专利名称：：基于蛋白芯片的免疫共沉淀检测蛋白相互作用的方法以及一种蛋白相互作用检测试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物领域，具体涉及一种对蛋白相互作用的检测方法。
背景技术：
：免疫沉淀(immunoprecipitation，IP)是利用抗原和抗体的特异性结合(例如细菌蛋白质"蛋白A〃和免疫球蛋白FC片段的特异性地结合)开发出来的方法。例如，用蛋白X的抗体A免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白Y可能也被沉淀下来。基于与蛋白X的生理性相互作用，蛋白Y的免疫沉淀就叫免疫共沉淀(co-iramunoprecipitation，Co-IP)。免疫共沉淀是发现或验证两种蛋白质间生理性相互作用的最有效、最常用的方法。它的具体操作是在保持蛋白一蛋白相互作用(protein-proteininteraction,PPI)的条件下收获和裂解细胞，从细胞提取液中免疫沉淀目的蛋白，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离免疫沉淀物。目前多用纯化的蛋白A预先结合固定在琼脂糖(argarose)磁珠(beads)上，使之与抗原、抗体反应后的细胞裂解液作用，磁珠(beads)上的蛋白(prorein)A就能吸附细胞裂解液中的抗原，从而达到沉淀靶标蛋白(抗原)和与其相互作用的蛋白的目的。再进一步通过SDS-PAGE分离、免疫印迹(Westernblot)检测相互作用蛋白。传统的co-IP作为检测和鉴定PPI最经典和有效的方法，在功能基因组研究中发挥了巨大的作用，然而这种方法本身也存在着一些明显的不足如操作过程复杂烦琐，费时费力，常需要培养大量细胞。并且，通过SDS-PAGE分离免疫沉淀物、Westernblot检测相互作用进一步延长了实验过程，极大程度上限制了检测的效率，因而不符合高通量检测的要求。另一方面，在当今蛋白质组时代，相关研究的逐步深入，需要大量数据信息作为分析研究蛋白质的的基础。传统的co-IP检测鉴定方法不能满足其需要。蛋白质芯片(proteinarray)是近年来兴起的一种有效的高通量研究方法。它与基因芯片相似，是将蛋白质固定到固相载体上，然后与需检测的组织或细胞等进行特异性地相互识别，再通过自动化仪器分析得出结果。与传统的研究方法相比，蛋白质芯片的优点是小型化和高通量化，能够一次平行分析成千上万的蛋白样品，具有很高的灵敏度和准确性。然而，现有蛋白芯片，如美国BDClontech公司推出的抗体芯片，是在芯片上排列了378种已知蛋白的单抗(AbMicroairay380，目录号K1847-l)，通过免疫反应，在实验中筛选出与其中一种或几种单抗相关联的蛋白。这种芯片，只通过免疫反应检测单抗与蛋白之间的反应，因而需要点入多种单抗。其主要缺点是必须获得各种蛋白的抗体，而目前可获得的抗体非常有限，难以满足当今蛋白质组学研究的要求。而本发明利用融合蛋白的表位标签，使用通用抗体制备抗体芯片，在芯片上进行任意两种蛋白相互作用的检测，克服了抗体芯片制备中抗体难获得的瓶颈问题。
发明内容本发明的目的在于将免疫共沉淀反应与蛋白芯片结合应用，利用芯片技术建立一种简捷实用、快速灵敏的高通量分析蛋白一蛋白相互作用(PPI)的方法。本发明提供一种基于蛋白芯片的免疫共沉淀检测蛋白相互作用的方法，其中，制备一Flag抗体芯片，然后将含有Flag-诱饵融合蛋白和Myc-猎物融合蛋白的细胞裂解液加入到芯片表面进行免疫共沉淀反应，经荧光标记c-Myc抗体检测诱馆蛋白和猎物蛋白是否具有相互作用。本发明提供的基于蛋白芯片的免疫共沉淀检测蛋白相互作用的方法，采用以下步骤步骤一制备Flag抗体芯片，将醛基玻片分成多个芯片框，将anti-flagM2单抗及作为抗体对照的鼠IgG喷点到各芯片框内，保存备用；步骤二构建诱饵和猎物表达载体，将诱馎的编码基因构建到flag标签载体上，将猎物的编码基因构建到Myc标签载体上，分别形成诱饵融合蛋白和猎物融合蛋白；步骤三细胞转染及制备裂解液，将诱饵和猎物真核表达载体共转染到细胞中，收集细胞并充分裂解，将实验品细胞裂解液上清收集待用；同样制备阴性对照品细胞裂解液收集待用；步骤四检测蛋白相互作用，将实验品细胞裂解液和对照品细胞裂解液分别加入处理后的芯片中不同芯片框内，免疫共沉淀反应一定时间后，洗涤；在每一芯片框内再加入anti-c-Myc-Cy3，反应一段时间后洗涤，干燥后用荧光芯片扫描仪扫描；步骤五将荧光芯片扫描仪中获取的信号及数据输出，比较实验品和对照品的荧光信号，实验品信号强度强于对照品的，说明诱饵与猎物蛋白之间有相互作用，反之，没有信号或信号微弱的说明诱饵与猎物蛋白之间没有相互作用。本发明提供的基于蛋白芯片的免疫共沉淀检测蛋白相互作用的方法，步骤一中Flag抗体芯片用贴膜分为3X6个芯片框，每个芯片框内平行点入anti-flagM2单抗及作为抗体对照的小鼠IgG，anti-flagM2单抗和小鼠IgG各点3个重复点。本发明提供的基于蛋白芯片的免疫共沉淀检测蛋白相互作用的方法，步骤四中芯片处理是指用封闭液封闭芯片，室温孵育，然后用TBST重复洗涤；将实验品细胞裂解液和对照品细胞裂解液加入芯片框中的量为20u1/框；所述免疫共沉淀反应指在室温保湿条件下反应2小时；所述洗涤指用TBST洗涤15分钟，重复3次；所述加入anti-Myc-Cy3单抗的浓度为1:200，加入量为20u1/芯片框，反应在室温避光保湿条件下反应1小时。本发明还提供一种蛋白相互作用检测试剂盒，包括一具有多个分区的醛基玻片，上述方法中的FLAG和c-Myc标签载体和其对应的单抗，以及基于上述方法的使用说明书。本发明提供的试剂盒中醛基玻片分为3X6个分区。本发明提供的试剂盒中，醛基玻片型号为CSS-100，FLAG标签载体为SIGMA公司的pFLAG-CMV-2，c-Myc标签载体为(CLONTECH公司的pC匿-Myc，FLAG单抗为SIGMA公司的ANTI-FLAGM2单克隆抗体，c-Myc单抗为SIGMA公司的单克隆ANTI-c-MYCCy3CONJUGATECLONE9E10。采用以上技术方案，本发明利用重组蛋白的表位标签，将抗标签的通用抗体固定在醛基玻片上，使其捕获细胞裂解液中的靶标蛋白，在保持蛋白一蛋白相6互作用的条件下，通过荧光标记的抗体检测免疫共沉淀的蛋白，最后通过荧光芯片扫描仪获得蛋白一蛋白相互作用的信号。其最大的特点是小型化和高通量化，能够一次平行分析大量样品，具有很高的敏感度与准确性，并且操作简化，可特异性高效检测细胞裂解液中蛋白与蛋白之间的相互作用。与现有的抗体芯片相比，它不需要制备或购买各种蛋白的特异性抗体，而只需要两种通用的抗标签抗体就能进行任意两种蛋白间相互作用的检测，克服了抗体芯片制备中抗体难获得的瓶颈问题。另一方面，与其他用于蛋白相互作用检测的蛋白芯片相比，它不需要进行各种蛋白的表达纯化，而直接利用诱饵和猎物共转染的细胞裂解液进行相互作用检测，克服了蛋白芯片制备中蛋白来源难的瓶颈问题，既省时省力，又大大节约研究成本。图l为本发明方法实验流程示意图。图2为本发明芯片免疫共沉淀及相互作用检测示意图。图3为本发明中pCMV-myc-p65和pFlag-p50重组子的双酶切电泳鉴定图，其中，各泳道表示1.pCMV-myc-p65(未酶切)；2.pCMV-myc-p65(xhoI和Notl酶切);3.pFlag-p50(未酶切);4.pFlag國p50(EcoRI和SalI酶切)图4为本发明免疫共沉淀芯片检测P65-p50相互作用荧光信号图片。图5为本发明免疫共沉淀芯片验证6对蛋白潜在相互作用的荧光信号图片。图6-l和图6-2为本发明免疫共沉淀芯片验证6对蛋白潜在相互作用的荧光强度及其比值图。图6-l为样品的相互作用的荧光强度1，2:FN1及其阴性对照；3，4:Myol8A及其阴性对照；5，6:ATF5及其阴性对照；7,8:HLA-B及其阴性对照；9，10:ATF4及其阴性对照；11,12:MCM3AP及其阴性对照。图6-2为样品的相互作用荧光强度比值1:FNl/阴性对照；2:Myol8A/阴性对照；3:ATF5/阴性对照；4:HLA-B/阴性对照；5:ATF4/阴性对照；6:MCM3AP/阴性对照.图7是传统免疫共沉淀验证5对蛋白潜在相互作用的免疫印迹图。具体实施例方式以下以具体实施例详细描述本发明。本发明所用到的试剂包括抗体单克隆抗FLAG抗体(Monoclonalanti-FLAGM2antibody,Sigma);Cy3标记单克隆抗c-Myc抗体(Monoclonalanti-c-Myc-Cy3antibody,Sigma);小鼠IgG(中山金桥生物公司)。脂质体月旨质体2000(Lipofectaraine2000reagent,Invitrogen)。醛基玻片CSS-100醛基玻片(AldehydeCSS-100SilylatedSlides,CELAssociates,Inc.)蛋白酶抑制剂无EDTA型完全蛋白酶抑制剂药片(completemini,EDTAfree,proteaseinhibitorcocktailtablets,Roche)其他各种分子生物学常用试剂均为市售进口试剂。试剂配制EBC裂解缓冲液:Tris-CINaClNP-40EDTA50,1/L，pH8.0120誦ol/L0.5%(V/V)l隱ol几用前补加50ng/mlPMSF，蛋白酶抑制剂TBS:TBST:封闭液:Tris-ClNaCl20画1/L，pH8.0150,1/L含0.05%(V/V)吐温20的TBS10mg/ralBSA(牛血清白蛋白)，溶于TBST中。本发明检测诱饵和猎物蛋白之间的相互作用，可采用以下操作，参见图l所示流程以及图2所示原理Flag抗体芯片的制备在醛基玻片上贴上贴膜，使其分区形成3X6个用于区分样品的芯片框。将anti-flagM2单抗和小鼠IgG(作为对照抗体)喷点到醛基玻璃片各分区框内，每个反应框内平行点3个含anti-flagM2单抗的点和对应数量的含小鼠IgG的点。4"C保存备用。本发明实施例采用M2单抗，由于M2单抗是鼠源IgG，因此采用小鼠IgG作为抗体对照。本发明不限于采用M2单抗，也可以选用其他型号的单抗。诱饵和猎物表达载体的构建将诱饵的编码基因构建到flag标签载体上，将猎物的编码基因构建到Myc标签载体上，分别形成flag-诱饵融合蛋白和Myc-猎物融合蛋白。细胞转染及裂解液的制备选择培养细胞，当细胞培养到80%密度时，以脂质体将诱饵和猎物真核表达载体共转染，收集细胞并充分裂解，将实验品细胞裂解液上清收集待用。用同样方法制备得到对照品细胞裂解液。芯片CoIP及相互作用的检测封闭液封闭芯片，洗涤后在其中之一芯片框内加入实验品细胞裂解液，同时在另一芯片框内加入对照品细胞裂解液作为阴性对照，反应一定时间后，洗涤；在每一芯片框内再加入荧光标记的另一单抗(anti-c-Myc-Cy3)，反应一段时间后洗涤，将芯片上的贴膜取下，待玻片干燥后放入荧光芯片扫描仪中获得信号并读取数据，有荧光信号的，说明两蛋白之间有相互作用，没有信号或信号微弱的说明没有相互作用。实施例1:核转录因子-kB(NF—icB)的p65和p50亚基相互作用的免疫共沉淀芯片分析NF-kB的p65和p50亚基在生理条件下，以异二聚体的形式存在，因此，以p65和p50的相互作用为阳性设计本实施例。一、Flag抗体芯片的制备在醛基玻片上贴上贴膜，使其分区形成3X6个芯片框。用微阵列点样器(microarrayer，CAPITALBIO博奥，晶芯SraartArrayer-48)将anti-flagM2单抗和小鼠IgG(作为对照抗体)喷点到醛基玻璃片各分区框内，每个反应框内点3个含anti-flagM2单抗的点和3个含小鼠IgG的点。4匸保存备用。二、诱饵和猎物表达载体的构建和鉴定将p65(NM一021975)和p50(NM—003998)分别构建到pCMV-Myc和pCMV-Flag-2载体上，获得pCMV-myc-p65和pFLAG-p50表达载体。构建过程具体操作a)设计p65和p50特异性引物，由赛百盛公司合成引物名称引物序列限制性内切酶p50-卯5，-CCGCGAATTCAATGGCAGAAGATGATCC-3'(序列1)EcoRIp50-down5'-CAGAGTCGACCTAAGTGTCCATGGTTCC-3'(序列2)Sailp65-up5'-ATCTCTCGAGGTATGGACGAACTGTTCCCC-3，(序列3)Xholp65-down5'-CAATGCGGCCGCTTAGGAGCTGATCTGACTC-3'(序列4)Notlb)以肝脏cDNA文库(Invitrogen)为模板，PCR扩增p65和p50基因PCR体系为10xBuffer5pl，dNTPMixture(2.5mM)化l，合成引物(lOpM)p50-up、p50-down各1|il，PyrobestTaq(5U/nl)0.5|il，cDNA文库lul，加去离子水至5(Hd。PCR反应条件为94t:预变性2min;94。C变性lmin，55°(3退火lmin、72"延伸2min，扩增35个循环；72。C继续延伸7min。c)PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切下目的条带(p65大小为1656bp，p50大小为1314bp)，使用凝胶回收试剂盒(Promega)并按照其说明书所述方法回收目的基因。d)目的基因及相应载体进行限制性酶切p50和pFLAG-CMV-2用EcoRI&Sa11进行双酶切，p65和pCMV-Myc用XhoI&Notl进行双酶切，反应体系如下10XHbuffer5y1PCR纯化产物P50(或P65)20tilEcoRI(或XhoI)2.5ulSail(或NotI)2.5u1加无菌水至50iU，37'C水浴酶切4h。e)酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶回收试剂盒(WizardSVGelandPCRClean-UpSystem,Promega)并按照其说明书所述方法回收酶切片段，切下目的基因(P50或P65)和载体酶切片段(pFLAG-CMV-2或pCMV—Myc)。f)用T4连接酶连接，连接体系如下:10XBuffer2ul目的基因10ul载体酶切片段1u1T4醒Ligase1ti1加去寓子水至20p1，室温连接2小时或4'C连接过夜。g)连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞将20y1连接产物加入100y1大肠杆菌JM109感受态细胞中，轻轻旋转混匀；冰水浴30分钟；42°(3热休克90秒；冰上放置2分钟；加入500u1LB培养液，37X:摇床(150rpm)培养45分钟；将培养液涂于加有氨苄的LB固体培养基平板上；超净工作台中吹干后，37'C培养箱倒置培养过夜。采用以下步骤对pCMV-Myc-p65和pFLAG-p50载体进行鉴定h)从平板上挑取单克隆菌落到一加有35ml含氨苄的LB液体培养基的无菌玻璃试管中，37X:摇床(200rpra)过夜。i)使用小量质粒DNA提取试剂盒(Wizard尸J"sSVMinipr印s，Promega)并按照其说明书所述方法提质粒。j)质粒进行双酶切鉴定重组子pFLAG-p50用EcoRI&Sa11进行双酶切，pCMV-Myc-p65用XhoI&Notl进行双酶切，反应体系如下10XHbuffer2w1含有重组子pFLAG-p50(或pCMV-Myc-p65)的质粒DN5u1EcoRI(或XhoI)lulSail(或NotI)lli1加无菌水至20nl，37"水浴酶切4h。k)酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，如果电泳结果显示大小与预期相一致的两条带，则表明该质粒为重组子。结果如图3所示其中2,4分别为pCMV-myc-p65和pFlag-p50的重组子。1)选择重组子进行测序确认。三、细胞转染及裂解液的制备1、pCMV-myc-p65和pFLAG-p50共转染细胞裂解液(实验品)的制备用含10%FBS(胎牛血清)(杭州四季青生物工程材料有限公司)的DMEM高糖培养液(北京天润善达生物技术有限公司)，在含5%C02的37t:培养箱内培养接种于24孔细胞培养板上的HEK-293细胞(人胚肾细胞，中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心)，显微镜下观察细胞，当细胞长到约80%密度时，以脂质体2000将PCMV-myc-P65和pFLAG-p50共转染细胞在一个0.5ml无菌EP管中同时加入300ngpCMV-myc-p65、300ngpFLAG-p50禾n50u1无血清的DMEM培养基，混匀；在另一个0.5ml无菌EP管中同时加入2u1脂质体2000禾B50u1无血清的DMEM培养基，混匀；室温孵育5分钟后，将两者混合到一起，混匀后室温孵育20分钟；将上述混合物加入24孔细胞培养板的各孔细胞中；将细胞放回含5%C02的37"C培养箱内培养。转染24-36小时后收集细胞将细胞培养液吸走，然后用预冷到4。C的PBS(磷酸盐缓冲液，137mmol/LNaCl，2.7mmol/LKC1，10mmol/LNa2HP04，2酬ol/LKH2P04，pH7.4)清洗细胞，之后向24孔细胞培养板的各孔中加入EBC裂解缓冲液(50ixl/孔)，室温放置15分钟进行充分裂解。将24孔细胞培养板各孔中的细胞裂解液回收到EP管中，4°C，12000rpm离心10分钟，收集细胞裂解液上清放入另一干净的EP管中，作为实验品备用。2、pCMV-myc-p65和pFLAG-CMV-2共转染细胞裂解液(对照品一)的制备用和1相同的操作制备对照品一，其中以脂质体2000将pCMV-myc-p65和pFLAG-CMV-2共转染，作为验证免疫沉淀特异性的阴性对照(flag-p50缺失)。3、pCMV-Myc和pFLAG-p50共转染裂解液(对照品二)的制备用和1相同的操作制备对照品二，其中以脂质体2000将pCMV-Myc和pFLAG-p50共转染，作为验证检测抗体(即Cy3标记的c-myc抗体)特异性的阴性对照(myc-p65缺失)。四、芯片CoIP及相互作用的检测用封闭液(20wl/框)封闭芯片，室温孵育45分钟；TBST洗涤5分钟，重复3次；在第一芯片框内加入实验品细胞裂解液(20txl/框)，在第二芯片框内加入对照品一细胞裂解液(20"1/框)，在第三芯片框内加入对照品二细胞裂解液(20ul/框)；室温保湿反应2小时；TBST洗涤15分钟，重复3次；加入anti-Myc-Cy3单抗(l:200〈抗体:封闭液〉，20til/芯片框)，室温避光保湿反应1小时；TBST洗涤15分钟，重复3次；将芯片上的贴膜取下，待玻片干燥后放入荧光芯片扫描仪(LuxScan-10K/A，CapitalBio)中获得信号并读取数据。五、检测结果图4显示了检测相互作用的荧光信号。从结果可以看出固定在芯片上的anti-flag单抗能免疫沉淀下flag-p50，而myc-p65因与p50的相互作用而被免疫共沉淀下来，所以可以检测到较强信号(参看图4中flag行A列)。作为抗体对照的小鼠IgG几乎没有信号(参看图4中IgG行)，同时作为样品对照的pCMV-myc-p65和pFLAG-CMV-2((参看图4中flag行B列)及pCMV-Myc和pFLAG-p50(参看图4中flag行C歹ij)共转染细胞裂解液信号也很弱。说明本发明免疫共沉淀芯片能有效的检测出p65与p50蛋白间的相互作用，采用小鼠IgG作为抗体对照，说明芯片上flag抗体免疫沉淀下的复合物为特异性产物，因此检测到的信号为特异性耙标蛋白间的相互作用，排除非特异性吸附的可能。实施例2:免疫共沉淀芯片对六对具潜在相互作用的蛋白进行相互作用的验证本实施例利用免疫共沉淀芯片对六对酵母双杂交来源的蛋白进行了相互作用验证。前期以TRB3蛋白(triblles3)作为诱饵，经酵母双杂交筛选人肝脏cDNA文库，获得6个猎物蛋白FN1、Myol8A、ATF5、ATF4、MCM3AP和HLA-B。将诱饵构建到pFLAG-CMV-2真核表达载体上(请参照实施例1的方法)，将六种猎物分别构建到pCMV-Myc真核表达载体上(请参照实施例1的方法)。参照实施例1中的方法；将六种pCMV-Myc-猎物蛋白分别和pFLAG-TRB3共转染HEK-293细胞，同时以六种pCMV-Myc-猎物分别和pFlag-CMV-2共转染作为诱饵缺失蛋白相互作用的阴性对照。获得十二个细胞裂解液后，分别在芯片上不同芯片框内进行免疫共沉淀反应，经荧光标记抗体anti-Myc-Cy3单抗检测后，得到相应的相互作用信号。检测结果参见图5和图6。图5中，行表示各列中转染的猎物名称，列表示各行转染的诱饵名称，如第一列上孔表示共转染了myc-ATF5和Flag-TRB3，下孔表示共转染了myc-ATF5和pFlag-CMV-2);图中显示猎物ATF4、FN1、ATF5、MCM3AP与诱饵TRB3有相互作用，其荧光强度分别是相应阴性对照的68.7、6.6、2.5、5.4倍，而猎物Myol8A、HLA-B与诱饵TRB3没有明显的相互作用信号，其荧光强度与相应阴性对照相当，仅1.5倍。本实施例的检测结果与传统基于树脂的免疫共沉淀验证结果(参见图7)一致(其中，由于mcy-HLA-B未检测到表达，因此没做其与TRB3的免疫共沉淀分析)，进一步表明本发明建立的免疫共沉淀芯片法在分析蛋白相互作用中有效。通过以上实施例说明，本发明将蛋白质芯片与CoIP结合，利用FLAG和c-Myc表位标签和其对应的单抗，建立了一种基于芯片的免疫共沉淀检测蛋白相互作用的方法。该方法使细胞裂解液直接在芯片表面进行CoIP反应，洗去非特异结合的蛋白后，采用荧光标记的抗体直接进行相互作用的检测，省去了传统CoIP的琼脂糖磁珠的沉淀、SDS-PAGE分离、westernblot检测等诸多费时、繁琐的步骤，大大简化实验过程。另外，使用该方法，样品、试剂需求量大大减少，并且同一样品可同时进行对照抗体的平行实验，大大降低实验成本。并且，该方法充分利用了芯片高通量化、流程简单、耗时短等特点，从而可实现对样品的通量化检测。在进行蛋白相互作用检测时，重复性好，背景噪音小，灵敏度高且检测效率与传统co-IP方法相当。本发明方法可取代过去耗时耗力的传统方法，成为蛋白质组学研究中高效有力的工具。本发明在具体实施中，还可以形成一种蛋白相互作用检测试剂盒，该试剂盒可包括具有多个分区的醛基玻片(每个醛基片可进行18个样品的检测，可根据需要检测的相互作用数量选择醛基片的数量)；FLAG标签载体pFLAG-CMV-2;c-Myc标签载体pCMV-Myc;单克隆抗FLAG抗体；Cy3标记单克隆抗c-Myc抗体；小鼠IgG及使用说明书。具体的一种试剂盒，其中醛基玻片型号为CSS-100，FLAG标签载体为SIGMA公司的pFLAG-CMV-2，c-Myc标签载体为(CL0NTECH公司的pCMV-Myc，FLAG单抗为SIGMA公司的ANTI-FLAGM2单克隆抗体，c-Myc单抗为SIGMA公司的单克隆ANTI-c-MYCCy3CONJUGATECLONE犯IO。权利要求1、一种基于蛋白芯片的免疫共沉淀检测蛋白相互作用的方法，其特征在于，制备一Flag抗体芯片，然后将含有Flag-诱饵融合蛋白和Myc-猎物融合蛋白的细胞裂解液加入到芯片表面进行免疫共沉淀反应，经荧光标记c-Myc抗体检测诱饵蛋白和猎物蛋白是否具有相互作用。2、根据权利要求l所述方法，其特征在于，采用以下步骤步骤一制备Flag抗体芯片，将醛基玻片分成多个芯片框，将anti-flagM2单抗及作为抗体对照的鼠IgG喷点到各芯片框内，保存备用；步骤二构建诱饵和猎物表达载体，将诱饵的编码基因构建到flag标签载体上，将猎物的编码基因构建到Myc标签载体上，分别形成诱饵融合蛋白和猎物融合蛋白；步骤三细胞转染及制备裂解液，将诱饵和猎物真核表达载体共转染到细胞中，收集细胞并充分裂解，将实验品细胞裂解液上清收集待用；同样制备阴性对照品细胞裂解液收集待用；步骤四检测蛋白相互作用，将实验品细胞裂解液和对照品细胞裂解液分别加入处理后的芯片中不同芯片框内，免疫共沉淀反应一定时间后，洗涤；在每一芯片框内再加入anti-c-Myc-Cy3，反应一段时间后洗涤，干燥后用荧光芯片扫描仪扫描；步骤五将荧光芯片扫描仪中获取的信号及数据输出，比较实验品和对照品的荧光信号，实验品信号强度强于对照品的，说明诱饵与猎物蛋白之间有相互作用，反之，没有信号或信号微弱的说明诱饵与猎物蛋白之间没有相互作用。3、根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述步骤一中Flag抗体芯片用贴膜分为3X6个芯片框，每个芯片框内平行点入anti-flagM2单抗及作为抗体对照的小鼠IgG，anti-flagM2单抗和小鼠IgG各点3个重复点。4、根据权利要求2或3所述方法，其特征在于，所述步骤四中，芯片处理是指用封闭液封闭芯片，室温孵育，然后用TBST重复洗漆；将实验品细胞裂解液和对照品细胞裂解液加入芯片框中的量为20Ul/框；所述免疫共沉淀反应指在室温保湿条件下反应2小时；所述洗涤指用TBST洗涤15分钟，重复3次；所述加入anti-Myc-Cy3单抗的浓度为1:200，加入量为20y1/芯片框，反应在室温避光保湿条件下反应1小时。5、一种蛋白相互作用检测试剂盒，其特征在于，包括一具有多个分区的醛基玻片，权利要求1至4任一所述方法中所述的FLAG和c-Myc标签载体和其对应的单抗，以及基于权利要求1至4任一所述方法的使用说明书。6、根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述醛基玻片分为3X6个分区。7、根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述醛基玻片型号为CSS-100，所述FLAG标签载体为SIGMA公司的pFLAG-CMV-2，所述c-Myc标签载体为(CLONTECH公司的pCMV-Myc，所述FLAG单抗为SIGMA公司的ANTI-FLAGM2单克隆抗体，所述c-Myc单抗为SIGMA公司的单克隆ANTI-c-MYCCy3CONJUGATECLONE9E10。全文摘要蛋白质—蛋白质相互作用(protein-proteininteraction，PPI)对于所有生物学过程都至关重要，因此，蛋白质相互作用研究一直是细胞生物学与分子生物学领域的一大研究热点。免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，CoIP)是以抗体和抗原之间的特异性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是发现和验证PPI最常用、最有效的方法。传统的基于树脂的CoIP步骤复杂、费时费力，难以实现PPI的通量化检测。本发明的核心是利用重组蛋白的表位标签，在固定了抗标签抗体的玻璃醛基片上进行CoIP，再通过荧光标记的抗体进行相互作用的检测。该方法大大简化了传统CoIP的操作步骤，同时检测样品的通量化大大提高，是一个简便、快速、高通量研究PPI的新型技术平台。文档编号G01N21/64GK101105493SQ20071011802公开日2008年1月16日申请日期2007年6月27日优先权日2007年6月27日发明者为何,刘琼明,从林,许丹科申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所