专利名称：：用于检测卡那霉素残留的免疫胶体金试纸条及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种兽药残留的免疫化学速测技术，特别是涉及一种用于快速检测卡那霉素残留的免疫胶体金试纸条及其制备方法。技术背景卡那霉素是一种氨基糖苷类抗生素，对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都具有显著的抗菌效果，作为饲料添加剂和治疗疾病的抗生素广泛应用于畜牧业。然而，卡那霉素对人类具有明显的毒害作用，对脑神经、听觉以及肾脏的损害严重。近些年，由于卡那霉素的严重滥用而导致动物源性食品中残留过高，已成为国内外广为关注的食品安全问题之一。许多国家和国际组织均明确规定了食品中该药物残留的最大残留限量(MRL)。例如，欧盟规定，牛奶中的最大残留量为150ug/kg，肌肉、脂肪中的最大残留量为100ug/kg。因此，加强对食品中卡那霉素残留的监测具有十分重要的意义。目前检测卡那霉素残留常用的方法主要包括微生物法、色谱法(如高效液相色谱法，HPLC)或色谱-质谱联用技术(如液相色谱-质谱串联法，LC-MS)，酶联免疫吸附法(ELISA)。微生物检测法操作简单，但其检测周期长且结果误差较大。色谱法或色谱-质谱联用技术灵敏度高，结果可靠，但测定方法繁琐、费时，成本高，操作人员需要经过专业培训，难以普及。ELISA法是利用酶标记物的竞争性免疫检测方法，近年来被广为用作定性或半定量检测的快速筛査方法，虽然在一定程度上縮短了检测时间，但仍然需要专门的仪器(如酶标仪)，操作过程仍较复杂。更为主要的是，以上检测方法均为实验室方法，难于在现场应用，不利于推广使用。胶体金免疫层析是20世纪80年代发展起来的一项新的免疫分析方式，是应用胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，利用抗原抗体特异性反应的一种新型免疫检测方法，基于胶体金免疫层析技术可以制备成胶体金免疫层析试纸条。使之操作更简便、更快速，因生产成本和测试成本均很低廉等而得到广大基层用户的青睐。试纸条检测方便，不需大型实验室仪器，因此特别适合于现场使用，日益成为食品安全例行检测控制中不可或缺的手段。
发明内容本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高，操作简便，检测快速、准确并适合现场使用的专门用于检测卡那霉素残留的免疫胶体金试纸条及其制备方法，填补目前尚未有卡那霉素残留免疫胶体金检测试纸条的空白。一种用于检测卡那霉素残留的免疫胶体金试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬，在PVC背衬上依次连续粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合垫与所述硝酸纤维素膜之间有搭接，所述硝酸纤维素膜与所述吸水垫之间有搭接；所述结合垫上包被有抗卡那霉素单克隆抗体-胶体金标记物，所述硝酸纤维素膜上分别包被有卡那霉素-载体蛋白(牛血清白蛋白)偶联物构成的检测线和兔抗鼠IgG构成的质控线。本发明的免疫胶体金试纸条的制备方法，包括以下步骤1)将卡那霉素与载体蛋白(血蓝蛋白)偶联，合成卡那霉素-载体蛋白偶联物即免疫原；2)用步骤l)合成的免疫原免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗卡那霉素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；3)以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用ProteinG柱进行纯化，获得抗卡那霉素单克隆抗体IgG;4)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；5)将歩骤3)制备的抗卡那霉素单克隆抗体加入步骤4)制备的胶体金中，得到抗卡那霉素单克隆抗体-胶体金标记物；6)将步骤5)制备的抗卡那霉素单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合垫上；7)将卡那霉素与载体蛋白(牛血清白蛋白)偶联，合成卡那霉素-载体蛋白偶联物即包被原；8)将步骤7)合成的包被原包被在硝酸纤维素膜上构成检测线；并将兔抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜上构成质控线；9)在PVC背衬上按顺序依次粘附所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，得到所述用于检测卡那霉素残留的免疫胶体金试纸条。本发明的制备方法，所述步骤4)中胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法。制备的胶体金为15~40nm胶体金颗粒。本发明中的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、PVC背衬均购自Millipore公司。与现有技术相比，本发明具有下列优点1、本发明的检测卡那霉素的免疫胶体金试纸条，具有特异性强，灵敏度高，检测时间短(IO分钟)等优点。2、本发明的检测试纸条不需要任何特殊仪器、设备，可现场操作，检测成本低。3、本发明的检测试纸条操作简便，不需由专业人员操作。4、本发明的检测试纸条储存方便，对温度要求不高，在48'C下有效保存期可达一年；在室温下可保存六个月。图1是本发明免疫胶体金试纸条的结构示意图；图2是图1的俯视图；图3是本发明免疫胶体金试纸条检测结果判定示意图；图4是实施例3中敏感性试验的结果图。具体实施方式为进一步说明本发明，结合以下实施例具体阐述实施例l:本发明免疫胶体金试纸条的结构如图1和图2所示，一种用于检测卡那霉素残留的免疫胶体金试纸条，包括样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4、吸水垫5和PVC背衬1，在PVC背衬1上依次连续粘附有样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水垫5，结合垫3与硝酸纤维素膜4之间有搭接，硝酸纤维素膜4与吸水垫5之间有搭接;结合垫3上包被有抗卡那霉素单克隆抗体-胶体金标记物，硝酸纤维素膜4上分别包被有卡那霉素-载体蛋白(牛血清白蛋白)偶联物构成的检测线T和兔抗鼠IgG构成的质控线C。最后切成3mm宽的小条，真空封装。在使用时，对样品进行一定处理后将之滴入样品垫上即可。样品垫上可制作出专门的加样孔。本发明选用卡那霉素-载体蛋白偶联物作为检测线，抗卡那霉素特异性单克隆抗体为胶体金标记的抗体，利用竞争法来检测待测样品中是否含有卡那霉素。通过待检样品中的卡那霉素与包被于硝酸纤维膜上的卡那霉素-载体蛋白偶联物共同竞争抗卡那霉素单克隆抗体-胶体金标记物，在检测线处出现颜色深浅不同的红色条带或不出现条带，质控线处出现红色条带。若待测样品试纸条检测线颜色明显浅于阴性样品试纸条检测线颜色，同时质控线上出现红色条带则判断为阳性样品，即待测样品中卡那霉素的浓度在l10ng/mL范围内；若待测样品试纸条检测线无颜色出现，同时质控线上出现红色条带也判断为阳性样品，即待测样品中卡那霉素的浓度高于10ng/niL;若待测样品试纸条检测线颜色等于或深于阴性样品试纸条检测线颜色，同时质控线上出现红色条带则判断为阴性样品，即卡那霉素的浓度小于1ng/inL;如果质控线上没有红色条带出现，则该试纸条无效(如图3所示)。实施例2(制备实施例)检测卡那霉素的免疫胶体金试纸条的制备方法1、卡那霉素-载体蛋白偶联物的制备免疫原的合成称取45mg卡那霉素硫酸盐和10mg血蓝蛋白(KLH)溶于1.5mLPBS，于磁力搅拌器上搅拌。取300mgEDOHCl溶于lmLPBS中，调pH值至7.4,再逐滴加入到上述混合溶液中，在室温下搅拌l小时，然后于4"C放置3天。用PBS透析3天，每天更换透析液2~3次，过葡聚糖凝胶层析柱(S印hadexG-25)进一步提纯，分装，-20。C贮存。包被原的合成称取45mg卡那霉素硫酸盐和10mgBSA溶于1.5mLPBS，于磁力搅拌器上搅拌。取300mgEDC.HCl溶于lmLPBS中，再逐滴加入到上述混合溶液中，在室温下搅拌反应3小时。用PBS透析3天，每天更换透析液23次，过SephadexG-25柱进一步提纯，分装，-20'C贮存。2、抗卡那霉素单克隆抗体的制备利用申请人所制备的卡那霉素-血蓝蛋白(KLH)偶联物免疫8周龄BAL/C小鼠4只(购自军事科学研究院实验动物中心)，免疫程序是取含卡那霉素-血蓝蛋白(KLH)偶联物100fig的溶液与等体积的弗氏完全佐剂(购自Sigma公司)乳化，注射小鼠腹腔，免疫15天后，换用弗氏不完全佐剂乳化(购自Sigma公司)加强免疫，每间隔15天一次，共3次，分别于每次免疫后IO天小鼠眼眶后缘静脉采血，测定抗体效价。选血清抗体效价最高的小鼠于融合前4天腹腔强化免疫卡那霉素-血蓝蛋白(KLH)偶联物100ng，不加佐剂。融合时，取经最后强化免疫的BALB/C小鼠，摘除眼球放血处死(收集血清，即为阳性血清)，无菌取出小鼠脾脏，分离出脾细胞，与新鲜制备的SP2/0骨髓瘤细胞按l2xl(^个SP2/0与108个免疫细胞的比例于50mL离心管中混匀，2500rpm，离心10min。弃上清，轻轻敲击管底，使细胞沉淀略加松动。将装有细胞混合物的离心管放于37'C水浴中。然后在lmin内慢慢滴入预温至37'C的50%聚乙二醇(PEG1500)1.5mL(购自Pierce公司)，边加边轻轻用吸管尖搅拌，继续搅拌lmin。然后慢慢加入37°C预温的DMEM(购自Gibco公司)完全培养基10mL，并不断轻轻地搅拌。最后加入30mLDMEM液，1500rpm离心5min，弃上清，于37'C放置5~8min。用HAT(购自Gibco公司)培养基悬浮，同时也用HAT培养基悬浮制备好的词养脾细胞并与融合后的细胞混合。分种于4块96孔培养板中，约100fiL/孔。于37'C,8%C02培养箱中培养。融合后第810天吸去100jiL培养基换HT(购自Gibco公司)培养基100pL。待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，进行抗体检测。采用卡那霉素-牛清白蛋白(BSA)作为筛选抗原，利用ELISA方法筛选出分泌抗卡那霉素的阳性孔。对筛选出来的阳性孔用有限稀释法进行克隆、筛选。最终筛选出分泌抗卡那霉素的单克隆杂交瘤细胞株。将上述细胞扩大培养后注射BALB/C小鼠腹腔，体内诱生腹水法大量生产单克隆抗体。小鼠腹腔注射弗氏不完全佐剂0.5mL/只，5天后腹腔注射杂交瘤细胞106个/只，再7天后取小鼠腹水。3、抗卡那霉素单克隆抗体的纯化用0.1M磷酸缓冲液(pH7.2)平衡ProteinG柱，将小鼠腹水样品和磷酸缓冲液按1:1比例混合后加样，待样品完全通过ProteinG柱后用磷酸缓冲液充分淋洗柱上残存的杂蛋白，用0.1Mglycine-HCl缓冲液(pH3.0)洗脱抗体IgG，再用PBS缓冲液4'C透析1天。以紫外分光光度法测定纯化后的抗体浓度；经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定所纯化得到的抗卡那霉素单克隆抗体。4、抗卡那霉素单克隆抗体-胶体金标记物的制备(1)胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法制备20irni胶体金颗粒。用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01%,取0.01%氯金酸水溶液100mL，用恒温微波搅拌加热至95"C,—次性加入1%拧檬酸三钠水溶液2.5mL，继续搅拌加热，直至溶液呈酒红色，室温冷却。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。(2)抗卡那霉素单克隆抗体-胶体金标记物的制备取20nm胶体金溶液10mL，用0.1mol/L碳酸钾溶液调pH到8.0。边搅拌边加入卡那霉素单克隆抗体溶液(0.2mg/mL)0.8mL，继续搅拌混匀30min，加入10%BSA至终浓度为1%，静置30min。12000rpm、4-C离心30min，弃上清，沉淀用0.02MpH9.0硼酸盐缓冲液洗涤两次，用1/20初始胶体金体积的0.02MpH9.0的硼酸盐缓冲液将沉淀重悬，置4°C备用。5、结合垫的包被将结合垫浸泡于0.01MpH7.4磷酸缓冲液30min,于37'C烘干。然后用Biodot点膜仪将制备好的抗卡那霉素单克隆抗体-胶体金标记物均匀包被在结合垫上，真空干燥，真空封装，置4'C备用。6、样品垫的处理将样品垫浸泡于O.OlMpH7.4磷酸缓冲液50mL(含5mL10%BSA，2.5mL10%Tween-20)中30min，于37'C烘干，真空封装，置4。C备用。7、硝酸纤维素膜的包被用0.01MpH7.4PBS缓冲液(含3%的甲醇)将卡那霉素-牛血清白蛋白(BSA)偶联物稀释到0.25mg/inL，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜作为检测线，检测线靠近结合垫端，距结合垫端约5mm;用PBS缓冲液(0.01MpH7.4，含3%的甲醇)将兔抗鼠IgG抗体稀释到1mg/mL,用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜作为质控线，靠近吸水垫，距吸收垫约5mm。检测线与质控线两线距离5~8min。37。C烘干，封装备用。8、试纸条的组装将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫按图1所示的顺序依次粘附在PVC背衬上，切成3mm宽的小条，真空封装。48'C保存，有效期一年；常温保存，有效期6个月。实施例3(应用实施例)检测卡那霉素的免疫胶体金试纸条的应用评价1、特异性试验将卡那霉素、庆大霉素、新霉素、链霉素、氯霉素、头孢氨苄、磺胺二甲氧嘧啶、恩诺沙星配制成浓度为lOng/mL的样品，将之滴于样品垫上或加样孔上进行试验。试验结果(见表1)表明，卡那霉素样品检测线无颜色出现，同时质控线上出现红色条带，而庆大霉素、新霉素、链霉素、氯霉素、头孢氨苄、磺胺二甲氧嘧啶、恩诺沙星样品试纸条检测线和质控线都出现红色条带，这表明庆大霉素、新霉素、链霉素、氯霉素、头孢氨苄、磺胺二甲氧嘧啶、恩诺沙星与本发明试纸条无交叉反应，显示本发明试纸条具有良好的特异性。表1本发明试纸条特异性试验结果检测样品卡那霉素庆大霉素新霉素链霉素氯霉素头孢氨苄磺胺二甲嘧啶恩诺沙星检测结果+—__—_——注"+"表示有交叉反应；"—"表示无交叉反应。2、敏感性试验用本发明试纸条分别检测浓度为0、1、5、10、50、10()ng/mL的卡那霉素标准品，结果见图4。1tig/niL卡那霉素标准品的检测线颜色与0ng/mL卡那霉素标准品的检测线颜色差异极显著，当卡那霉素标准品浓度高于10ng/mL时检测线无颜色出现。因此，本发明检测试纸条灵敏度为1ng/mL，符合欧盟规定的"卡那霉素的残留限量标准"。3、重复性试验用卡那霉素标准品配制成1、10、100ng/mL三个不同浓度的样品溶液，阴性样品及待检样品用本发明试纸条进行检测，每个浓度设6个重复，检验其重复性，结果见表2。检测结果完全一致，显色度均一，证明本发明检测试纸条检测结果稳定可靠，具有良好的重复性。表2本发明试纸条重复性试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注"+"表示阳性结果；"-"表示阴性结果。实施例4(应用实施例)检测卡那霉素的免疫胶体金试纸条的使用方法1、样品的预处理①血液取待检动物血液1-3mL，离心后取透明上清液，若血清有溶血现象，将血清用蒸馏水稀释一倍，待测。②牛奶取l-5tnL,于4'C、5000r/min离心15min，去除上层脂肪，待测。③尿样用尿液直接进行测试，如混浊，先离心取上清液或用蒸馏水稀释一倍。组织样品去5-10g组织样捣碎后，加入20-30mLPBS,80t:孵育30min,然后置于冰浴10mhi，4'C，5000r/min，离心15min，去除表面的脂肪层，取上清液待测。饲料取0.5-2g磨碎的待测饲料加入8-20mLPBS,于8CTC孵育30min，然后置于冰浴10min，于4°C、5000r/min离心15min，取上清液待测。2、检测阴性样品及待检样品各取100jiL加入试纸条加样孔中，10分钟后观察结果。3、结果判定若待测样品试纸条检测线颜色明显浅于阴性样品试纸条检测线颜色，同时质控线上出现红色条带则判定为阳性样品，即待测样品中卡那霉素的浓度在l10ng/inL范围内；若待测样品试纸条检测线无颜色出现，同时质控线上出现红色条带也判定为阳性样品，即待测样品中卡那霉素的浓度高于10ng/mL;若待测样品试纸条检测线颜色等于或深于阴性样品试纸条检测线颜色，同时质控线上出现红色条带则判定为阴性样品；如果质控线上没有红色条带出现，则该试纸条无效。注-木说明书屮的术语解释1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HC1)本发明中涉及的％如无特殊说明外，均指的是重量百分比。以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。权利要求1.一种用于检测卡那霉素残留的免疫胶体金试纸条，包括样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)、吸水垫(5)和PVC背衬(1)，其特征在于在PVC背衬上(1)依次连续粘附有样品垫(2)、结合垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸水垫(5)，所述结合垫(3)与所述硝酸纤维素膜(4)之间有搭接，所述硝酸纤维素膜(4)与所述吸水垫(5)之间有搭接；所述结合垫(3)上包被有抗卡那霉素单克隆抗体-胶体金标记物，所述硝酸纤维素膜(4)上分别包被有卡那霉素-载体蛋白(牛血清白蛋白)偶联物构成的检测线(T)和兔抗鼠IgG构成的质控线(C)。2.权利要求1所述的免疫胶体金试纸条的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)将卡那霉素与载体蛋白(血蓝蛋白)偶联，合成卡那霉素-载体蛋白偶联物即免疫原；2>用步骤l)合成的免疫原免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗卡那霉素的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；3)以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用ProteinG柱进行纯化，获得抗卡那霉素单克隆抗体IgG;4>用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；5)将步骤3)制备的抗卡那霉素单克隆抗体加入步骤4)制备的胶体金中，得到抗卡那霉素单克隆抗体-胶体金标记物；6)将步骤5)制备的抗卡那霉素单克隆抗体-胶体金标记物包被在结合垫上；7>将卡那霉素与载体蛋白(牛血清白蛋白)偶联，合成卡那霉素-载体蛋白偶联物即包被原；8)将步骤7)合成的包被原包被在硝酸纤维素膜上构成检测线；并将兔抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜上构成质控线；9)在PVC背衬上按顺序依次粘附所述样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，得到所述用于检测卡那霉素残留的免疫胶体金试纸条。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤4)中胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述步骤4)中制备的胶体金为15~40irni胶体金颗粒。全文摘要一种用于检测卡那霉素残留的免疫胶体金试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬，在PVC背衬上依次连续粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述结合垫与所述硝酸纤维素膜之间有搭接，所述硝酸纤维素膜与所述吸水垫之间有搭接；所述结合垫上包被有抗卡那霉素单克隆抗体-胶体金标记物，所述硝酸纤维素膜上分别包被有卡那霉素-载体蛋白(牛血清白蛋白)偶联物构成的检测线和兔抗鼠IgG构成的质控线。本发明的试纸条，具有特异性强，灵敏度高，检测时间短(10分钟)，可现场操作，检测成本低，操作简便，不需由专业人员操作等优点。文档编号G01N33/577GK101315382SQ20081011685公开日2008年12月3日申请日期2008年7月18日优先权日2008年7月18日发明者王羚鸿,邹明强,刚郝,涌金,陈立木申请人:中国检验检疫科学研究院