专利名称：异柠檬酸测定试剂盒及异柠檬酸的浓度测定方法
技术领域：
本发明涉及一种异柠檬酸测定试剂盒，同时本发明还涉及测定异柠檬酸浓 度的方法，属于食品检验测定技术领域。
背景技术：
异柠檬酸isocitric acid是柠檬酸的异构体，虽然量少，但广泛存在于生物界。 在落地生根属(Bryophyllum)等多汁植物的叶、或悬钩子类中特别多，生物能 够利用的是D型。是三羧酸循环中的一个成分。柠檬酸在鸟头酸酶的作用下可 逆地生成异柠檬酸和顺鸟头酸。在异柠檬酸脱氢酶(EC1丄1.41; EC1丄1.42) 的作用下变成a-酮戊二酸，在异柠檬酸裂合酶(isocitrate lyase, EC4. 1. 3. 1) 的作用下变成琥珀酸与乙醛酸。
中华人民共和国国家标准，GBT16771-1997，规定了橙、柑、桔汁及其饮料 中D-异柠檬酸的测定方法一紫外分光光度法。该方法适用于判定橙、柑、桔浓 縮汁和果汁，以及果汁含量不低于2.5%的橙、柑、桔汁饮料的总D-异拧檬酸 的测定。其测定原理异柠檬酸脱氢酶isocitmte dehydrogenase有两种类型-以NAD为辅酶的酶(ECl. 1.1. 41)和要NADP为辅酶的酶(EC1. 1.1. 42)， 两者催化同一反应。
异柠檬酸+NAD(P)+# a-酮戊二酸+C02 + NAP(P)H + H+ 在异柠檬酸脱氢酶催化下，样品中的D-异柠檬酸盐与NAD或NADP作用，生 成NADH或NADPH的含量，相当于D-异柠檬酸盐的量。在波长340nrn处测 定吸光度，确定样品中总D-异拧檬酸的含量。 发明内容本发明要解决的技术问题是提出一种利用酶倍增法(Enzymatic Doubling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光 度的变化，得以测定异柠檬酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该 方法的异柠檬酸测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、 全自动生化分析仪上进行异柠檬酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因 而可以得到切实的推广应用。
本发明异柠檬酸浓度测定方法原理如下
异拧檬酸+辅酶异柠檬酸脱氢酶二氧化碳+酮戊二酸酯+
还原型辅酶
二氧化碳+乙酰磷酸+过氧化氢丙酮酸氧化酶磷酸根+
丙酮酸+氧+水 磷酸根+甘油醛-3-磷酸+辅酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶
甘油酸-l，3-双磷酸+还原型辅酶 这种方法应用异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase; EC 1.1.1.41; EC 1丄1.42)酶(偶)联丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase; EC 1.2.3.3)、甘油醛-3-磷 酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; EC 1.2.1.59)酶促反应 终点法。异柠檬酸脱氢酶酶解异柠檬酸反应产生二氧化碳，并将辅酶(在340nm 处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)；再通过(偶) 联合丙酮酸氧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，第二次将辅酶(在340nm处 没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还 原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度，通过测量340nm处吸光度上升的程度， 可以测算异柠檬酸的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明异柠檬酸测定试剂盒较为理想:
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
异柠檬酸脱氢酶 10000 U/L
丙酮酸氧化酶 12000 U/L
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 12000 U/L
乙酰磷酸 8 mmol/L
过氧化氢 7 mmol/L
甘油醛-3-磷酸 5mmol/L
本发明的异柠檬酸测定试剂盒可以是单剂，包括
缓冲液、稳定剂、辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、甘油醛-3-磷
酸脱氢酶、乙酰磷酸、过氧化氢、甘油醛-3-磷酸。 试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂， 直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、乙酰磷酸、过氧化氢、甘油醛-3-磷酸。 试剂2
缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、甘油醛-3-磷酸 脱氢酶。
辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、乙酰磷酸、 过氧化氢、甘油醛-3-磷酸在试剂l或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是 干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂 试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶、乙酰磷酸、过氧化氢、甘油醛-3-磷酸。 试剂2
缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶。 试剂3
缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶。 辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、乙酰磷酸、 过氧化氢、甘油醛-3-磷酸在试剂l、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂 盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接 使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定异柠檬酸浓度的方法，其辅酶可以 是NADP+ 、 NAD+或thio- NAD+中的 一种。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。 实施例一
本实施例的异柠檬酸测定试剂为单试剂，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500 mmol/L
辅酶 3 mmol/L
异拧檬酸脱氢酶 10000 U/L
丙酮酸氧化酶 12000 U/L
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 12000 U/L
乙酰磷酸 8 mmol/L过氧化氢 7 mmol/L
甘油醛-3-磷酸 5 mmol/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前， 加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度《 0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测异柠檬酸样品与试剂的体积 比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约O分钟左右，检测 时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出异拧檬酸的浓度大小。 实施例二
本实施例的异柠檬酸测定试剂为双试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 100mmol/L 稳定剂 50 mmol/L
3 mmol/L 8 mmol/L 7 mmol/L
乙酰磷酸 过氧化氢
甘油醛-3-磷酸
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂
异柠檬酸脱氢酶 丙酮酸氧化酶
5 mmol/L
簡mmol/L 50 mmol/L 10000U/L 12000 U/L甘油醛-3-磷酸脱氢酶 12000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。 在全自动生化分析仪上设定温度37'C，反应时间10分钟，起始吸光度《
0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测异柠檬酸样品与试剂1、试
剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约O分
钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，
检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出异柠檬酸的浓度大小。
实施例三
本实施例的异柠檬酸测定试剂为三试剂，包括 试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 稳定剂 辅酶 乙酰磷酸 过氧化氢 甘油醛-3-磷酸 试剂2
三(羧甲基)氨基甲垸一盐酸缓冲液 稳定剂
丙酮酸氧化酶 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷一盐酸缓冲液 10Ommol/L
100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 8 mmol/L 7 mmol/L 5 mmol/L
腦mmol/L 500 mmol/L
12000 U/L
12000 U/L稳定剂 500 mmol/L
异柠檬酸脱氢酶 10000 U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。 测定异柠檬酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定温度37°C，反应时间 IO分钟，起始吸光度《0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测异 柠檬酸样品与试剂l、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为正反 应(上升反应)，延迟时间大约O分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下， 检测主波长340nm吸光度上升的程度，从而测算出异柠檬酸的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他测定方法均能达到 本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器 得出所需的测定结果——空白试剂吸光度变化(AA/min)《0.001;吸光度吋 间反应曲线应呈上升曲线直至终点；试剂可测有效(R》0.99)线形范围可达 40mmol/L;试剂测试的不准确度，其相对偏差不超过±4%;试剂测试的精密 度(重复性)的变异系数(CV)《2%;试剂的灵敏度可达0.09 ± 0.05 AA/ mmol /L;试剂在2—8'C下保存，活性可以稳定一年；——本发明灵敏度高、 精确度好，线形范围宽广，稳定期长，足以便于推广应用。
权利要求
1.一种酶倍增法、酶比色法及酶联法的异柠檬酸的浓度测定方法，其方法原理如下异柠檬酸+辅酶 异柠檬酸脱氢酶 二氧化碳+酮戊二酸酯+还原型辅酶二氧化碳+乙酰磷酸+过氧化氢 丙酮酸氧化酶 磷酸根+ 丙酮酸+氧+水磷酸根+甘油醛-3-磷酸+辅酶 甘油醛-3-磷酸脱氢酶甘油酸-1，3-双磷酸+还原型辅酶将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度，测算出异柠檬酸的浓度大小测定结果。
2. —种异柠檬酸测定试剂盒，主要成分包括缓冲液20———500 mmol/L稳定剂1——4000 mmol/L辅酶1—6 mmol/L异柠檬酸脱氢酶1000———80000 U/L丙酮酸氧化酶1000———80000 U/L甘油醛-3-磷酸脱氢酶1000———80000 U/L乙酰磷酸1-50 mmol/L过氧化氢l-50 mmol/L甘油醛-3-磷酸1—50 mmol/L试剂成分的浓度不一定只限于上述范围；在此范围内效果较好，在此范 围外，试剂仍会反应作用。其特征在于试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3. 根据权利要求2所述异柠檬酸测定试剂盒，其特征在于-由缓冲液、稳定剂、辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、甘油醛-3-磷酸 脱氢酶、乙酰磷酸、过氧化氢、甘油醛-3-磷酸组成单剂试剂。
4. 根据权利要求2所述异柠檬酸测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、甘油醛-3-磷 酸脱氢酶、乙酰磷酸、过氧化氢、甘油醛-3-磷酸组成双剂试剂；试剂l，由 缓冲液、稳定剂、辅酶、乙酰磷酸、过氧化氢、甘油醛-3-磷酸组成；试剂2， 由缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢 酶组成。辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、 乙酰磷酸、过氧化氢、甘油醛-3-磷酸在试剂l或试剂2中的位置可以不限。
5. 根据权利要求2所述异柠檬酸测定试剂盒，其特征在于由缓冲液、稳定剂、辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、甘油醛-3-磷 酸脱氢酶、乙酰磷酸、过氧化氢、甘油醛-3-磷酸组成多剂试剂；试剂l，由 缓冲液、稳定剂、辅酶、乙酰磷酸、过氧化氢、甘油醛-3-磷酸组成；试剂2， 由缓冲液、稳定剂、丙酮酸氧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶组成；试剂3，由 缓冲液、稳定剂、异柠檬酸脱氢酶组成。辅酶、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧 化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、乙酰磷酸、过氧化氢、甘油醛-3-磷酸在试剂 1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6. 根据权利要求2所述异柠檬酸测定试剂盒，其特征在于还包括稳定剂 14000 mmol/L或0.1%-100%体积比。所述稳定剂为硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol) 及防腐剂中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种利用酶倍增法、酶比色法及酶联法技术的异柠檬酸测定试剂盒，同时本发明还涉及测定异柠檬酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于食品检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括缓冲液、辅酶、乙酰磷酸、过氧化氢、甘油醛-3-磷酸、异柠檬酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的程度，从而测算出异柠檬酸的浓度大小。
文档编号G01N21/25GK101609020SQ20081012283
公开日2009年12月23日 申请日期2008年6月19日 优先权日2008年6月19日
发明者王尔中 申请人:苏州艾杰生物科技有限公司