专利名称：：一种量子点生物探针及其制备方法和基于其的微流控蛋白质芯片的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物检测领域，特别涉及一种量子点生物探针及其制备方法和基于其的微流控蛋白质芯片。
背景技术：
：目前，蛋白质芯片中的检测探针多采用传统生物荧光染料，如常用的有嗅乙锭、诺丹明等，这类染料只能进行单色标记，且其稳定性差，灵敏度也受到限制，越来越难以满足蛋白质芯片的实际需要。纳米量子点是一类由n-vi族或m-v族元素组成的半径小于或接近激子波尔半径的半导体纳米粒子，具有独特的光电性质，比生物医学研究中常用的传统荧光发色团更易检测到。纳米量子点具有特有的量子尺寸效应和表面效应，相对于传统的荧光染料分子用纳米量子点作标记物具有许多优点激发光谱宽，发射光谱窄、对称，荧光发射波长可通过改变量子点的尺寸和组分而加以调节，因而不同尺寸的量子点能被单一波长的光激发而发射不同颜色的荧光，方便用于多目标分子的多色标记。因此量子点作为一类新型的荧光标记物，在分子生物学、免疫生物学、临床医学等生物医学领域显示出越来越诱人的应用前景。目前纳米量子点，主要是有机相量子点已被应用于常规体外分析(US2001/0023078、CN1515909)或传感器制作(US6379622),以及作为生物偶联的光学成像探针进行组织和细胞的研究(WO2006/001848、WO2006/005065)等。但在蛋白质芯片中的应用还很少见。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种用于蛋白质芯片的量子点生物探针及其制备方法，其中量子点选用水溶性量子点。本发明人在研究中发现，水溶性量子点在生物分子特别是蛋白质标记中的技术及应用，与传统量子点(有机相量子点)在功能和特质上表现出明显的不同。与有机相量子点相比，水溶性量子点与生物分子具有更好的亲和性，通过两者之间更高效率的偶联，可以获得更高性能的"量子点-生物"复合探针；另外，因为水溶性量子点无有机试剂残留，所以对生物分子(特别是蛋白质)的活性损伤可以减至最小，可以更好地发挥生物探针的结合性能。因此，本发明提供的一种量子点生物探针，其是水溶性量子点和靶蛋白配体连接而成的量子点-生物复合探针。根据本发明，所说的水溶性量子点是指采用水相法制备的暈子点，即在制备过程中未使用有机试剂，如可以根据CN1693206A、CN1693207A、CN1693208A、CN1687304A及CN1793923等专利文献中公开的方法制备。本发明优选CdTe及核壳量子点CdTe/CdS等水溶性量子点为例来进行说明。根据本发明，所述的靶蛋白配体为各种可与靶蛋白质分子特异性结合的生物分子，如免疫球蛋白、抗体片断、核酸适体、融合蛋白和蛋白质复合体等。而本发明所述的量子点生物探针的制备方法，其包括水溶性量子点和靶蛋白配体进行偶联反应，并将偶联产物进行纯化。从理论上说，可以通过调整量子点与靶蛋白配体之间的比例，在量子点表面连接一个或一个以上不同数目的靶蛋白配体。为减少交联物的形成，水溶性量子点与配体的配比优选为摩尔比1:11:20，优选1:31:10(根据后面实施例概括出)，故通常每个水溶性量子点上组装120个，更优选115个靶蛋白配体分子。在配体分子与量子点之间通过物理吸附结合的基础上，为制备更稳定的复合探针，更佳地可以选择化学偶联方式增强二者之间的有效连接；换言之，本发明偶联反应中还可采用偶联剂，诸如生物偶联反应中常选用的碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺等。当本发明靶蛋白配体选用核酸适体时，按目前DNA分子组装常用的方法通常选用用于调节核酸类分子界面组装密度的多聚腺苷酸(T10)作为共组装物。同其他生物偶联反应，本发明反应完毕后需进行纯化，即除去未反应的原料及副产物。所述的纯化方法也可以选用现有技术，例如离心、超滤等方法。其中超滤可选用不同级别超滤管来分别除去小分子和大分子物质，如采用40k超滤管超滤除去未反应的量子点和小分子副产物后，截留液再采用500k超滤管超滤除去未反应的靶蛋白配体和大的交联物，收集滤过液，得到偶联物。由于不同粒径和结构的量子点具有不同荧光，故可以将不同粒径和/或结构的量子点与不同的靶蛋白配体进行偶联反应得到各种偶联物，作为蛋白质芯片中的多色信号探针(检测探针)。因此，本发明还提供一种微流控蛋白质芯片，其包括靶蛋白、捕获探针和信号探针，其中信号探针采用上述本发明的量子点生物探针。根据本发明，当所述的微流控蛋白质芯片为单向微流控蛋白质芯片时，其中不同靶蛋白所对应的作为信号探针的生物探针带有不同荧光光谱的量子点。具体来说在单向微流控芯片反应区域固定多种靶蛋白捕获探针，各种探针在该区域按一定比例均匀分布；当靶蛋白样品通过微流控通道流经该区域时，各种靶蛋白被相应的捕获探针捕获并结合为一级复合物；然后通过微流动力系统及微型管道将包含有不同量子点标记的信号探针引入反应区域，并与所形成的各种一级复合物结合，形成各种二级复合物；每种靶蛋白所对应的二级复合物含有一种量子点纳米粒子，不同的靶蛋白对应不同的量子点，具有不同荧光光谱；在一定发射光谱范围内测量各种量子点的荧光强度，即可获得相应靶蛋白的定性和定量信息。当所述的微流控蛋白质芯片为双向微流控蛋白质芯片，其中不同靶蛋白所对应的作为信号探针的生物探针可以带有相同荧光光谱的量子点。具体来说通过一个方向的多条微流控管道在微流控芯片反应区域固定多种靶蛋白捕获探针，每条微型管道对应一种捕获探针；样品通过与前一方向非平行的一条或多条微型管道流经芯片反应区域，并与其呈交叉状态，靶蛋白与相应交叉区域的对应捕获探针结合形成一级复合物；然后通过微流动力系统及微型管道将包含有相同量子点标记的不同信号探针引入反应区域，并与所形成的各种一级复合物结合，形成各种二级复合物；各种靶蛋白所对应的二级复合物均含有相同量子点纳米粒子，具有相同的荧光光谱；在同一固定波段测定量子点的荧光强度，各种二级复合物将在蛋白质芯片的特定空间位置上给出与靶蛋白数量对应的信号强度，经后续数据分析可以实现特定靶蛋白的定性和定量分析。本发明通过水溶性量子点表面所固有的金属-非金属键，实现与靶蛋白配体的偶联，构建多色信号探针，荧光量子效率达到60%以上，蛋白质配体活性保持在50。％以上。图1为基于本发明水溶性CdTe量子点探针的双向微流控蛋白质芯片分析图。'具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。实施例中的水溶性量子点根据现有技术自行制备。其中，不同最大发射波长CdTe/CdS量子点的制备，可以通过控制CdS壳外延生长的反应时间进行控制CdS壳的厚度，从而实现调控不同粒径CdTe/CdS量子点的目的。实施例1~31、水溶性CdTe量子点的制备(直径3nm左右)，根据CN1693206A中公开的方法制备(1)碲氢化钠制备将92.7毫克NaBH4固体和127.6毫克Te粉放入到一个小的烧瓶中，加入3毫升水，于15T:下反应7个小时后，可得到NaHTe溶液备用；(2)CdTe前体溶液制备将30毫克CdCl2溶于100毫升水，加入0.03毫升巯基乙酸，用0.5摩尔/升的NaOH溶液调节pH=9，注入0.3毫升NaHTe溶液，作为CdTe前体溶液；(3)程序控制微波辐射制备CdTe量子点将所得到的CdTe前体溶液进行程序控制微波辐射，可得到CdTe量子点。控制条件如下第一程序微波功率70W;第一程序温度:80°C;第一程序时间60s;第二程序微波功率300W;第二程序温度ll(TC;第二程序时间5min。2、将250uL水溶性CdTe量子点(10uM)、240uL巯基衍生的凝血酶核酸适体(实施例1)、巯基衍生的血小板生长因子核酸适体(实施例2)或巯基衍生的免疫球蛋白E蛋白核酸适体(实施例3)lOOuM(0.5MPBS，0.1%NaN3，pH6.5)、200uM多聚腺苷酸(T10)混合，室温反应16小时后，逐歩加入NaCl至浓度为3M，室温老化40小时。3、将步骤2反应液采用10000G离心20分钟，去除上清液，纯净水洗漆；反复离心洗涤35次，所得沉淀用PBS重悬浮。4、测定悬浮液在波长260nm处的紫外吸收，并用荧光分析仪检测荧光强度，通过标准曲线插入法计算得出，每个量子点所偶联的核酸配体分子数约为6-15个。荧光光谱法测得荧光量子效率达到70%，杂交分析法测得配体活性保持在95%。上述实施例中各核酸适体由上海生工生物工程公司合成。实施例4~51、水溶性CdTe/CdS量子点的制备，根据CN1693207A中公开的方法制备(1)碲氢化钠制备将90.5毫克NaBH4固体和91.2毫克Te粉放入到一个小的烧瓶中，加入3毫升水，于10摄氏度下反应10个小时后，可得到NaHTe溶液，备用；(2)CdTe量子点制备将22.5毫克CdCl2溶于100毫升水，加入0.03毫升巯基乙酸，用0.5摩尔/升的NaOH溶液调节pH=9.5,通氮气30分钟，升温至100摄氏度，注入0.2毫升NaHTe溶液，反应3小时，得到CdTe量子点溶液；(3)CdTe/CdS前体溶液制备将18.5毫克CdCl2和5.6毫克Na2S溶于IOO毫升水，加入0.06毫升巯基乙酸，用0.5摩尔/升的NaOH容颜调节pH=10.5，注入10毫升CdTe量子点溶液，得到CdTe/CdS前体溶液；(4)微波辐射制备CdTe/CdS核/壳型量子点将所得到的CdTe/CdS前体溶液进行微波辐射制备，可得到CdTe/CdS核/壳型量子点。微波辐射条件如下微波功率50W;温度IO(TC;时间lmin(实施例4);3min(实施例5)。分别得到最大发射波长为535nm和547nm的两种CdTe/CdS型核/壳量子点。2、将250uL两种不同荧光波长的水溶性CdTe/CdS量子点(10uM)分别与240uL的CA50(所用量子点的最大发射波长为535nm，实施例4)和CA125(所用量子点的最大发射波长为547nm，实施例5)两种肿瘤标志蛋白的多克隆抗体(商购自美国FITZGERALD公司)30uM(0.5MPBS，0.1%NaN3，pH7.5)混合，室温反应2小时后，(C过夜。3、反应液采用40k超滤管(美国PALL公司)，3000G离心3分钟，去除未反应的量子点和副产物，收集上层溶液。4、收集液采用500k超滤管(美国PALL公司)，3000G离心3分钟，去除由多个抗体和量子点聚合形成的交联物，收集下层滤液。5、测定滤液在波长280nm处的紫外吸收，并用荧光分析仪检测荧光强度。通过标准曲线插入法计算得出，每个量子点所偶联的免疫球蛋白分子数约为15个。荧光光谱法测得荧光量子效率达到60%，免疫分析法测得蛋白质配体活性保持在75%。实施例6~71、水溶性CdTe/CdS量子点的制备实验过程基本同实施例45，微波辐射条件如下微波功率50W;温度IOO'C;时间5min(实施例6);10min(实施例7)。分别得到最大发射波长为559nm和579nm的两种CdTe/CdS型核/壳量子点。2、将250uL两种不同荧光波长的水溶性CdTe/CdS量子点(10uM)分别与240uLCA19-9(所用量子点的最大发射波长为559nm，实施例6)或CA15-3(所用量子点的最大发射波长为579nm，实施例7)两种肿瘤标志蛋白的多克隆抗体(商购自美国FITZGERALD公司)30uM(0.5MPBS，0.1%NaN3，pH7.3)，以及5uL碳化二亚胺(500mM)和5uLN-羟基琥珀酰亚胺(100mM)混合，室温反应2小时后，4t过夜。3、反应液采用40k超滤管(美国PAIX公司)，3000G离心3分钟，去除未反应的量子点和异脲副产物，收集上层截留溶液。4、收集液采用500k超滤管，3000G离心3分钟，去除由多个抗体和量子点交联形成的聚合物，收集下层滤液。5、测定滤液在波长280nm处的紫外吸收，并用荧光分析仪检测荧光强度。通过标准曲线插入法计算得出，每个量子点所偶联的免疫球蛋白分子数约为15个。荧光光谱法测得荧光量子效率达到60%，免疫分析法测得蛋白质配体活性保持在75%。实施例8采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)制备平行的单向微流控通道，方法可参考现有技术[如Duffy,DC等，《AnalyticalChemistry》第70巻(1998年)第4974页]。该微通道与芯片基片通过表面等离子体技术进行不可逆封合。1、将CA50、CA125、CA19-9和CA15-3等4种肿瘤标志蛋白的单克隆抗体通过1条单向微流控通道内固定在通道与芯片反应区的接触区域，4种抗体的浓度均为200mg/L，2小时后进行洗涤和封闭等后处理，方法可参考现有技术(如专利文献03150532.5)。2、将浓度为10ng/ml的CA50、CA125、CA19-9和CA15-3等4种肿瘤标志蛋白通过同一微通道进入芯片反应区域，流动速度为2微升/小时，5分钟后停止进样。3、芯片经洗涤后，以与步骤2中同样的进样方式将实施例4~7获得的4种量子点分别标记的CA50、CA125、CA19-9和CA15-3等4种肿瘤标志蛋白的多克隆抗体注入芯片反应区域，5分钟后停止进样。4、芯片洗涤后在荧光检测器(德国ZEISS公司AXIOSKOP2型)下采集针对4种量子点发射波长的荧光强度，并应用仪器配套软件进行信号数据处理。结果:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例9采用聚二甲基硅氧烷(PDMS)制备相互垂直的双向微流控通道，方法可参考本发明人的专利申请文件，申请号为CN200610117234,X。该微通道与芯片基片通过物理方法进行可逆封合。1、将凝血酶、血小板生长因子和免疫球蛋白E等3种蛋白质的单克隆抗体通过3条同一方向的独立微流控通道固定在芯片反应区，3种抗体的浓度均为150mg/L，2小时后进行洗涤和封闭等后处理。2、将浓度分别为10pg/ml、20pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200pg/ml和500pg/ml的凝血酶、血小板生长因子或免疫球蛋白E等3种靶蛋白通过与步骤l中微通道方向垂直的另一方向的微流控通道进入芯片反应区域，流动速度为2微升/小时，5分钟后停止进样。3、芯片经洗涤后，以与步骤2中同样的进样方式将实施例1~3获得的同种量子点分别标记的凝血酶、血小板生长因子和免疫球蛋白E等3种蛋白质的核酸适体注入芯片反应区域，5分钟后停止进样。4、芯片经洗涤后在荧光检测器(德国ZEISS公司AXIOSKOP2型)下观察耙蛋白与信号探针的反应情况，采集各空间分离的反应单元内的量子点信号，应用仪器配套软件进行信号数据处理。结果如图1所示，基于水溶性CdTe量子点探针的双向微流控蛋白质芯片可以实现的靶蛋白检测最低限为10pg/ml。可见，本发明量子点生物探针作为信号探针的微流控蛋白质芯片，其检测结果较现有微流控蛋白质芯片具有更佳的灵敏度和特异性。权利要求1.一种量子点生物探针，其是水溶性量子点和靶蛋白配体连接而成的量子点-生物复合探针。2、如权利要求1所述的量子点生物探针，其特征在于所述的水溶性量子点为CdTe和/或CdTe/CdS。3、如权利要求1所述的量子点生物探针，其特征在于所述的靶蛋白配体选自免疫球蛋白、抗体片断、核酸适体、融合蛋白和蛋白质复合体中的一种或几种。4、一种如权利要求1~3任一项所述的量子点生物探针的制备方法，其包括将水溶性量子点和靶蛋白配体进行偶联反应，并将偶联产物进行纯化。5、如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的偶联反应中水溶性量子点和靶蛋白配体的摩尔比为1:11:20，每个水溶性量子点上组装l20个靶蛋白配体分子。6、如权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的偶联反应还可采用偶联剂，所述的偶联剂为碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺。7、如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的纯化采用40k超滤管超滤后，截留液再采用500k超滤管超滤，收集滤过液。8、一种微流控蛋白质芯片，其包括靶蛋白、捕获探针和信号探针，其特征在于所述的信号探针采用如权利要求1~3任一项所述的量子点生物探针。9、如权利要求8所述的微流控蛋白质芯片，其特征在于所述的微流控蛋白质芯片为单向微流控蛋白质芯片，其中不同靶蛋白所对应的作为信号探针的生物探针带有不同荧光光谱的量子点。10、如权利要求8所述的微流控蛋白质芯片，其特征在于所述的微流控蛋白质芯片为双向微流控蛋白质芯片，其中不同靶蛋白所对应的作为信号探针的生物探针带有相同荧光光谱的量子点。全文摘要本发明公开了一种量子点生物探针及其制备方法。该生物探针是水溶性量子点和靶蛋白配体通过偶联反应连接而成的量子点-生物复合探针。本发明还提供采用上述量子点-生物复合探针作为信号探针(检测探针)的微流控蛋白质芯片。本发明采用水溶性量子点，与蛋白质等生物分子具有更好的亲和性，通过两者之间更高效率的偶联，可以获得更高性能的量子点-生物复合探针；另外，因为水溶性量子点无有机试剂残留，所以对蛋白质等生物分子的活性损伤可以减至最小，更好地发挥生物探针的结合性能。文档编号G01N33/566GK101368944SQ20071004488公开日2009年2月18日申请日期2007年8月15日优先权日2007年8月15日发明者耀何,宋世平,樊春海,汪联辉,娟颜,维黄申请人:苏州市长三角系统生物交叉科学研究院有限公司