专利名称：利用四唑蓝法快速测定发光细菌活细菌总数的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种快速测定发光细菌活细菌总数的方法，特别是一种基于MTT显色原理的活细菌计数方法。
背景技术：
据本发明人通过査阅资料、文献检索所知
目前，在微生物学、免疫学以及其他学科的实验中，常用一定浓度的活细菌作为实验材料，这就涉及 到一个活菌计数的问题。微生物学常用的几种细菌计数方法有比浊法、平板计数法等。比浊法操作方法简 单但只能测量细菌数量，不能判断细菌的活性；平板计数法虽然测量的是活菌数，但方法繁琐，重复性较
差，所需时间长，在菌落计数时容易造成误差。
四唑蓝(tetrazoliumsalt，MTT)比色法是一种于1983年首创用于检测细胞生长和存活的新方法。其原 理是活细胞内的琥珀酸脱氢酶可将MTT(淡黄色)还原成蓝紫色的formazan，而且形成的量与活细胞数量成 正比关系。此方法具有简单、快速、灵敏、稳定的特点，克服了常规方法的不足之处。近年来，在体外药 敏试验、细胞增殖、细胞毒性和活性测定等方面有诸多的应用。已成为哺乳动物细胞活性测定的基本方法， 具有快速、简便、准确、避免使用同位素等优点。
目前尚未有将MTT法应用于发光细菌活细菌总数测定的相关报道。
发明内容
本发明的目的是建立一种快速测定发光细菌活细菌总数的方法，特别是一种基于MTT显色原理的活 细菌计数方法。
本发明采用MTT比色法测定发光细菌活菌数，通过对MTT比色法的检测条件进行了优化选择。确定 最佳的测定发光细菌活细菌总数的方法。
本发明首先将MTT和活菌体内琥珀酸脱氢酶反应生成的产物formazan溶于DMSO后，在400nm — 800nm范围内测定光吸收值，确定检测的最大吸收波长为500nm。通过优化时间、温度对吸光值的影响， 确定最佳的测定条件为反应时间2h,反应温度25'C。
本发明检测原理新颖，检测方法简便快速，重复性好，可适用于食品卫生与安全、环境检测等领域发 光细菌活细胞数量的定量检测。同时可应用于微生物学、免疫学以及其他学科的实验中，作为活细菌材料 活性和数量的测定。本发明还可发展成为细菌总数测定的方法，用于替代传统的测定活体细胞总数的方法。
附图1 MTT与活菌作用后生成的物质溶于DMSO的吸收光谱。 附图2 MTT法测定发光细菌活菌数的标准曲线。
具体实施方式
实施例1
0.3mL MTT溶液加到3mL经适当稀释的发酵液中，混匀后25。C下放置2h，在10，000r/min下离心10min， 弃去上清液，加3mLDMSO充分溶解沉淀，用紫外可见分光光度计扫描最大吸收波长，在400nm — 800nm 范围内测定光吸收值。由图1可知其最大吸收峰在500nm处。
实施例2
以DMSO为参比，无菌生理盐水、无菌空白培养基、发酵上清液(10,000r/min 离心后，吸取上清液)和死菌体(沸水浴30min)作为待测样，用MTT法测得的光吸收值见表1。由该表可知， 这些物质对测定结果干扰很小。由此可见，MTT法是与活菌量有关，而与培养基中所含固型物以及代谢产 物的性质无关，这在很大程度上解决了由于培养基含有固型物而用浊度法与菌体干重法测活菌带来的严重干扰。
3表l不同物质为空白对照时吸光值
DMSO 无菌生理无菌空白发酵上淸PBS 菌体沸水'菌体沸水
_盐水 培养基_浴10min 浴30min
A500nm~~5 0.0050扁0.0190.0060.016 0,004
实施例3
0.3mL MTT溶液加到3mL经适当稀释的发酵液中，混匀后25'C下分别放置2h，在10，000r/min下离 心10min，充去上清液，加3mLDMSO充分溶解沉淀后于500nm处测定吸光值。同时将离心后的菌体用生 理盐水复溶，梯度稀释后，涂布平板，进行菌落计数。
权利要求
1一种快速测定发光细菌活细菌总数的方法，其特征是(1)基于MTT显色的原理；(2)测定波长为500nm；(3)测定温度为25℃；(4)反应时间为2h。
全文摘要
本发明的目的是建立一种快速测定发光细菌活细菌总数的方法，特别是一种基于MTT显色原理的活细菌计数方法。本发明采用MTT比色法测定发光细菌活菌数，通过对MTT比色法的检测条件进行了优化选择。确定最佳的测定发光细菌活细菌总数的方法。本发明首先将MTT和活菌体内琥珀酸脱氢酶反应生成的产物formazan溶于DMSO后，在400nm一800nm范围内测定光吸收值，确定检测的最大吸收波长为500nm。通过优化时间、温度对吸光值的影响，确定最佳的测定条件为反应时间2h，反应温度25℃。本发明检测原理新颖，检测方法简便快速，重复性好，可适用于食品卫生与安全、环境检测等领域发光细菌活细胞数量的定量检测。同时可应用于微生物学、免疫学以及其他学科的实验中，作为活细菌材料活性和数量的测定。本发明还可发展成为细菌总数测定的方法，用于替代传统的测定活体细胞总数的方法。
文档编号G01N21/76GK101620188SQ20081014009
公开日2010年1月6日 申请日期2008年9月22日 优先权日2008年9月22日
发明者洪 林, 王亚群, 王静雪 申请人:中国海洋大学