专利名称：：一种测定蜂王浆新鲜度的方法
技术领域：
：本发明涉及一种食品质量检测方法，具体是涉及一种蜂王浆新鲜度的测定方法。
背景技术：
：蜂王浆是蜜蜂哺育蜂咽下腺和上颚腺共同分泌，用以伺喂蜂王和1-3日龄蜜蜂幼虫的浆状物质，在蜜蜂的级型分化中发挥着重要作用。蜂王浆含有丰富的生物活性物质，对人体具有诸如抗疲劳、抗菌消炎、抗肿瘤、降血压、促生长等方面的营养保健作用，在保健食品、医药、化妆品等领域具有很高的应用价值。卓越的营养保健效果使得蜂王浆及其制品风靡全球。随着国内人民生活水平的提高和保健需求的增长，国内蜂王浆巿场也正逐步壮大。长期的科学研究和实践经验表明蜂王浆适合在低温下贮存，其品质和保健功效易受其贮存条件的影响，若贮存温度、时间适当，蜂王浆保持"新鲜"，保健功效较好；若贮存温度过高或时间过长，蜂王浆的物理性状、化学组成会发生变化，保健功效降低甚至丧失。也就是说，蜂王浆的新鲜度和品质之间存在显著的相关性。我国现行蜂王浆国家质量标准(GB/T9697-2002)仅对包括10-羟基-2-癸烯酸、蛋白质、总糖在内的一些理化指标作出了限量规定，但这些指标无法评定蜂王浆的新鲜度，从而无法对蜂王浆的品质作出准确评价。缺少新鲜度指标及相应的测定方法是现行蜂王浆国家质量标准的一个缺陷，也是亟待解决的问题。蜂王浆的新鲜度评价已经引起了国内外科研工作者的高度关注，目前已经在多个方面开展了研究。并提出了多个蜂王浆新鲜度的间接评价指标，如糠氨酸、游离氨基酸、色度、57kDa蛋白、10-羟基-2-癸烯酸等的分析，但由于这些指标有些属于美拉德反应的中间产物，本身并不稳定，且在不同的王浆中变化趋势并不一样；有些性质稳定，在蜂王浆贮存过程中含量变化很小。因此，目前并没有一种可靠的蜂王浆新鲜度测定方法。
发明内容针对上述问题，本发明的目的是提出一种适用于各种蜂王浆，可如实测定蜂王浆新鲜度、评定蜂王浆品质的方法。蜜蜂分泌出蜂王浆后，蜂王浆中就会存在一定量的三磷酸腺苷(ATP)和核糖核酸(RNA)。在贮存过程中，蜂王浆中的ATP依次分解为二磷酸腺苷(ADP)、单磷酸腺苷(AMP)、肌苷酸(IMP)、次黄嘌呤核苷(HxR)和次黄嘌呤(Hx)。变化规律为ATP会较快地降解成其分解过程的中间产物IMP,而IMP分解为HxR和Hx的速度相对较慢，且贮存温度越高，贮存时间越长，其分解量越大，而HxR和Hx，尤其是Hx是ATP分解的终产物；另外，AMP和腺苷(Adenosine)也会由RNA降解而来，而Adenosine在贮存中又会降解为腺嘌呤(Adenine)。研究发现，蜂王浆中adenine、adenosine.HxR和Hx的累积量与上述8种分解过程物质的质量和的比值(本发明定义为F值)，与贮存时间和贮存温度存在线性相关，与蜂王浆的品质也存在线性相关，且在不同的王浆中的变化趋势基本一致。因此，本发明提出一种测定蜂王浆新鲜度、评定蜂王浆品质的方法，该方法能够如实、准确地评价蜂王浆的品质和新鲜度。因此，根据上述规律，本发明提供的蜂王浆新鲜度检测方法，包括以下步骤1、定量测定蜂王浆中三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、单磷酸腺苷(AMP)、肌苷酸(IMP)、次黄嘌呤核苷(HxR)、次黄嘌呤(Hx)、腺嘌呤(adenine)和腺苷(adenosine)的含量，可用液相色谱法或紫外分光法测定各个成分的含量；以液相色谱法为例取蜂王浆样品0.5g,加入5ml5。/。HC104，充分混合，12000rpm离心10min。取上清液，加入700|iL6mol/LKOH和50pL2mol/LNa2C03，充分混句后，12000rpm离心10min,上清液用0.45lam滤膜过滤后，以50mmolK2HP04为流动相，用液相色谱仪测定各个成分的含量。2、由以下公式计算蜂王浆的F值HxR+Hx++"t/ewosine,,F值=--^--x100%j775+」i)尸+爿MP+/M尸+/fx/+他+a&m>7e+adewosine3、根据F值大小评判蜂王浆的新鲜度。由于在贮存过程中，蜂王浆中的ATP依次分解为二磷酸腺苷(ADP)、单磷酸腺苷(AMP)、肌苷酸(IMP)、次黄喋呤核苷(HxR)和次黄嘌呤(Hx)，ATP会较快地降解成其分解过程的中间产物IMP,所以在蜂王浆中，ATP，ADP含量可能为零，也可以由下述公式计算蜂王浆的F值HxR+Hx+"tfem>7e+sine，^n,滩=-x100%+/MP+//xi++"^fem'股+"(iewsine利用此公式得到的F值判断新鲜度的方法与前述方法一致，也可以适用于各种蜂王浆的新鲜度的判定。F值大小与蜂王浆新鲜度成反比，F值越小，蜂王浆越新鲜；F值越大，蜂王浆越不新鲜。新釆收王浆F值接近0，高度腐败的王浆F值接近100。/。，蜂王浆贮存时间越长，温度越高，F值越大。本发明所提供的方法具有如下优点-.1、能如实反应蜂王浆所经历贮存过程对其新鲜度产生的影响，温度梯度和时间梯度均能在F值大小上表现出差异，根据F值可判定蜂王浆的新鲜度，从而确定蜂王浆的品质，以及判断是否经历不适当的贮存及贮存条件是否合格等；2、灵敏度高，在不同王浆中具有相似地变化规律；3、分析方法简单。图1ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx、adenine和adenosine的标准色谱图谱，其中从左到右分别为IMP、ATP、ADP、Hypoxanthine(Hx)、AMP、adenine、Inosine(HxR)、adenosine的特征峰。图2新釆收蜂王浆的色谱图。图3在-18。C贮存60天时的蜂王浆样品色谱图。图4在4。C贮存60天时的蜂王浆样品色谱图。图5在16。C贮存60天时的蜂王浆样品色谱图。图6在28。C贮存60天时的蜂王浆样品色谱图。具体实施方式下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。实施例1将ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx、adenine和adenosine标准品(购于Sigma公司)溶于超纯水中，终浓度为50ppm，用液相色谱仪测定，得到标准液相色谱，见图l。取新釆收油菜蜂王浆样品0.5g，加入5ml5。/。HC104,充分混合，12000rpm离心10min;取上清液,力口入700;aL6mol/LKOH和50|aL2mol/LNa2C03,充分混勾后，12000rpm离心10min,上清液用0.45pm滤膜过滤后，以50mmolK2HPO4为流动相，用液相色谱仪测定各个成分的含量，得到的液相色谱谱图，见图2。比较图1和图2,显然新釆收的蜂王浆中未检测到Hx和adenine的特征峰，说明几乎不含有Hx和adenine,而AMP、IMP的特征峰非常明显，说明这两种物质的含量很高，与发明人发现的ATP和RNA的分解规律一致。由以下公式计算蜂王浆的F值'.^HxR+Hx+"cfe"/"e+sine，八…F值=----x100%7477^+v4，++/M尸+T/x/++"&m'恥+"Jewosine6新釆收蜂王浆样品的ATP、ADP、AMP、IMP、HxR和adenosine含量分别为28.3、245.1、5687.9、2469.8、64.9和220.3mg/kg，F值为3.2%。实施例2取-18。C冷冻歌存60天、4。Clfc存60天、16。C贮存60天和28°C贮存60天的油菜蜂王浆样品各0.5g，采用实施例1的方法，加入5ml5%HC104，充分混合，12000rpm离心10min。取上清液，加入700jiL6mol/LKOH和50fiL2mol/LNa2C03，充分混匀后，12000rpm离心10min,上清液用0.45]im滤膜过滤后，以50mmolK2HP04为流动相，用液相色谱仪测定(见图3、4、5和6)。可见，随着贮藏温度的升高，蜂王浆的IMP、ATP、ADP、AMP的含量逐渐降低，而adenine和adenosine的含量逐渐增力口，Hypoxanthine(Hx)和Inosine(HxR)的含量先降低，然后保持稳定。与发明人前述的降解机理基本一致。在28°〇贮存60天的蜂王浆的ATP含量为O,说明在某些蜂王浆中，ATP的含量可能为零。计算蜂王浆中ATP及其降解产物的含量，结果见l表1不同温度下贮存60天时蜂王浆的降解物含量(mg/kg)和F值<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>28。C和16。C贮存60天的样品的F值分别为18.8%和9.1%，而4°C和-18。C贮存的王浆的F值分别为5.5%和3.4%,说明贮存温度越高,贮存相同时间的油菜王浆越不新鲜。实施例3取在4。C贮存15天、30天、60天和90天的茶花蜂王浆样品各0.5g,釆用实施例1的方法，加入5ml5y。HC104,充分混合，12000rpm离心10min。取上清液，加入700pL6mol/LKOH和50^L2mol/LNa2C03,充分混勻后，12000rpm离心10min,上清液用0.45}im滤膜过滤后，以50mmolK2HP04为流动相，用液相色谱仪测定。计算蜂王浆中ATP及其降解产物的含量，结果见表2。表24°C下贮存不同时间的茶花王浆的降解物含量(mg/kg)和F值<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>可见，随着贮藏时间的增加，蜂王浆的ATP、ADP、AMP、IMP、的含量逐渐降低，而adenine和adenosine的含量逐渐增力口，Hypoxanthine(Hx)和Inosine(HxR)的含量先降低，然后保持稳定。与发明人前述的降解机理基本一致。在4。C下lfc存15天和30天的茶花蜂王浆的F值分别为3.7和4.5%，Hx含量为未检出；而贮存60天和90天的F值分别为6.0%和9.2%。说明在相同的贮存温度下，贮存时间越长，茶花王浆越不新鲜。结果证明，在不同的储藏温度和时间，不同品种的蜂王浆的降解趋势基本相同，其F值的变化趋势也完全相同，提示F值的大小可用于判定蜂王浆的新鲜度，也可以判定贮藏时间和贮藏温度。权利要求1、一种新鲜度测定方法，其特征在于，用于测定蜂王浆的新鲜度，包括以下步骤1)测定蜂王浆中ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx、adenine、adenosine含量；2)由以下公式计算蜂王浆的F值其中ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx、adenine、adenosine分别为蜂王浆中三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、单磷酸腺苷、肌苷酸、次黄嘌呤核苷、次黄嘌呤、腺嘌呤和腺苷的含量；3)根据F值大小判断蜂王浆的新鲜度。2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中ATP，ADP含量可以为零，贝'J:w+HxR+Hx+at/em."e+sinem…F值=--x100%爿MP+/MP+//x/+//x+atfew/we+ac/e"osine其中AMP、IMP、HxR、Hx、adenine,adenosine分别为蜂王浆中单磷酸腺苷、肌苷酸、次黄嘌呤核苷、次黄嘌呤、腺嘌呤和腺苷的含量。3、根据权利要求l或2所述的方法，其特征在于，F值越小，蜂王浆越新鲜。4、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，蜂王浆中ATP、ADP、AMP、IMP、HxR、Hx、adenine和adenosine的含量由液相色谱法或紫外光法测定。5、权利要求l或2所述的方法的应用。6、根据权利要求5所述的应用，其特征在于可通过F值判断蜂王浆的储藏条件是否合格。全文摘要本发明涉及一种用于蜂王浆的新鲜度检测方法。具体的测定方法是通过液相色谱法或紫外分光法等方法定量测定蜂王浆的三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、单磷酸腺苷(AMP)、肌苷酸(IMP)、次黄嘌呤核苷(HxR)、次黄嘌呤(Hx)、腺嘌呤(adenine)和腺苷(adenosine)的含量；计算adenine、adenosine、HxR和Hx的累积量与上述8种物质(ATP和核酸的降解产物)的质量之和的比值(F值)；利用蜂王浆的F值大小检测蜂王浆的新鲜度，评判蜂王浆的品质。本发明较现有判定蜂王浆品质的方法更为准确、灵敏地判定蜂王浆品质和新鲜度，可完善现行蜂王浆质量标准，有效监控蜂王浆质量。文档编号G01N21/00GK101320030SQ20081011694公开日2008年12月10日申请日期2008年7月21日优先权日2008年7月21日发明者吴黎明,彭文君,熠李,胡福良,薛晓锋,静赵申请人:中国农业科学院蜜蜂研究所