSPS基因，使其在大肠杆菌中表达，再经Ni离子层析柱纯化，最后经过透析复性得到；(2)将得到的EPSPS蛋白免疫小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选杂交瘤细胞，克隆化后获得稳定的单克隆杂交瘤细胞株，再制备腹水，腹水经过离心、硫酸铵沉淀、脱盐、过Protein A亲和层析柱得到纯化的抗EPSPS单克隆抗体。
5.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述浓缩洗涤液为0.01M，pH7.4，含有0.8～1.2％吐温20和0.5％硫柳汞防腐剂的磷酸盐缓冲液；所述终止液为1～2mol/L的硫酸或氢氧化钠溶液；所述百分含量均为质量百分含量。
6.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于当标记酶为辣根过氧化物酶时，显色剂由显色液A液和显色液B液组成，显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，显色液B为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为1～2mol/L的硫酸；当标记酶为碱性磷酸酯酶时，显色液为4-硝基酚磷酸盐缓冲液，终止液为1～2mol/L氢氧化钠溶液。
7.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的包被有单克隆抗体的酶标板所用的包被缓冲液为pH9.6、0.05mol/L碳酸盐缓冲液。
8.权利要求1所述酶联免疫试剂盒的使用方法，包括以下步骤(1)加入待检测样品和系列标准品，使其中的EPSPS蛋白与固相载体上的单抗结合，洗去未结合的非特异性杂蛋白；(2)加入纯化的多抗，使其与EPSPS蛋白结合，洗去未结合的多余抗体及杂蛋白；(3)加入酶标二抗，使其与多抗结合，洗去未结合的酶标抗体及杂蛋白；(4)加入底物，室温作用，检测酶标记抗体的催化活性；(5)绘制标准曲线，从标准曲线上读出待检样品的转基因含量。
全文摘要
本发明公开了一种检测耐除草剂大豆中EPSPS基因的酶联免疫试剂盒及其使用方法。该试剂盒包括抗EPSPS多克隆抗体、包被有抗EPSPS单克隆抗体的酶标板、酶标二抗、转基因大豆标准品、非转基因大豆标准品、浓缩洗涤液、显色液、终止液。该试剂盒的制备方法是从转基因大豆中克隆CP4－EPSPS基因并在大肠杆菌中表达，再经过蛋白纯化复性，以重组EPSPS蛋白为抗原免疫动物，获得特异性的单克隆抗体与多克隆抗体，建立双抗体夹心酶联免疫体系检测待检样品，以确定其中的EPSPS蛋白含量。
文档编号G01N33/543GK101042403SQ20071002771
公开日2007年9月26日 申请日期2007年4月25日 优先权日2007年4月25日
发明者梅曼彤, 许少鹏, 赵均良, 姚涓, 穆虹, 周峰, 姜大刚 申请人:华南农业大学