专利名称：改进的免疫荧光细胞染色方法
技术领域：
本发明涉及生物领域，特别涉及改进的免疫荧光细胞染色方法。
技术背景调节性T细胞(regulatory T cell, Treg )是一类具有免疫抑制作用的T 细胞，是机体维持自身耐受的重要组成部分，在免疫相关性疾病、肿瘤免疫 和器官移植免疫等方面具有重要意义。目前，免疫相关性疾病、肿瘤和器官 移植患者外周血Treg细胞表达水平及其临床意义已成为研究的重点。已有研 究表明，Treg细胞比例上升可能是导致系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、 肺癌、胃癌、卵巢癌、鼻咽癌、乙肝病毒感染等免疫抑制的原因之一；患者 治疗前后Treg细胞数量的变化可作为疗效评估的指标之一。传统鉴定Treg细 胞主要是通过CD4+CD25+双阳性来定义，但这种方法并不完全准确，因为CD25 分子在部分活化的CD4+非Treg细胞上也会表达。研究发现，转录因子Foxp3 (forkhead box P3, Scurf in)与Treg细胞的生长发育和功能维持密切相关， 在小鼠特异性表达于CD4+CD25+T细胞；在人类不仅表达于CD4+CD25+T细胞，还 表达于CD8+CD28—T细胞，但在CD4+T细胞中的表达明显高于CD8+T细胞，是目前 公认的Treg细胞的特异、，敏感标志。由此，美国eBioscience公司开发了一套针对Foxp3的免疫荧光细胞染 色试剂和方案，用于流式细胞术检测Treg细胞，现已成为Treg细胞染色检 测的常规方法，主要包括以下步骤a、表面染色在细胞悬液中，加入细胞表面抗原(如CD4、 CD25等)的 荧光标记抗体，于温度2-8。C避光孵育20分钟；同时设阴性同型对照；b、 洗涤在经步骤a表面染色处理后的细胞悬液中，加入预冷的流式细 胞术染色液(Flow Cytometry Staining Buffer)或预冷的磷酸盐緩冲液(PBS),离心洗涤细胞，弃上清；重复洗涤2次；c、 固定/通透在经步骤b洗涤处理后的细胞沉淀中，加入固定/通透液 (Fixation/Permeabilization)，混匀，于温度2 - 8。C避光孵育30-60分钟；d、 通透在经步骤c固定/通透处理后的细胞悬液中，加入通透液 (Permeabilization Buffer ),离心洗涤细胞，弃上清；重复洗涤1次；e、 核内染色在经步骤d通透处理后的细胞沉淀中，加入Foxp3荧光标 记抗体，混匀，于温度2-8。C避光孵育至少30分钟；同时设阴性同型对照；f、 洗涤在经步骤e核内染色处理后的细胞悬液中，加入通透液，离心 洗涤细胞，弃上清；重复洗涤1次；g、 重悬在经步骤f洗涤处理后的细胞沉淀中，加入流式细胞术染色液， 重悬细月包。此方法为二步多重染色法，先进行细胞表面抗原染色，再进行细胞核内 抗原染色，具有良好的染色效果，能够准确地识别Treg细胞，但存在操作较 繁瑣、耗时、且成本较高的缺点。因此，需要对此方法进行改进和优化，既 能够保持良好的细胞染色效果，又可以简化操作、缩短时间、节省试剂、降 低成本。发明内容有鉴于此，本发明的目的在于提供一种改进的免疫荧光细胞染色方法， 可以同时对细胞表面抗原和核内抗原进行多重染色，具有良好的染色效果， 且方法简便、快速、经济。本发明的改进的免疫荧光细胞染色方法，包括以下步骤 a、固定/通透在分离的细胞沉淀中，加入固定/通透液，混匀，于温度 2 - 8。C避光將育30-60分钟b、 通透在经步骤a固定/通透处理后的细胞悬液中，加入通透液，离 心洗涤细胞，弃上清；c、 表面染色和核内染色在经步骤b通透处理后的细胞沉淀中，加入细 胞表面抗原的焚光标记抗体和核内抗原的荧光标记抗体，于温度2 - 8'C避光 孵育至少30分钟；同时设阴性同型对照；.d、洗涂在经步骤c染色处理后的细胞悬液中，加入通透液，离心洗涤 细胞，弃上清；e、重悬在经步骤d洗涤处理后的细胞沉淀中，加入流式细胞术染色液， 重悬细胞。进一步，所述步骤c细胞表面抗原的荧光标记抗体选自荧光标记的抗CD4 抗体或抗CD25抗体，或用不同颜色荧光标记的抗CD4抗体和抗CD25抗体；进一步，所述步骤c细胞核内抗原的荧光标记抗体选自荧光标记的抗 Foxp3抗体；进一步，所述步骤a和步骤c的孵育温度优选地为4°C,孵育时间优选 地为30分钟。本发明的有益效果在于本发明对eBioscience />司的Foxp3免疫荧光 细胞染色方法作了改进和优化，省略了原方法中的步骤a和步骤b,改二步 多重染色法为一步多重染色法，将细胞表面染色和核内染色同时进行。本发 明方法具有如下优点(1)染色和洗涤步骤减少，操作简便，时间缩短约l 小时，染色快速；(2)原方法在步骤a表面染色和步骤e核内染色时均需设 置相应的阴性同型对照，而本发明方法只需在步骤c进行表面染色和核内染 色时设置阴性同型对照，操作筒单且节约时间；(3)由于染色、洗涤步骤和 阴性同型对照的减少，染色试剂如固定/通透液、通透液、流式细胞术染色液 和PBS等的使用量减少，成本降低。分别采用本发明方法和eBioscience公 司方法对Balb/c小鼠的脾脏淋巴细胞进行CD4和Foxp3染色，再用流式细胞 仪检测，结果显示两种方法无显著性差异(P〉 0. 05 )。本发明的改进的免疫荧光细胞染色方法，不仅可以用于Treg细胞的染色和流式细胞术检测；采用 其它细胞相应的表面抗原和核内抗原的荧光标记抗体，还可以用于其它细胞 如Thl、 Th2、 Thl7等细胞的表面和核内转录因子同时染色。因此，本发明方 法具有良好的应用前景和推广价值，具有突出的实质性特点和显著的进步。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本 发明作进一步的详细描述，其中图1为采用本发明方法染色的脾脏淋巴细胞的流式细胞图；图2为采用eBioscience/〉司方法染色的脾脏'淋巴细月包的流式细胞图。
具体实施方式
以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。 本实施例采用本发明的改进的免疫荧光细胞染色方法对Balb/c小鼠的脾脏淋巴细胞进行CD4和Foxp3染色，再用流式细胞4义#:测，并与eBioscience公司方法进行比较。实验动物6 - 8周龄Balb/c小鼠3只，由第三军医大学实-验动物中心提供。实验试剂异硫氰酸荧光素(FITC )标记的大鼠抗小鼠CD4抗体 (FITC-CD4 )、别藻蓝蛋白(APC)标记的大鼠抗小鼠Foxp3抗体(APC-Foxp3 ), 同型对照FITC标记的大鼠抗小鼠IgG2a (FITC-IgG2a) 、 APC标记的大鼠抗 小鼠IgG2a ( APC-IgG2a ),以及固定/通透液、通透液、流式细胞术染色液均 为eBioscience公司产品。实验设备FACS Aria流式细胞仪为美国BD公司产品。实验方法包括以下步骤a、 固定/通透在分离的脾脏淋巴细胞沉淀(细胞数为lxl(T个)中， 加入固定/通透液l ml，脉冲式涡旋混匀，于温度4。C避光孵育30分钟；b、 通透在经步骤a固定/通透处理后的细月包悬液中，加入通透液lml， 于温度4。C、 300 g离心5分钟洗涤细胞，弃上清；重复洗涤1次；c、 表面染色和核内染色在经步骤b通透处理后的细胞沉淀中，加入通 透液100 pl重悬细胞，再加入浓度为0.5 mg/ml的FITC-CD4 1^1、浓度为 0. 2 mg/ml的APC-Foxp3 2pl，混匀，于温度4'C避光孵育30分钟；同时设 1个阴性同型对照以FITC-IgG2a和APC-IgG2a代替FITC-CD4和APC-Foxp3;d、 洗涤在经步骤c染色处理后的细月包悬液中，加入通透液1 ml,离 心洗涤细胞，弃上清；重复洗涤l次；e、 重悬在经步骤d洗涤处理后的细胞沉淀中，加入流式细胞术染色液 100 pl，重悬细胞。f、 4企测用流式细胞4义4企测，FACS Diva4. 1 4欠件获取10000个细胞数 据进行分析；以FITC-CD4设"门，，于CD4+T细胞，分析Foxp3的表达率，结 果以百分比表示。实-睑结果采用本发明方法和eBioscience/>司方法染色的脾脏'淋巴细 胞的流式细胞图分别见图1、图2，图1-2中的方框P2部分显示CD4+T细胞 中Foxp3+细胞所占百分比例，如图所示，两种方法才企测结果基本一致；两种 方法染色的脾脏淋巴细胞的流式检测数据比较见表1，经t;险验分析，两种 方法无显著性差异(P〉0. 05)。表l、釆用本发明方法与eBioscience/厶司方法染色的;f全测结果比较染色方法CD4+T细胞中Foxp3+细胞所占比例(％ ) 1 2 3 " s本发明方法12. 210. 511. 610. 80± 0, 83eBioscience公司方法12. 09. 211. 211. 43 ± 0. 50结论本发明方法具有良好的染色效果，可以用于细胞表面和核内同时 染色 不仅可以用于Treg细胞的染色和流式细胞术检测；采用其它细胞相应 的表面抗原和核内抗原的荧光标记抗体，还可以用于其它细胞如Thl、 Th2、 Thl7等细胞的表面和核内转录因子同时染色。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽 管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通 技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不 偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1、改进的免疫荧光细胞染色方法，包括以下步骤a、固定/通透在分离的细胞沉淀中，加入固定/通透液，混匀，于温度2-8℃避光孵育30-60分钟；b、通透在经步骤a固定/通透处理后的细胞悬液中，加入通透液，离心洗涤细胞，弃上清；c、表面染色和核内染色在经步骤b通透处理后的细胞沉淀中，加入细胞表面抗原的荧光标记抗体和核内抗原的荧光标记抗体，于温度2-8℃避光孵育至少30分钟；同时设阴性同型对照；d、洗涤在经步骤c染色处理后的细胞悬液中，加入通透液，离心洗涤细胞，弃上清；e、重悬在经步骤d洗涤处理后的细胞沉淀中，加入流式细胞术染色液，重悬细胞。
2、 根据权利要求1所述的改进的免疫荧光细胞染色方法，其特征在于 所述步骤c细胞表面抗原的焚光标记抗体选自荧光标记的抗CD4抗体或抗 CD25抗体，或用不同颜色焚光标记的抗CD4抗体和抗CD25抗体。
3、 根据权利要求1或2所述的改进的免疫焚光细胞染色方法，其特征在 于所述步骤c细胞核内抗原的荧光标记抗体选自荧光标记的抗Foxp3抗体。
4、 根据权利要求1或2所述的改进的免疫荧光细胞染色方法，其特征在 于所述步骤a和步骤c的孵育温度优选地为4°C,孵育时间优选地为30分 钟。
5、 根据权利要求3所述的改进的免疫荧光细胞染色方法，其特征在于 所述步骤a和步骤c的孵育温度优选地为4°C ，孵育时间优选地为30分钟。
全文摘要
本发明公开了一种改进的免疫荧光细胞染色方法，包括固定/通透、通透、表面染色和核内染色、洗涤、重悬共5个步骤；本发明方法是对eBioscience公司的Foxp3免疫荧光细胞染色方法的改进，将二步多重染色法改为一步多重染色法，同时进行细胞表面染色和核内染色，具有操作简便，染色快速，节约试剂，降低成本等优点，研究显示本发明方法与eBioscience公司方法无显著性差异，可以用于细胞表面和核内同时染色，具有良好的应用前景和推广价值。
文档编号G01N33/533GK101329230SQ200810069979
公开日2008年12月24日 申请日期2008年7月14日 优先权日2008年7月14日
发明者付小岚, 兵 倪, 吴玉章, 健 李, 王庆红, 王靖雪, 易 田, 田志强, 石晶磊, 许桂莲, 贾正才, 韧 赵, 黄泽民 申请人:中国人民解放军第三军医大学