专利名称：：糖基血红蛋白浓度测定方法和浓度测定装置的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种测定血液等试样中包含的糖基血红蛋白的浓度的方法。
背景技术：
：在采用血液等机体试样对机体成分分离分析时，利用高速液体色谱法(HPLC)的高速液体色谱装置(HPLC装置)被广泛地使用(例如，参照专利文献1)。如图10所示，一般的HPLC装置9按照下述方式构成在试样配制单元90中，配制具备机体成分的试样，然后，将该试样导入分析柱91中，将机体成分吸附于分析柱91的填充剂中。在作为试样采用全血来测定糖基血红蛋白的情况下，使从全血中采取的红血球溶血之后，将稀释了溶血液的状态的机体试样相对于分析柱91而导入。在其另一方面，吸附于填充剂中的机体成分，通过由送液泵92从洗提液瓶93向分析柱91供给洗提液而溶离。来自分析柱91的洗提液被导入测光机构94，在该测光机构94中，通过连续测定洗提液的吸光度，进行机体成分的分析。如图11所示，在测光机构94中，当洗提液在测光元件95的流路96中流通的期间，照射来自光源97的光，在此时的透射光在感光部98中感光。在感光部98中所感光的光的波长在干涉滤波器99中被选择，另一方面，从感光部98输出与感光量相对应的功率电平的信号。在HPLC装置9中，还根据作为吸光度的经时性变化的色谱图，对血红蛋白总量进行运算，并且运算作为该血红蛋白总量中糖基血红蛋白所占的比例的糖基血红蛋白浓度。但是，对洗提液的氧等气体的溶解量随着洗提液的温度而不同，因此，在装置外部的温度(环境温度)变化时或在以环境温度不同的状态进行机体成分分析时，洗提液中的溶解气体的状态(溶解量)不同。由此，在洗提液中的溶解氧浓度伴随环境温度的变化等而变化的情况下，血红蛋白中的氧合血红蛋白与脱氧血红蛋白的比例变化。另外，即使在导入分析柱91中的机体试样中，血红蛋白中的氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的比例也产生偏差。另一方面，作为导入分析柱91中的机体试样采用稀释溶血液、氧较多的状态的类型，因此，在测光机构94中，采用氧合血红蛋白的最大吸收波长的415nm作为测定波长。由此，在环境温度的变化较大的环境等条件下，氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的比例不同，因此，在同一波长中测定它们时，难以进行准确的测定。专利文献1:日本特开平7—120447号公报
发明内容本发明的课题在于，即使在氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的比例不同的情况下，仍可适当地测定糖基血红蛋白的浓度。本发明的第一方面提供一种糖基血红蛋白浓度测定方法，其是通过光学方法来测定糖基血红蛋白浓度的方法，其中，将测定波长设定为氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的分子消光系数一致或大致一致的波长。优选测定波长设定在417427nm的范围内。更优选测定波长设定在419425nm的范围内。显然，测定波长并不限于之前所述的范围内，也可设定在作为氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的分子消光系数一致或大致一致的波长而公知的其他波长的范围内，例如，也可设定在520526nm或583589nm的范围内。本发明可适用于利用柱色谱法，并且采用由血液中的红血球配制好的试样来测定糖基血红蛋白浓度。本发明的第二方面提供一种糖基血红蛋白浓度测定装置，其具备测光机构，该测光机构将来自光源的光照射于试样，此时从试样传过来的光感光在感光部，其中，上述测光机构构成为，能够使氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的分子消光系数一致或大致一致的波长的光感光在感光部。测光机构构成为，例如能够使417427nm的光感光在上述感光部。优选测光机构构成为，能够使419425nm的光感光在感光部。测光机构也可构成为，能够使520526nm或583589nm的光感光在上述感光部。本发明的糖基血红蛋白浓度测定装置还具备分离单元，其用于利用例如柱色谱法来分离糖基血红蛋白。本发明的糖基血红蛋白浓度测定装置也可具备用于由血液中的红血球来配制试样的试样配制机构。图1为表示本发明的糖基血红蛋白测定装置的一例的HPLC装置的概略结构图2为用于说明图1所示的HPLC装置中的测光机构的剖视图；图3为表示氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的分子消光系数的波长依存性的曲线图4为表示图1所示的HPLC装置的主要部分的方框图；图5为用于说明图1所示的HPLC装置的动作的流程图；图6为用于说明图1所示的HPLC装置的运算电路的浓度运算处理的流程图7为在图1所示的HPLC装置中获得的色谱图的一例的图8为表示实施例1的环境温度和糖基血红蛋白浓度的关系的曲线图9为表示实施例2的环境温度和糖基血红蛋白浓度的关系的曲线图'，图10为表示现有的糖基血红蛋白测定装置的一例的HPLC装置的概略结构图11为用于说明图IO所示的HPLC装置中的测光机构的剖视图。附图标号说明1糖基血红蛋白浓度测定装置；3试样调整单元；5测光机构；53B感光元件(感光部)具体实施例方式下面，参照附图，对本发明进行具体说明。图1所示的HPLC装置X相当于本发明的糖基血红蛋白浓度测定装置的一例，其按照采用全血来测定糖基血红蛋白浓度的方式构成。该HPLC装置X具备多个洗提液瓶IO、11、12(图中为三个)；脱气装置2;试样配制单元3;分析单元4;测光机构5;运算电路6。各洗提液瓶IO、11、12保持将要供给后述的分析柱40的洗提液。作为洗提液，例如釆用pH或盐浓度不同的缓冲剂。脱气装置2用于在将洗提液供给到分析单元4(分析柱40)之前而将溶解气体从洗提液除去，并且，经由配管70A，70B，70C与洗提液瓶10、11、12连结，经由配管71A，71B,71C与分析单元4的集管41连结。如图1所示，试样配制单元3用于根据从采血管13采集好的血液试样14的血球成分来配制导入分析柱40的试样。该试样配制单元3具备取样喷嘴30，配制液罐31和稀释槽32。该取样喷嘴30用于采集以采血管13的血液试样14为首的各种液体，可进行液体的吸引/排出，并且可沿上下方向及水平方向移动。该取样喷嘴30的动作通过图外的控制机构而控制。配制液罐31保持用于基于血液试样14而配制导入分析柱40的导入用试样的配制液。在配制液罐31中，作为配制液，保持有用于稀释溶解红血球用的溶血液、溶血液的稀释液等。稀释槽32用于提供对血液试样14中的红血球溶血且稀释溶血液而配制导入用试样的场所。该稀释槽32构成为，经由配管72而连接于后述的分析单元4中的注射阀43，在稀释槽32中配制好的导入用试样经由注射阀43而能够导入分析柱40。分析单元4用于控制机体成分相对于分析柱40的填充剂的吸附/溶离，并将各种机体成分供给测光机构5，通过图外的调温机构，进行温度控制。分析单元4中的设定温度例如设为4(TC左右。分析柱40保持用于有选择地吸附试样中的血红蛋白的填充剂。作为填充剂，例如采用甲基丙烯酸酯共聚物。分析单元4不仅具有分析柱40，还具有集管41，送液泵42和注射阀743。集管41用于从多个洗提液瓶10、11、12中的特定的洗提液瓶10、11、12有选择地向注射阀43供给洗提液。该集管41经由配管71A，71B，71C与脱气装置2连接，并经由配管73与注射阀43连接。送液泵42用于赋予经由注射阀43将洗提液移动到分析柱40用的动力，其设置于配管73的途中。送液泵42按照例如使洗提液的流量为1.02.0ml/min的方式动作。注射阀43采用一定量的导入用试样，并且可将该导入用试样导入分析柱40，并具备多个导入口和排出口(图示省略)。注射环(injectionloop)44连接于该注射阀43。该注射环44可保持一定量(例如几)iL)的液体，通过适当切换注射阀43，从而可选择如下所述的状态注射环44与稀释槽32连通而从稀释槽32将导入用试样供给注射环44的状态；注射环44经由配管74而与分析柱40连通并从注射环44向分析柱40导入用试样的状态；从图外的清洗槽将清洗液供给到注射环44的状态。作为这样的注射阀43，可采用例如六通阀。如图2所示，测光机构5以光学方法检测包含于来自分析柱40的洗提液的血红蛋白，并且具有测定单元50，光源51，分束器52，测定用感光系统53和参考用感光系统54。测光单元50用于限定测光区域。该测光单元50具有导入流路50A，测光流路50B和排出流路50C，这些流路50A，50B，50C—连串地连通。导入流路50A用于将来自分析柱40(参照图1)的洗提液导入测光流路50B，经由配管75而与分析柱40连接。测光流路50B流通有构成测光对象的洗提液，并且提供用于测光洗提液的场所，呈直线状形成。在该测光流路50B中，两端开放，并且两端部通过透明盖55堵塞。排出流路50C用于排出测光流路50B的洗提液，经由配管76而与废液槽15连接(参照图1)。光源51用于对在测光流路50B中流通的洗提液照射光。该光源51按照光轴L通过测光流路50B的中心的方式以与测光流路50B的端面50Ba(透明盖55)面对面的状态配置。作为光源51，采用可射出氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的分子消光系数一致或大致一致的测定波长的光及参考波长的光的类型。作为测定波长，可列举例如417426nm的波长范围，但是，测定波长也可在520526nm或583589nm的范围内。参考波长可采用例如500nm。作为可射出之前所述的波长范围的测定波长和参考波长的光的光源51，可采用例如卤素灯。显然，作为光源51，也可采用卤素灯以外的类型，例如可使用具有一个或多个LED元件的类型。分束器52用于分割从光源51射出的光中透过测光流路50B的光而使其入射至测定用感光系统53和参考用感光系统54，在光轴L上，按照45度倾斜的状态配置。作为分束器52,可采用半透明反射镜等公知的各种类型。测定用感光系统53有选择地对透过分束器52的光中所需的波长的光进行感光，并且配置于光轴L上。该测定用感光系统53具备干涉滤波器53A、用于感光透过该干涉滤波器53A的光的感光元件53B。作为感光元件53B，可采用光电二极管。干涉滤波器53A有选择地使所需的测定波长的光透过。在这里，在HPLC装置X中，测定波长设定在417426nm的范围内，优选设定在419423nm的范围内。其原因在于下述的理由。第一如图3所示的那样，由于氧合血红蛋白的分子消光系数和脱氧血红蛋白的分子消光系数在波长大致为421nm时一致，所以考虑到如果测定波长为421nm或接近它的波长，就来自分析柱40的洗提液中包含的血红蛋白来说，可在未受到氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的比例或其变化的影响的情况下，测定血红蛋白浓度。第二如后述的实施例而显然知道的那样，在测定波长为423nm时，得到最难以受到环境温度的影响的结果，因此，考虑到如果测定波长为423nm或接近它的波长，则几乎不受到环境温度的影响，从而能够准确且稳定性良好地测定糖基血红蛋白浓度。作为测定波长，如上所述，可采用氧合血红蛋白的分子消光系数和脱氧血红蛋白的分子消光系数一致或大致一致的520526nm或583589nm，因此，在这种情况下，作为干涉滤波器53A,可采用有选择地使520526nm或583589nm的波长范围的光透过的类型。图2所示的参考用感光系统54用于采集抑制来自分析柱40的洗提液的浊度或散乱的影响用的数据，有选择地感光在分束器52中反射而改变光路的光中作为参考波长的500nm的光。该测定用感光系统74具备有选择地使500nm的光透过的干涉滤波器54A;用于感光透过干涉滤波器54A的光的感光元件54B。作为感光元件54B，可采用光电二极管。如图4所示的那样，运算电路6具备控制部60和运算部61。控制部60用于控制各部的动作。更具体地说，控制部60控制光源51的点亮/熄灭，控制干涉滤波器53A来选择在感光元件53B中感光的光的波长，或控制运算部61中的浓度运算处理。运算部61用于根据感光元件53B，54B的感光结果，对全血中的血红蛋白浓度进行运算。该运算部61存储运算所必需的程序，该动作通过控制部60而控制。接着，参照图1图4以及图5和6所示的流程图，同时对HPLC装置X的动作进行说明。如图l和图5所示的那样，在HPLC装置X中，在确认测定开始的指示时(S1)，向分析柱40供给洗提液(S2)。洗提液通过送液泵42的动力，从洗提液瓶IO、11、12经由脱气装置2和集管41而向注射阀43供给，另外，供给至多个洗提液瓶IO、11、12中的某一洗提液瓶10、11、12的洗提液是通过控制集管41来选择的。供给至注射阀43的洗提液经由配管74而向分析柱40供给。在HPLC装置X中，还配制将要导入分析柱40中的导入用试样(S3)。当进行导入用试样的配制时，首先，从采血管13采集血液试样14。来自采血管13的血液试样14的采集是通过使取样喷嘴30动作的方式而进行的。由取样喷嘴30采集的血液试样14通过使取样喷嘴30动作而供给至稀释槽32。进而，从配制液罐31依次向稀释槽32供给溶血剂和稀释液，通过利用取样喷嘴30的吸移操作(匕。"^:y亍0夕、')，来混合稀释槽32内的液体，从而配制出导入用试样。导入用试样被导入分析柱40中(S4)。导入用试样相对于分析柱40的导入这样进行，通过进行注射阀43的切换操作，而使洗提液在注射环44中流通。即，注射阀44的导入用试样与洗提液一起被导入分析柱40。在分析柱40中，通过将导入用试样导入，从而将糖基血红蛋白吸附于填充剂。在将糖基血红蛋白吸附于填充剂之后，通过集管41，适当切换供给10分析柱40的洗提液的种类，从而使吸附于填充剂的糖基血红蛋白溶离。另一方面，在从导入用试样的导入开始经过一定时间的情况下，通过进行注射阀43的切换操作，相对于分析柱40而继续供给洗提液，并且进行注射环44的清洗(S5)。另一方面，在注射环44的清洗的同时，与之前说明的情况相同，由与之前不同的采血管13的血液试样14，来配制导入用试样(S3)，在注射环44的清洗之后，再次将导入用试样导入注射环44(S4)。这样的导入用试样的配制(S3)，导入(S4),清洗(S5)在适当切换注射阀43的同时，对应于构成测定对象的采血管13(血液试样14)的数量而反复进行。包含从分析柱40排出的糖基血红蛋白的洗提液，如图2所示的那样，经由配管76而供给至测光机构5的测光单元50来测光(S6)。经由配管75和导入管路50A相对于测光单元50而导入来自分析柱40的洗提液，该洗提液在通过测光流路50B和排出流路50C之后，由图2可知，经由配管76被导入废液槽15。如图2所示的那样，在测光机构5中，在来自分析柱40的洗提液通过测光流路50B时，通过光源51对洗提液连续地照射光。另一方面，透过测光流路50B的光在分束器52中被分割，然后，在测定用感光系统53和参考用感光系统54中感光。在测定用感光系统53中，透过干涉滤波部53A的光有选择地感光在感光元件53B中。另一方面，在参考用感光系统54中，作为透过干涉滤波器54A的参考波长的500nm的光有选择地感光在感光元件54B中。感光元件53B，54B的感光结果输出给运算电路6，在该运算电路6中，对糖基血红蛋白的浓度进行运算(S7)。运算电路6的浓度运算处理按照图6所示的流程图的顺序而进行。首先，累计与血红蛋白相对应的吸光度(S10)，并且累计与糖基血红蛋白相对应的吸光度(由图7中的交叉影线表示的部分)(Sll)。接着，计算S10中的吸光度的累计值中S11的累计值所占的比例，将其作为糖基血红蛋白浓度(S12)。在S12的运算结束时，返回到图5的S7(S13)。艮卩，运算电路6的运算结果在图外的显示板中显示，另外，通过自动或使用者的按钮操作而ii打印输出(S8)。在本实施形态中，将氧合血红蛋白的分子消光系数和脱氧血红蛋白的分子消光系数一致或大致一致的波长作为测定波长，对糖基血红蛋白浓度进行运算。氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的分子消光系数一致的波长不受到氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的比例的影响而为一定，从而，在这样的波长中来对糖基血红蛋白浓度进行运算时，与氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的比例无关，可进行稳定的测定。其结果是，在本实施形态中，即使在HPLC装置X的外部的温度(环境温度)变化的环境或环境温度不同的状态下来测定糖基血红蛋白的情况下或产生导入分析柱中的试样的氧浓度的偏差的情况下，与洗提液中氧合血红蛋白与脱氧血红蛋白的比例无关，可稳定地测定糖基血红蛋白浓度。本发明并不限于在先说明的实施形态，可按照各种方式改变。例如，在之前说明的浓度运算处理中，血红蛋白量作为吸光度而获得，但是，血红蛋白量不必一定作为吸光度而获得，也可作为透射率或仅作为感光量而获得。另外，在测光机构5中，由感光元件53B感光所需的波长的光(例如，417426nm的波长范围的光)的结构并不限于采用干涉滤波器53A的结构，也可采用公知的其它方法。本发明并不限于用于测定血液中的糖基血红蛋白浓度的HPLC装置，也可适用于采用血液以外的标本的情况下，或HPLC装置以外的液体色谱分析装置其它的糖基血红蛋白浓度测定装置。实施例1在本实施例中，针对测定波长对糖基血红蛋白测定值施加的影响而进行分析，并且针对环境温度和测定波长的关系而进行分析。对于糖基血红蛋白量的浓度，针对环境温度为l(TC、2(TC和3(TC的情况下，在糖基血红蛋白量测定装置中("ADAMSAlcHA—8160":阿库赖以(7—夕k^)株式会社生产)，作为感光元件采用了光电二极管阵列("紫外线可见多波长检测器MD—910";日本分光株式会社生产)而进行。对于糖基血红蛋白量浓度而言，在415430nm的波长范围内，作为针对每个lnm测定血红蛋白总量中的糖基血红蛋白量所占的比例而运12算。作为标本，采用从健康人采集的血液(健康人标本)和从糖尿病患者采集的血液(糖尿患者血液)。关于采用了健康人标本的糖基血红蛋白的测定结果，在下面的表1和图8A中给出，关于采用了糖尿病患者标本时的糖基血红蛋白的测定结果，在下述的表2和图8B中给出。[表l]健康人标本测定波长(nm)糖基血红蛋白浓度测定值10°C20。C30°C4154.334.735.104164.454.635.094174.454.695.074184.304.655.074194.454.685.034204.444.764.724214.444.564.764224.374.574.754234.424.514.444244.524.444.114254.314.404.084264.414.404.014274.394.293.794284.394.143.694294.383.943.544304.603.803.1913[表2]糖尿病患者标本<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>针对健康人标本，如根据表1和图8A而知道的那样，在测定波长为423nm时与环境温度无关，测定值大致一致。另外，在测定波长在416427nm的范围内，测定波长为氧合血红蛋白的最大吸收波长，与415nm时相比较，不受到环境温度的影响，测定值稳定。特别是，在测定波长在419426nm的范围时，更进一步不受到环境温度的影响。另一方面，同样针对糖尿病患者标本，如根据表2和图8B而知道的那样，在测定波长为423nm时，与环境温度无关，测定值大致一致。另外，在测定波长在417427nm的范围内，测定波长为氧合血红蛋白的最大吸收波长，与415nm时相比较，不受到环境温度的影响。特别是，在测定波长在419425nm的范围内时，更进一步不受到环境温度的影响。根据本实施例的结果而知道，在测定糖基血红蛋白浓度的情况下，在测定波长在417427nm的范围内时，优选设定在419425nm的范围内，更优选设定在423nm，此时，无论是健康人标本，还是糖尿患者标本，难以受到环境温度的影响，从而进行准确而稳定的测定。实施例2在本实施例中，针对测定波长设定为氧合血红蛋白的最大吸收波长的415nm时，以及测定波长在实施例1中获得最佳的结果的423nm时，对环境温度对测定值造成的影响进行分析。糖基血红蛋白标本的测定值与实施例1的情况相同，对健康人标本和糖尿病患者标本的每一个进行测定。测定波长设定在415nm时的糖基血红蛋白的测定结果示于下述的表3和图9A中，测定波长设定在423nm时的测定结果示于下述的表4和图9B中。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>如表3和图9A所示的那样，在对测定波长设定在作为氧合血红蛋白的最大吸收波长的415nm的糖基血红蛋白测定了的情况下，环境温度越高，测定值越大，测定值受环境温度的影响很大。相对该情况，如表4和图9B所示的那样，在测定波长设定在423nm，对糖基血红蛋白浓度进行运算时，即使在环境温度在1030。C的范围内变化的情况下，测定值几乎不受到环境温度的影响，为大致一定值。特别是，对于要求更准确的测定的糖尿病患者标本，测定值相对于环境温度的变化几乎没有。由此，在测定波长设定在423nm，对糖基血红蛋白浓度进行运算的情况下，不会受到环境温度(洗提液的溶解氧浓度)和试样的溶解氧浓度的影响，而可进行准确且稳定的糖基血红蛋白浓度的测定。另外，可以预料到，即使在测定波长设定在接近423nm的波长的情况下，也几乎不受到环境温度的影响，从而可进行准确且稳定的糖基血红蛋白浓度的测定。由此，通过选择接近423nm的波长，与氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的比例无关，而可准确地测定糖基血红蛋白的浓度。权利要求1、一种糖基血红蛋白浓度测定方法，其是通过光学方法来测定糖基血红蛋白浓度的方法，其中，将测定波长设定为氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的分子消光系数一致或大致一致的波长。2、根据权利要求l所述的糖基血红蛋白浓度测定方法，其中，将测定波长设定在417427nm。3、根据权利要求l所述的糖基血红蛋白浓度测定方法，其中，将测定波长设定在419425nm。4、根据权利要求l所述的糖基血红蛋白浓度测定方法，其中，将测定波长设定在520526nm或583589nm。5、根据权利要求1所述的糖基血红蛋白浓度测定方法，其中，利用柱色谱法来测定糖基血红蛋白浓度。6、根据权利要求l所述的糖基血红蛋白浓度测定方法，其中，采用由血液中的红血球配制好的试样，来测定糖基血红蛋白浓度。7、一种糖基血红蛋白浓度测定装置，其具备测光机构，该测光机构将来自光源的光照射于试样，此时从试样传过来的光感光在感光部，其中，所述测光机构构成为，能够使氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的分子消光系数一致或大致一致的波长的光感光在感光部。8、根据权利要求7所述的糖基血红蛋白浓度测定装置，其中，所述测光机构构成为，能够使417427nm的光感光在所述感光部。9、根据权利要求7所述的糖基血红蛋白浓度测定装置，其中，所述测光机构构成为，能够使419425nm的光感光在所述感光部。10、根据权利要求7所述的糖基血红蛋白浓度测定装置，其中，所述测光机构构成为，能够使520526nm或583589nm的光感光在所述感光部。11、根据权利要求7所述的糖基血红蛋白浓度测定装置，其中，还具备用于利用柱色谱法来分离糖基血红蛋白的分离单元。12、根据权利要求7所述的糖基血红蛋白浓度测定装置，其中，还具备用于由血液中的红血球来配制试样的试样配制机构。全文摘要本发明涉及通过光学方法来测定糖基血红蛋白浓度的糖基血红蛋白浓测定方法和浓度测定装置。作为测定波长，采用在氧合血红蛋白的分子消光系数和脱氧血红蛋白的分子消光系数一致或大致一致的波长。优选测定波长设定在417～421nm的波长范围内。在本发明中，例如利用柱色谱法，采用由血液中的红血球配制好的试样，来测定糖基血红蛋白浓度。文档编号G01N21/27GK101484793SQ200780018789公开日2009年7月15日申请日期2007年3月23日优先权日2006年3月24日发明者杉山幸司,酒井敏克申请人:爱科来株式会社