专利名称：：一种血清小分子代谢产物的检测方法
技术领域：
：本发明涉及分析化学和医学领域，是一种血清小分子代谢产物检测方法。
背景技术：
：气相色谱质谱联用系统(Gaschromatography/Massspectrometry,GC/MS)最早发明于上世纪六十年代，结合了气相色谱仪的高效分离能力与质谱仪的快速、高灵敏度检测、高鉴别分子结构的能力，迄今已经是一项非常成熟和稳定的化学分析技术。其工作的原理是多组分混合物样品经过色谱柱分离(可以通过化学衍生化的方法使混合物更容易分离)，得到各个单一组分，按保留时间顺序随同载气逐一进入质谱仪的离子源，单组分样品被电离成碎片(离子)，经质量分析器和检测器检测，可给出单一组分的质谱图，根据对所得质谱图进行计算机检索的结果，对这些单一组分进行定性、定量分析。仪器检测物质的质量范围广，测定质量范围为质荷比(m/z)10900。物质衍生化后分子量增加也可被充分测定。当今，气相色谱质谱联用仪已经普遍应用于环保、食品、石油化工、轻工、农药等各个领域中，在医学领域，主要用于医药、法医、毒品和兴奋剂的检测分析，在人体代谢组学领域的应用也日趋广泛。我国上海交通大学、北京大学都应用了该项技术对动物疾病模型的血液或尿液进行代谢组学的研究。国外有人成功地探讨了如何对人体血清用化学衍生化气相色谱质谱联用检测血清中的小分子代谢产物，进行代谢组学研究。我国浙江大学利用该技术进行了肝衰竭病人的血清代谢组学研究。但是，目前尚无采用气相色谱质谱联用系统检测肝癌患者血清特异小分子代谢峰的报道。
发明内容本发明的目的是提供一种操作方便、敏感性好、准确度高的血清小分子代谢产物检测方法。本发明提供了一种血清小分子代谢产物的检测方法，该方法包括以下步骤(1)对血清样本进行蛋白沉淀和小分子代谢产物的萃取；(2)对萃取物进行衍生化；(3)用气相色谱质谱联用系统对上述衍生化产物进行分离和鉴定，获得各小分子代谢产物图谱；(4)计算各小分子代谢产物指纹图谱的峰面积数据，并用判别方程检测结果。本发明中，(2)中采用甲氧胺吡啶溶液和N-甲基-N-(三甲基硅垸)三氟乙酰胺含1X三甲基氯硅烷(N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺含1%三甲基氯硅垸，是德国sigma公司生产的衍生化试剂，买来的成品就是混合物，其中二者的体积比99:1)这二种衍生化试剂依次进行二步衍生化。本发明中，将图谱峰面积按判别方程相加得到Zl和Z2的值；Zl的判别方程式为Zl=-67.60609+152.91327*峰84-19.26355*峰31-35.97298*峰76+58.68575*峰18-2.68238*峰30-114.53660*峰14+31.99892*峰28-67.37426*峰81+22.88033*峰62-19.31615*峰43+122.83181*峰4-82.09541*峰87-57.71720*峰2+38.14089*峰22-7.57512*峰91;Z2=_6.07158+32.34580*峰84-3.52482*峰31-4.80436*峰76+9.69755*峰18-0.56240*峰30-16.88349*峰14+5.01229*峰28-5.98591*峰81+3.84596*峰62-2.06431*峰43+16.92177*峰4-11.38467*峰87-5.45394*峰2+5.14309*峰22-2.09113*峰91;其中，峰84、峰31、峰76、峰18、峰30、峰14、峰28、峰81、峰62、峰43、峰4、峰87、峰2、峰22、峰91分别代表各图谱峰的峰面积，峰后面的数字代表该峰的出峰序号。"*"表示乘法。本发明中，色质谱条件为进样口温度200-30CTC，柱箱起始温度40-100。C，以1-20°C/min升至300°C，保持5-20min;惰性气体作为载气，流速0.5-5.Oml/min;四级杆温度120-180°C，离子源温度200_280°C;溶剂切除时间0-5min。本发明中，所述惰性气体可以是氦气。另一方面，本发明提供了上述方法在鉴别小分子代谢产物变异中的应用。本发明还提供了上述方法在鉴别肝癌患者中的应用。本发明中，Z1值小于Z2值者为肝癌患者的代谢检测结果。本发明中，小分子代谢产物与保留时间、图谱峰对应关系如下:编号保留时间物质名称编号保留时间物质名称<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本发明利用气相色谱质谱联用仪，可检测疾病患者血清小分子代谢产物指纹峰值，尤其如检测肝癌患者和健康人血清的小分子代谢产物谱，利用现有统计工具分析肝癌与正常人血清小分子代谢产物的不同之处，筛选出有强鉴别能力的峰群，利用现有技术构建判别方程，用于了解小分子代谢产物的成分和含量，以便诊断肝癌。本发明将肝癌、正常人空腹血清进行蛋白沉淀、溶剂萃取、衍生化后，通过气相色谱质谱联用仪(如美国安捷伦公司生产)检测，得到血清完整的小分子代谢谱，对其中所有小分子代谢产物进行定性、定量(峰面积计算)，再根据统计分析筛选出可以鉴别肝癌患者和正常人并且鉴别能力强的特异峰群，由现有的统计软件构建判别方程。利用判别方程，只要将受检人血清中相应特异代谢峰的峰面积代入，就可以用于肝癌的诊断。本发明提出的用于诊断肝癌的血清小分子代谢图谱模型的制备方法具体如下1)收集多例经病理明确诊断的肝癌患者空腹血清及经体检确定为健康者的储存于一80'C冰箱冷冻备用。检测时融解冰冻血清，混匀。2)采用甲醇去离子水溶液(v/v8:1)对上述肝癌患者和正常人的两组血清标本进行蛋白沉淀和小分子代谢产物的萃取；3)对萃取物用甲氧胺吡啶溶液和N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA)含1%三甲基氯硅烷(TMCS)二种衍生化试剂依次进行二步衍生化；4)用气相色谱质谱联用系统(美国安捷伦公司，型号6980/5973)对上述衍生化产物进行分离和鉴定，获得两组小分子代谢产物图谱；色谱条件进样口温度250。C，柱箱起始温度80°C，以15。CAiin升至30(TC，保持5min。氦气作为载气，流速lml/min。四级杆温度150°C，离子源温度230°C。溶剂切除时间3min;5)收集肝癌患者和正常人血清的小分子代谢产物指纹图谱的所有峰面积数据；6)对所得的数据进行统计学处理，根据处理结果可筛选出15个有强判别能力的特异峰群，包括丁酸、乙亚胺酸、丙三醇、缬氮酸、异亮氨酸、氨基丙二酸、赤鲜糖、棕榈酸、硬脂酸、9,12-十八碳二烯酸(亚油酸)、二乙基己基邻苯二甲酸酯，还有的为目前库谱尚不能检索出来的物质。将这15个物质作为判别肝癌患者和正常人的特异峰；7)选取上述15个特异峰构建判别方程，判别肝癌组和正常组。本发明提供了一种准确了解样品中特定小分子代谢产物的组分及含量的检测方法，该方法具有高度的敏感性和特异性，可以用于精确了解某一种小分子代谢产物的含量，鉴定癌症患者，特别适用于鉴别肝癌患者。利用本技术可以对肝癌患者与正常人，尤其是AFP阴性的肝癌患者进行鉴别诊断，也可用于肝癌的普查，对于早期诊断、早期治疗肝癌，提高肝癌患者的生存率有着重要的意义。本发明用于肝癌的早期检测和筛査，与肝癌其他的诊断方法比较，具有以下优点第一、本发明采用化学衍生化、气相色谱质谱联用的方法对肝癌患者和正常人的血清进行检测，筛选出来的具有强判别能力的肝癌患者与正常人具有差异的小分子代谢产物峰群构建的判别模型是肝癌早期检测和筛査的新方法，为进一步发现新概念的肝癌生物标记物提供了基础；第二、与以往的血清学检测方法比较具有高度的敏感性(100%)和特异性(100%)，是一种在小分子代谢产物水平上的诊断，对肝癌的早期诊断提供了新标准；第三、本发明模型的构建方法设计合理可行，为降低我国肝癌的病死率、提高肝癌的生存率提供了一种新的筛査方法；第四、应用支持向量机对本实验构建的判别模型进行交叉验证，得到其判别有效率为75%。图1为随机抽取的正常人的小分子代谢产物TIC图。纵坐标为出峰的丰度；横坐标为出峰的保留时间。图2为随机抽取的肝癌患者的小分子代谢产物TIC图。图3为衍生化样本1(重复试验l)的TIC图。图4为衍生化样本2(重复试验2)的TIC图。图5为衍生化样本3(重复试验3)的TIC图。图6为衍生化样本4(重复试验4)的TIC图。图7为衍生化样本5(重复试验5)的TIC图。图8为衍生化样本6(重复试验6)的TIC图。图9为区分肝癌病人和正常人的判别模式图(决策树)。具体实施例方式实施例1小分子代谢物质的检测1.材料1.l检测血清取受检者清晨空腹静脉血0.5mL，在4'C冰箱静置lh后离心(3000rpm，10min)。取血清，装入Eppendorf管(每管内100uL)，置深低温冰箱(一80°C)保存，备用。1.2所需主要试剂甲醇(农残级)美国Sigma公司盐酸甲氧胺(分析纯)美国Sigma公司N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA)含1%三甲基氯硅垸(TMCS)(分析纯)美国Sigma公司吡啶(分析纯)美国Sigma公司1.3所需主要仪器4"C冰箱海尔公司一80。C冰箱Revco公司恒温高速台式离心机(型号Z400K):HERMLE公司烘箱(型号FD):Binder公司加样器Eppendorf公司纯水系统Millipore公司第U冰机Scotsman公司电子天平(BD202):METTLERTOLEDO公司涡旋混合仪(型号H101):上海康禾光电仪器有限公司超声混合仪(型号DL—120A):上海之信仪器有限公司高效样品浓縮仪(型号NS—2A):上海强运科技有限公司气相色谱质谱联用仪(型号6980/5973):安捷伦公司2.方法2.l试剂配置甲氧胺吡啶溶液盐酸甲氧胺1.5gP比啶100mL振荡、超声混匀，密封膜密封瓶盖，置于4'C保存。2.2血清样品准备(1)每个样本从深低温冰箱中取出一管血清，放入烘箱(37°C)10min;(2)从烘箱中取出融解的血清，置于涡旋混合仪上混匀15s。2.3蛋白沉淀和溶剂萃取(1)每管(100yL)血清内加入lOOuL去离子水、800yL甲醇，置于涡旋混匀仪上混匀10min;(2)冰浴10min，放入超声混匀仪内超声混匀5min，继续冰浴10min;(3)放入恒温高速台式离心机中，4度12000rpm离心10min;(4)取上清液800uL放入安剖瓶中，置于高效样品浓缩仪上，室温下用氮气吹干。2.4衍生化反应(1)每个安剖瓶内加入400uL甲氧胺吡啶溶液(浓度15ug/uL)，火焰上灌封，涡旋混合仪上混匀10min，放入37度烘箱10h后取出，置于高效样品浓縮仪上，室温下用氮气吹干；(2)加入400uLMSTFA含1%TMCS，火焰上灌封，涡旋混合仪上混匀10min，放入120度烘箱1.5h;(3)取出，室温冷却，待GC/MS上样。2.5GC/MS检测(1)取1PL衍生化样本，无分流进样；(2)色谱条件进样口温度250'C柱箱升温程序起始温度8(TC，以15'C/min升至30(TC，保持5min载气氦气，流速lml/min，四级杆温度150°C，离子源温度230°C，溶剂切除时间3min;(3)保存每个样本的总离子流色谱图(totalionschromatogram，TIC)，如图1-图2;(4)对TIC中的每个峰进行NIST谱库的査询，鉴定该峰为何物质，并对出现的峰进行手动峰面积积分；由此，获得样品中各小分子物质的成分和含量。实施例2血清样品重复性和进样准确性分析(1)取同一份血样的三管血清，重复上述实验步骤，得到的TIC图重叠性咼；(2)取一份衍生化后的样本，连续重复6次进样，得到的TIC图重叠性高，出峰的保留时间、峰面积差异小(图3-图8)。实施例3用于鉴别肝癌患者和非肝癌患者人群采用SAS8.0统计软件，选用逐步判别分析法筛选可以鉴别二组的特征峰(15个，包括丁酸、乙亚胺酸、丙三醇、缬氨酸、异亮氨酸、氨基丙二酸、赤鲜糖、棕榈酸、硬脂酸、9,12-十八碳二烯酸、二乙基己基邻苯二甲酸酯，还有的为目前库谱尚不能检索出来的物质)，用所得的峰构建判别方程Zl=-67.60609+152.91327PEAK84-19.26355PEAK31-35.97298PEAK76+58.68575PEAK18-2.68238PEAK30-114.53660PEAK14+31.99892PEAK28-67.37426PEAK81+22.88033PEAK62-19.31615PEAK43+122.83181P隱4-82.09541PEAK87-57.71720PEAK2+38.14089PEAK22-7.57512PEAK91;Z2=-6.07158+32.34580PEAK84-3.52482PEAK31-4.80436PEAK76+9.69755PEM18-0.56240PEAK30-16.88349PEAK14+5.01229PEAK28-5.98591PEAK81+3.84596PEAK62-2.06431PEAK43+16.92177PEAK4-11.38467PEAK87-5.45394PEAK2+5.14309PEAK22-2.09113PEAK91(其中PEAK代表的是峰面积，PE线后面的数字代表的是该峰的序号)，采用LIBSVM软件对判别模式进行支持向量机k-折交叉验证(k=20)。结果分析使用SAS8.O统计软件对受检者血清小分子代谢产物谱进行分析，得到能够判断肝癌的特征小分子代谢产物群，可用于肝癌的诊断。本发明方法判别结果汇总表如下:实际组别判别为正常组判别为肿瘤组判别有效率的百分比的百分比正常组100%0%100%肿瘤组0%100%100%权利要求1.一种血清小分子代谢产物的检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)对血清样本进行蛋白沉淀和小分子代谢产物的萃取；(2)对萃取物进行衍生化；(3)用气相色谱质谱联用系统对上述衍生化产物进行分离和鉴定，获得各小分子代谢产物图谱；(4)计算各小分子代谢产物指纹图谱的峰面积数据，并用判别方程检测结果。2.如权利要求l所述的方法，其特征在于，(2)中采用甲氧胺吡啶溶液和N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺含1%三甲基氯硅烷这二种衍生化试剂依次进行二步衍生化。3.如权利要求l所述的方法，其特征在于，将图谱峰面积按判别方程相加得到Zl和Z2的值；Zl的判别方程式为Zl=-67.60609+152.91327*峰84-19.26355*峰31-35.97298*峰76+58.68575*峰18-2.68238*峰30-114.53660*峰14+31.99892*峰28-67.37426*峰81+22.88033*峰62-19.31615*峰43+122.83181*峰4-82.09541*峰87-57.71720*峰2+38.14089*峰22-7.57512*峰91;Z2=_6.07158+32.34580*峰84-3.52482*峰31-4.80436*峰76+9.69755*峰18-0.56240*峰30-16.88349*峰14+5.01229*峰28-5.98591*峰81+3.84596*峰62-2.06431*峰43+16.92177*峰4-11.38467*峰87-5.45394*峰2+5.14309*峰22-2.09113*峰91;其中，峰84、峰31、峰76、峰18、峰30、峰14、峰28、峰81、峰62、峰43、峰4、峰87、峰2、峰22、峰91分别代表各图谱峰的峰面积，峰后面的数字代表该峰的出峰序号。4.如权利要求l所述的方法，其特征在于，色质谱条件为进样口温度200-300。C，柱箱起始温度40-100。C，以1-20。C/min升至300。C，保持5-20min;惰性气体作为载气，流速0.5-5.Oml/min;四级杆温度120-180。C，离子源温度200-280°C;溶剂切除时间0-5min。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，惰性气体为氦气。6.如权利要求1所述方法在鉴别小分子代谢产物变异中的应用。7.如权利要求l所述方法在鉴别肝癌患者中的应用。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，Z1值小于Z2值者为肝癌患者的代谢检测结果。全文摘要本发明涉及分析化学和医学领域，是一种血清小分子代谢产物检测方法。本发明提供了一种准确了解样品中特定小分子代谢产物的组分及含量的检测方法，即首先对人血清样本进行蛋白沉淀和小分子代谢产物的萃取并衍生化，然后用气相色谱质谱联用系统对上述衍生化产物进行分离和鉴定，获得各小分子代谢产物图谱；最后计算各小分子代谢产物指纹图谱的峰面积数据，并用判别方程检测结果。本发明的方法具有高度的敏感性和特异性，可以用于精确了解某一种小分子代谢产物的含量，鉴定癌症患者，特别适用于鉴别肝癌患者。文档编号G01N1/28GK101122600SQ200710044918公开日2008年2月13日申请日期2007年8月16日优先权日2007年8月16日发明者沈锡中,玲董,薛如意,邓春晖申请人:复旦大学附属中山医院;复旦大学