专利名称：精浆柠檬酸定量检测试剂的制作方法
技术领域：
本发明属于体外诊断试剂类，具体适用于检测精浆柠檬酸含量。
背景技术：
精浆柠檬酸来自前列腺，其作用是络合钙离子，通过与钙离子结合，而调节精浆钙离子浓度。精浆柠檬酸既影响射精后精液液化功能，又参与维持精浆渗透压，对精子活力及透明质酸酶的活性也起重要作用。研究表明，精浆柠檬酸含量还与睾酮水平相关，因此精浆柠檬酸含量是帮助判断雄激素分泌状态及评价前列腺功能的重要指标。
目前，精浆柠檬酸测定主要有吡啶显色法和世界卫生组织(WHO)推荐的酶法。吡啶显色法方法学存在缺陷，特异性不够；WHO推荐的酶法方法学特异，准确性好，但其检测线性范围不够宽，且试剂组成复杂稳定性差，精浆标本需去蛋白处理，不便于手工操作，同时WHO推荐的酶法需要用到三种工具酶，对反应的干扰较大。
精浆柠檬酸是评价前列腺功能的常用指标，因此建立一种特异、灵敏、操作简单的方法学显得特点重要。
发明内容
本发明意在克服现有技术的不足，提供一种特异性好、方法学指标优、操作简单、性能稳定、贮存期长、可以实现自动化/手工双选择操作的精浆柠檬酸定量检测试剂。
为实现上述目的，本发明提出一种精浆柠檬酸定量检测试剂，包括保护液、缓冲液、含有柠檬酸的水溶液标准品和含有苯骈咪唑的水溶液，所述保护液是含有柠檬酸裂解酶的酶保护液，所述水溶液中苯骈咪唑含量优选0.1～1.0％，所述酶保护液中柠檬酸裂解酶的含量优选2000～8000U/L。。
所述保护液由柠檬酸裂解酶和酶保护液组成。
所述缓冲液中还包括防腐剂，所述标准品中还包括防腐剂。
还包括溶解液，所述酶保护液为冻干粉，溶解液用于溶解酶保护液冻干粉。
由于上述技术方案，结合下面将要详述的实施例，本发明突出的技术效果在于采用苯骈咪唑和柠檬酸裂解酶，大大加快了反应速度；只有酶保护液中的柠檬酸裂解酶能催化标准品中的柠檬酸生成能与苯骈咪唑反应的物质—丙酮，因此定量检测的精浆柠檬酸含量只与酶保护液中的柠檬酸裂解酶有关，只需用到传统酶保护液中的一种工具酶—柠檬酸裂解酶，排除了保护液中其他酶的干扰因素小，相对WHO推荐的酶法(需用到三种酶)，方法更特异，方法学指标更优；样本无需去蛋白处理，使得整个试验过程操作更简单，同时检测既可以采用原有的自动化检测方法，又可以采用手工检测方法，实现了自动化/手工双选择，使得人们在检测方法上有更大的选择性；由于手工操作对操作环境及仪器的限定更小，实用性更强，更适于临床常规检测的开展；将酶保护液冻干，并采用了防腐剂，试剂稳定，2～8℃保存贮存期可达一年。
具体实施例方式
下面通过具体的实施例并结合附图
对本发明作进一步详细的描述。
实施例，一种精浆柠檬酸定量检测试剂，包括如下成分A液含苯骈咪唑的水溶液，每100mlA液中含苯骈咪唑0.25毫升；B液(冻干粉)含柠檬酸裂解酶的酶保护液冻干粉，每100ml酶保护液中含柠檬酸裂解酶470U；冻干粉溶解液含葡萄糖、氯化钠和酪蛋白的水溶液，每1000ml冻干粉溶解液中含葡萄糖10克、氯化钠30mmol、酪蛋白2克；缓冲液含叠氮钠、硫酸镁(MgSO4)和三羟甲基氨基甲烷(Bis-Tris)90mmol的水溶液，每1000ml缓冲液中含叠氮钠0.2g、MgSO40.1mmol、Bis-Tris 90mmol；标准品含叠氮钠和柠檬酸的水溶液，每1000ml标准品中含叠氮钠0.2g、柠檬酸2mmol。
上述精浆柠檬酸定量检测试剂各成分采用如下步骤制得A、A液的制作工艺方法1)取苯骈咪唑0.25毫升，加蒸馏水至100毫升，充分溶解后，置4℃保存；B、B液(冻干粉)的制作工艺方法2)称取柠檬酸裂解酶470U，加酶保护液100ml，充分溶解，分装冻干。置4℃保存；C、缓冲液的制作工艺方法3)称取Bis-Tris90mmol、MgSO40.1mmol，叠氮钠0.2g，置烧杯内，加蒸馏水800毫升，搅拌充分溶解，4)调pH至9.2，定容至1000ml，置4℃保存；D、标准品(2μmol/ml)的制作工艺方法5)称取2mmol柠檬酸、0.2g叠氮钠溶于1000ml蒸馏水中，置4℃保存；E、冻干粉溶解液的制作工艺方法6)称取葡萄糖10克，氯化钠30mmol，酪蛋白2克，溶于800毫升蒸馏水中，7)用蒸馏水定容至1000毫升。置4℃保存。
上述实施例中，A液是苯骈咪唑含量为0.1～1.0％的水溶液，苯骈咪唑用于与柠檬酸被柠檬酸裂解酶作用后的产物-酮酸结合，形成在330nm波长下有最大吸收峰的化合物，当苯骈咪唑的含量低于0.1％时，由于反应不与柠檬酸含量成正比，而无法进行反应，当苯骈咪唑的含量高于1.0％时，反应速度不再快速增加，只是增加成本；B液冻干粉是柠檬酸裂解酶含量为2000～8000U/L的酶保护液冻干粉，一般而言，精浆柠檬酸定量检测试剂的酶保护液中，柠檬酸裂解酶的含量的下限为2000U/L，为控制成本，柠檬酸裂解酶的含量的上限为8000U/L，在2000～8000U/L的范围内，柠檬酸裂解酶的含量越高，催化反应到终点的速度越快；冻干粉溶解液是葡萄糖含量为0.2～2.0％、氯化钠含量为10～100mM、酪蛋白含量为0.1～1.0％的水溶液，其中葡萄糖还可以用其他的单糖来替换，氯化钠还可以用其余可溶性含氯的无机盐替换，冻干粉溶解液也可以采用其他常见的酶保护液冻干粉溶解液；缓冲液是叠氮钠含量为0.01～0.1％、MgSO4含量为0.02～0.2mmol/L的Tris缓冲液，其中叠氮钠还可以用其他的防腐剂替换，MgSO4用于提供测定中所需的阳性离子-镁，加快酶促反应的速度，还可以用别的可溶性镁盐替换，缓冲液也可以采用别的酶促反应中的缓冲液替换；标准品是叠氮钠含量为0.01～0.1％、柠檬酸含量为1～5mmol/L的水溶液，标准品中的柠檬酸被酶保护液中的柠檬酸裂解酶催化后，与苯骈咪唑反应，生成可供检测的物质，标准品采用的是现有精浆柠檬酸测定中使用的标准品。
试验例，用精浆柠檬酸定量检测试剂检测精浆柠檬酸含量，具体步骤为一、试剂准备B液冻干粉以500μl冻干粉溶解液充分溶解。
二、样本准备1、记录受检者一次射精的精液总量(ml)。精液液化后以3000g离心10分钟，保留精浆。
2、测定前用稀释液将待测精浆标本1∶10稀释三、操作方法准备1cm的石英比色皿若干，按如下测定步骤，在石英比色皿中完成反应空白管标准管测定管标本稀释液(μl) 20----- -----标准品(μl) ----- 20-----稀释标本(μl) ----- ----- 20A液(μl)202020缓冲液(μl) 2000 2000 2000颠倒混匀，室温放置15min。以空白管调零，330nm测定第一次吸光度A1B液(μl)202020颠倒混匀，室温放置10～40min。以空白管调零，330nm测定第二次吸光度A2四、结果计算因为标本的吸光度(A)与标本的浓度的比值等于标准液的A值与标准液的浓度的比值，即 又因为第一次吸光度A1测的是反应液的干扰物的吸光度；第二次吸光度A2测的是反应液的总吸光度；同时已经用稀释液将精浆标本稀释了10倍，因此在计算标本浓度时也相应地将标准品的浓度2μmol/ml乘以10用20μmol/ml进行计算。
综上所述，计算精浆中柠檬酸含量(C标本)的公式如下 其中，ΔA标本＝A标本2-A标本1，ΔA标准＝A标准2-A标准1实际检测，采用酶标仪比色完成。
五、结果报告标本最终检测结果以“精浆柠檬酸总浓度”方式报告总浓度＝标本浓度(μmol/ml)×一次射精的精液体积(ml)＝μmol/一次射精六、正常参考值≥100μmol/l次射精七、临床适用性检测精浆柠檬酸对前列腺炎具有诊断价值。
权利要求
1.一种精浆柠檬酸定量检测试剂，包括保护液、缓冲液和含有柠檬酸的水溶液标准品，其特征在于还包括含有苯骈咪唑的水溶液，所述保护液是含有柠檬酸裂解酶的酶保护液。
2.如权利要求1所述的精浆柠檬酸定量检测试剂，其特征在于所述保护液由柠檬酸裂解酶和酶保护液组成。
3.如权利要求1或2所述的精浆柠檬酸定量检测试剂，其特征在于所述水溶液中苯骈咪唑含量为0.1～1.0％，所述酶保护液中柠檬酸裂解酶的含量为2000～8000U/L。
4.如权利要求3所述的精浆柠檬酸定量检测试剂，其特征在于所述缓冲液是含有硫酸镁的三羟甲基氨基甲烷缓冲液。
5.如权利要求4所述的精浆柠檬酸定量检测试剂，其特征在于所述缓冲液中还包括防腐剂，所述标准品中还包括防腐剂。
6.如权利要求5所述的精浆柠檬酸定量检测试剂，其特征在于还包括溶解液，所述酶保护液为冻干粉，溶解液用于溶解酶保护液冻干粉。
7.如权利要求6所述的精浆柠檬酸定量检测试剂，其特征在于所述溶解液是含有单糖、无机盐、酪蛋白的水溶液。
8.如权利要求7所述的精浆柠檬酸定量检测试剂，其特征在于所述溶解液中单糖的含量为0.2～2.0％、无机盐的含量为10～100mM、酪蛋白的含量为0.1～1.0％。
9.如权利要求8所述的精浆柠檬酸定量检测试剂，其特征在于所述标准品为含柠檬酸含量为1～5mmol/L的水溶液。
全文摘要
本发明公开一种精浆柠檬酸定量检测试剂，包括保护液、缓冲液、含有柠檬酸的水溶液标准品和含有苯骈咪唑的水溶液，所述保护液是含有柠檬酸裂解酶的酶保护液。所述保护液由柠檬酸裂解酶和酶保护液组成。所述缓冲液中还包括防腐剂，所述标准品中还包括防腐剂。还包括溶解液，所述酶保护液为冻干粉，溶解液用于溶解酶保护液冻干粉。由于上述技术方案，结合下面将要详述的实施例，本发明突出的技术效果在于酶保护液中只有一种工具酶柠檬酸裂解酶，使得反应中来自其他酶的干扰因素小，方法更特异，方法学指标更优；样本无需去蛋白处理，操作简单；将酶保护液冻干，并采用了防腐剂，试剂稳定，2～8℃贮存期可达一年。
文档编号G01N33/52GK1595154SQ20041004024
公开日2005年3月16日 申请日期2004年7月14日 优先权日2004年7月14日
发明者傅剑华, 刘瑜, 胡家纯, 何林, 何小红 申请人:深圳华康生物医学工程有限公司