复合型硅壳结构的荧光纳米探针及其制备方法和应用的制作方法

专利名称：复合型硅壳结构的荧光纳米探针及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于纳米材料学和生物分析化学领域，具体涉及一种生物功能化的罗丹明染料/ 纳米金/二氧化硅复合型硅壳结构的荧光纳米探针及其制备方法和应用。
背景技术：
罗丹明染料(如罗丹明B、罗丹明6G)具有强烈的荧光，被广泛应用于各种生物分析 技术中，包括生物大分子的荧光标记、荧光免疫分析检测及靶向荧光成像等。其中，罗丹 明染料在荧光标记技术中的应用备受关注。
利用荧光染料作为标记物己经在生物医学的许多领域，特别是细胞标记和成像中得到 广泛的应用。随着研究的进一步深入，要求检测灵敏度进一步的提高，荧光染料由于其标 记效率低、光稳定性差和相对低的荧光强度等缺点已经限制了其在该领域的应用和发展。 随之而发展起来的硅壳型荧光纳米粒子，由于其克服了荧光染料的光稳定性差和相对低的 荧光强度等缺点，成为新一代最具有发展前景的荧光标记物之一。
表面修饰上特异性生物分子的硅壳型荧光纳米探针与光学成像技术相结合，可以实现 对标记分子的靶向观测。但现有的以罗丹明染料直接标记的探针普遍存在荧光效率低，光 稳定性差，染料易泄露等缺点。

发明内容
针对现有的荧光纳米探针的缺限与不足，本发明的目的是提供一种荧光效率高，粒径 可控，工艺简单，稳定性好的复合型硅壳结构的荧光纳米探针及其在生物医学领域中的应 用。
本发明的目的通过以下技术方案实现-.
一种复合型硅壳结构的荧光纳米探针，是以复合型硅壳结构的荧光纳米粒子为基质材 料，其表面偶联了生物分子；
所述复合型硅壳结构的荧光纳米粒子的外壳成分为二氧化硅，荧光内核是由纳米金及 其表面包裹的罗丹明染料组成。
为更好的实现本发明的技术方案
上述纳米金的粒径优选为25±5 nm，复合型硅壳结构的荧光纳米粒子的粒径优选为60士10nm。
上述生物分子可以是具有生物功能的小分子药物、氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸或 核酸等类别以及生物标记领域公知的其他分子，并完全可以利用公知的技术标记上述复合 型硅壳结构的荧光纳米粒子得到。
本发明还提供了上述复合型硅壳结构的荧光纳米探针的制备方法，具体包括以下步骤-
(1) 复合型硅壳结构的荧光纳米粒子的制备
a. 在纳米金溶液中，按纳米金与罗丹明染料的摩尔比为1:1-4加入罗丹明染料溶液， 反应持续6-12h，得到包裹了染料的纳米金溶液，称为反应液；
b. 在磁力搅拌下加入氨水到a.得到的反应液中，调节溶液的pH值在10-11之间；
c. 向b.得到的反应液中按纳米金与正硅酸乙酯的摩尔比为1:1-6加入正硅酸乙酯的乙 醇溶液，在磁力搅拌下反应12-24h，即可得到所述复合型硅壳结构的荧光纳米粒子；
(2) 步骤(1)所得荧光纳米粒子的氨基化在磁力搅拌下，将复合型硅壳结构的荧 光纳米粒子和氨基丙基三甲氧基硅垸的乙醇溶液以摩尔比为100-500:1的比例反应12-24h， 即可得到氨基化的复合型硅壳结构的荧光纳米粒子；
(3) 连接生物分子将氨基化的荧光纳米粒子与生物耦连剂以摩尔比为1-4:1的比例 相混合，再加入待连接的生物分子(1.0-10.0 mg/ml)，在4'C下避光孵育6-12h;离心过滤， 并将标记上生物分子的荧光纳米粒子重新分散在磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0-7.8)中，即可到 连接上生物分子的荧光纳米探针，于4'C以下贮存。
所述步骤(1)中，所述纳米金溶液的摩尔浓度优选为1.0xlO—6-5.0xl(T6mol/L;所述罗 丹明染料溶液的摩尔浓度优选为5.0xlO—6-1.0xl(T5mol/L;所述正硅酸乙酯的乙醇溶液的摩 尔浓度优选为1.0xl(T3-5.0xl(r3mol/L;所述纳米金的粒径优选为25±5 nm;所述复合型硅壳 结构的荧光纳米粒子的粒径优选为60±10nm。
所述歩骤(2)中，所述氨基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液的摩尔浓度优选为 1.0xlO-3-5.0xl(T3 mol/L。
所述步骤(3)中，所述生物耦连剂可以是本领域常用的偶联剂，但优选乙基3-(3-二甲 氨基)碳二亚胺盐酸盐，其摩尔浓度范围优选0.1-1.0 mol/L。
上述生物功能化的复合型硅壳结构的荧光纳米探针既有优异的荧光特性又具有生物活 性，能应用于生物标记和生物检测等领域。利用荧光纳米探针表面固定的生物分子对细胞 表面特异性表达分子的高识别能力，将生物功能化的荧光纳米探针与细胞在37'C孵育，可 以实现对细胞表面特异性分子的准确标记；进一步利用激光共聚焦显微镜可以实现对细胞
5表面特异性分子的荧光识别。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果
本发明将复合型硅壳结构的荧光纳米粒子表面氨基功能化，然后通过酰胺键与生物分 子相连，实现了复合型硅壳结构的荧光纳米粒子表面的生物功能化及其在细胞标记上的应 用。本发明的方法通过结合高特异型的分子识别和荧光纳米探针的信号放大作用来提高荧 光标记的准确性。生物功能化的荧光纳米探针制备简单、步骤较少、荧光效率较高，能实 现对细胞表面特异性分子的荧光标记。在生物标记和生物检测领域具有一定的应用前景。


图1为生物功能化的罗丹明染料/纳米金/二氧化硅复合型硅壳结构的荧光纳米探针的结构 示意图。
图2为复合型硅壳结构的荧光纳米探针标记宫颈癌细胞3h后的激光共聚焦显微镜图。 其中，A使用表面标记上转铁蛋白分子荧光纳米探针，B使用未标记上生物分子的荧光纳 米探针。
具体实施例方式
下面结合实施例，对本发明做进一步地详细说明，但本发明的实现方式并不局限于此。 实施例1转铁蛋白标记的罗丹明B/纳米金/二氧化硅复合型硅壳结构的荧光纳米探针 对宫颈癌细胞的特异性标记
(1) 罗丹明B/纳米金/二氧化硅复合型硅壳结构的荧光纳米粒子的制备
采用氯金酸-柠檬酸钠还原法制备粒径为25±5 nm的纳米金溶液；再向纳米金溶液中加 入摩尔比为1:1的罗丹明B溶液(5.0xl(T6 mol/L)，反应持续6h，得到包裹上罗丹明B染 料的纳米金溶液，称为反应液。通过氨水调节反应液的pH值在10-11之间。在磁力搅拌下， 向上述反应液中按纳米金与正硅酸乙酯的摩尔比为1:1加入正硅酸乙酯的乙醇溶液 (l.Oxl(T3 mol/L)，在磁力搅拌下反应12h，即可得到粒径为50 60 nm的罗丹明B/纳米金/ 二氧化硅复合型硅壳结构的荧光纳米粒子。
(2) 氨基化的荧光纳米粒子与生物分子的连接在磁力搅拌下，将复合型硅壳结构的 荧光纳米粒子和氨基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液(l.Oxl(T3 mol/L)以摩尔比为100:1的 比例反应12h，即可得到氨基化的复合型硅壳结构的荧光纳米粒子；将氨基化的荧光纳米 粒子与O.l mol/L生物耦连剂(乙基3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐)以摩尔比为l:l的比 例相混合，再加入待连接的生物分子(1.0mg/ml)，在4。C下避光孵育12h。以5000rpm的速度，离心过滤10min，并将标记上生物分子的荧光纳米粒子重新分散在磷酸盐缓冲溶液 (pH 7.0-7.8)中，即可到标记上转铁蛋白分子的荧光纳米探针，于4。C贮存。
G)生物功能化的荧光纳米探针对宫颈癌细胞上特异表达的转铁蛋白受体的特异性识 别利用生物功能化的荧光纳米探针表面固定的转铁蛋白分子对宫颈癌细胞表面高度表达 的转铁蛋白受体的特异性识别，将标记上转铁蛋白分子的荧光纳米探针与宫颈癌细胞在 37"C孵育3h。将细胞置于激光共聚焦显微镜下观察，以绿光激发，宫颈癌细胞膜表面特异 性表达的转铁蛋白受体发橙红色的荧光，实现对细胞表面特异性分子的荧光识别。
实施例2转铁蛋白标记的罗丹明B/纳米金/二氧化硅复合型硅壳结构的荧光纳米探针 对宫颈癌细胞的特异性标记
(1) 罗丹明B/纳米金/二氧化硅复合型硅壳结构的荧光纳米粒子的制备(粒径较大的 荧光纳米粒子)
采用氯金酸-柠檬酸钠还原法制备粒径为25±5 nm的纳米金溶液；再向纳米金溶液中加 入摩尔比为1:4的罗丹明B溶液(l.Oxl(T5 mol/L)，反应持续12h，得到包裹上罗丹明B染 料的纳米金溶液，称为反应液。通过氨水调节反应液的pH值在10-11之间。在磁力搅拌下， 向上述反应液中加入按纳米金与正硅酸乙酯摩尔比为1:6加入正硅酸乙酯的乙醇溶液 (5.0x10—3 mol/L)，在磁力搅拌下反应24h，即可得到粒径为60 70 nm的罗丹明B/纳米金/ 二氧化硅复合型硅壳结构的荧光纳米粒子。
(2) 氨基化的荧光纳米粒子与生物分子的连接在磁力搅拌下，将复合型硅壳结构的 荧光纳米粒子和氨基丙基三甲氧基硅垸的乙醇溶液(5.0xl0'3 mol/L)以摩尔比为500:1的 比例反应24h，即可得到氨基化的复合型硅壳结构的荧光纳米粒子；将氨基化的荧光纳米 粒子与1.0 mol/L生物耦连剂(乙基3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐)以摩尔比为4:1的比 例相混合，再加入待连接的生物分子U0.0mg/ml)，在4匸下避光孵育12h。以5000rpm的 速度，离心过滤10min，并将标记上生物分子的荧光纳米粒子重新分散在磷酸盐缓冲溶液
(pH 7.0-7.8)中，即可到标记上转铁蛋白分子的荧光纳米探针，于4'C贮存。
G)生物功能化的荧光纳米探针对宫颈癌细胞上特异表达的转铁蛋白受体的特异性识 别利用生物功能化的荧光纳米探针表面固定的转铁蛋白分子对宫颈癌细胞表面高度表达 的转铁蛋白受体的特异性识别，将标记上转铁蛋白分子的荧光纳米探针与宫颈癌细胞在 37'C孵育3h。将细胞置于激光共聚焦显微镜下观察，以绿光激发，宫颈癌细胞膜表面特异 性表达的转铁蛋白受体发橙红色的荧光，实现对细胞表面特异性分子的荧光识别。
实施例3转铁蛋白标记的罗丹明6G/纳米金/二氧化硅复合型硅壳结构的荧光纳米探针对宫颈癌细胞的特异性标记
(1) 罗丹明6G/纳米金/二氧化硅复合型硅壳结构的荧光纳米粒子的制备 采用氯金酸-柠檬酸钠还原法制备粒径为25±5 nm的纳米金溶液；再向纳米金溶液中加
入摩尔比为1:4的罗丹明6G溶液(l.Oxl(T5 mol/L)，反应持续6h，得到包裹上罗丹明6G 染料的纳米金溶液，称为反应液。通过氨水调节反应液的pH值在10-11之间。在磁力搅拌 下，向上述反应液中加入按纳米金与正硅酸乙酯的摩尔比为1:1加入正硅酸乙酯的乙醇溶 液(5.0x10—3 mol/L)，在磁力搅拌下反应24h，即可得到粒径为50~60 nm的罗丹明6G/纳米 金/二氧化硅复合型硅壳结构的荧光纳米粒子。
(2) 氨基化的荧光纳米粒子与生物分子的连接在磁力搅拌下，将复合型硅壳结构的 荧光纳米粒子和氨基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液(5.0xl(T3 mol/L)以摩尔比为500:1的 比例反应24h，即可得到氨基化的复合型硅壳结构的荧光纳米粒子；将氨基化的荧光纳米 粒子与1.0 mol/L生物耦连剂(乙基3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐)以摩尔比为4:1的比 例相混合，再加入待连接的生物分子(1.0mg/ml)，在4。C下避光孵育12h。以5000rpm的 速度，离心过滤10min，并将标记上生物分子的荧光纳米粒子重新分散在磷酸盐缓冲溶液
(pH 7.0-7.8)中，即可到标记上转铁蛋白分子的荧光纳米探针，于4'C贮存。
G)生物功能化的荧光纳米探针对宫颈癌细胞上特异表达的转铁蛋白受体的特异性识 别利用生物功能化的荧光纳米探针表面固定的转铁蛋白分子对宫颈癌细胞表面高度表达 的转铁蛋白受体的特异性识别，将标记上转铁蛋白分子的荧光纳米探针与宫颈癌细胞在 37t:孵育3h。将细胞置于激光共聚焦显微镜下观察，以绿光激发，宫颈癌细胞膜表面特异 性表达的转铁蛋白受体发橙红色的荧光，实现对细胞表面特异性分子的荧光识别。
实施例4转铁蛋白标记的罗丹明6G/纳米金/二氧化硅复合型硅壳结构的荧光纳米探针 对宫颈癌细胞的特异性标记
(1) 罗丹明6G/纳米金/二氧化硅复合型硅壳结构荧光纳米粒子的制备 采用氯金酸-柠檬酸钠还原法制备粒径为25±5 nm的纳米金溶液；再向纳米金溶液中加
入摩尔比为1:2的罗丹明6G溶液(8.0x10—6 mol/L)，反应持续9h，得到包裹上罗丹明6G 染料的纳米金溶液，称为反应液。通过氨水调节反应液的pH值在10-11之间。在磁力搅拌 下，向上述反应液中按纳米金与正硅酸乙酯的摩尔比为1:4加入正硅酸乙酯的乙醇溶液 G.0xl0—3mol/L)，在磁力搅拌下反应18h，即可得到粒径为55~65 nm的罗丹明6G/纳米金 /二氧化硅复合型硅壳结构的荧光纳米粒子。
(2) 氨基化的荧光纳米粒子与生物分子的连接在磁力搅拌下，将复合型硅壳结构的荧光纳米粒子和氨基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液G.0xl(T3 mol/L)以摩尔比为300:1的 比例反应18h，即可得到氨基化的复合型硅壳结构的荧光纳米粒子；将氨基化的荧光纳米 粒子与0.5 mol/L生物耦连剂(乙基3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐)以摩尔比为2:1的比 例相混合，再加入待连接的生物分子(5.0mg/ml)，在4'C下避光孵育12h。以5000rpm的 速度，离心过滤10min，并将标记上生物分子的荧光纳米粒子重新分散在磷酸盐缓冲溶液 (pH7.0-7.8)中，即可到标记上转铁蛋白分子的荧光纳米探针，于4'C贮存。
G)生物功能化的荧光纳米探针对宫颈癌细胞上特异表达的转铁蛋白受体的特异性识 别利用生物功能化的荧光纳米探针表面固定的转铁蛋白分子对宫颈癌细胞表面高度表达 的转铁蛋白受体的特异性识别，将标记上转铁蛋白分子的荧光纳米探针与宫颈癌细胞在 37'C孵育3h。将细胞置于激光共聚焦显微镜下观察，以绿光激发，宫颈癌细胞膜表面特异 性表达的转铁蛋白受体发橙红色的荧光，实现对细胞表面特异性分子的荧光识别。
上述实施例l、 2、 3和4所制备的生物功能化的罗丹明染料(罗丹明B、罗丹明6G) /纳米金/二氧化硅复合型硅壳结构的荧光纳米探针其结构示意图见图1。复合型硅壳结构的 荧光纳米粒子通过酰胺键与生物分子相连，实现了复合型硅壳结构的荧光纳米粒子表面的 生物功能化。
现以实施例1为例，具体说明本发明所得生物功能化的荧光纳米探针在生物医学中的
应用
实施例1转铁蛋白标记的罗丹明B/纳米金/二氧化硅复合型硅壳结构的荧光纳米探针对 宫颈癌细胞表面特异性表达的转铁蛋白受体的标记，结果见图2A。在细胞膜表面有特异性 的橙红色荧光表达，表明该生物功能化的荧光探针对宫颈癌细胞表面特异性表达的转铁蛋 白受体进行了荧光标记。
实施例2未标记上特异性生物分子的罗丹明B/纳米金/二氧化硅复合型硅壳结构的荧光 纳米探针对宫颈癌细胞进行标记，结果见图2B。在细胞膜表面没有明显的橙红色荧光表达， 表明未标记上特异性生物分子的荧光探针不能对宫颈癌细胞表面特异性表达分子实现荧光 标记。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制， 其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均 应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1、一种复合型硅壳结构的荧光纳米探针，其特征在于是以复合型硅壳结构的荧光纳米粒子为基质材料，其表面偶联了生物分子；所述复合型硅壳结构的荧光纳米粒子的外壳成分为二氧化硅，荧光内核是由纳米金及其表面包裹的罗丹明染料组成。
2、 根据权利要求1所述的复合型硅壳结构的荧光纳米探针，其特征在于所述纳米金的 粒径为25±5 nm，整个复合型硅壳结构的荧光纳米粒子的粒径为60±10 nm。
3、 根据权利要求1所述的复合型硅壳结构的荧光纳米探针，其特征在于所述生物分子 是小分子药物、氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸或核酸。
4、 一种权利要求1所述复合型硅壳结构的荧光纳米探针的制备方法，其特征在于具体包 括以下步骤-(1) 复合型硅壳结构的荧光纳米粒子的制备a. 在纳米金溶液中，按纳米金与罗丹明染料的摩尔比为1:1-4加入罗丹明染料溶液，反 应持续6-12h，得到包裹了染料的纳米金溶液，称为反应液；b. 在磁力搅拌下加入氨水到a.得到的反应液中，调节溶液的pH值在10-11之间；c. 向b.得到的反应液中按纳米金与正硅酸乙酯的摩尔比为1:1-6加入正硅酸乙酯的乙醇 溶液，在磁力搅拌下反应12-24h，即可得到所述复合型硅壳结构的荧光纳米粒子；(2) 步骤(1)所得荧光纳米粒子的氨基化在磁力搅拌下，将复合型硅壳结构的荧光 纳米粒子和氨基丙基三甲氧基硅垸的乙醇溶液以摩尔比为100-500:1的比例反应12-24h，即 可得到氨基化的复合型硅壳结构的荧光纳米粒子；(3) 连接生物分子将氨基化的荧光纳米粒子与生物耦连剂以摩尔比为1-4:1的比例相 混合，按1.0-10.0 mg/ml的浓度再加入待连接的生物分子，在4'C下避光孵育6-12h;离心过 滤，并将标记上生物分子的荧光纳米粒子重新分散在pH 7.0-7.8的磷酸盐缓冲溶液中，即可 到连接上生物分子的荧光纳米探针，于4'C以下贮存。
5、 根据权利要求1所述的复合型硅壳结构的荧光纳米探针的制备方法，其特征在于所 述步骤(1)中，所述纳米金溶液的摩尔浓度为1.0x10—6-5.0xl0—6mOl/L;所述罗丹明染料溶液 的摩尔浓度为5.0xl0-6-1.0xl0-5mol/L;所述正硅酸乙酯的乙醇溶液的摩尔浓度为 1.0xl(T3-5.0xl(T3mol/L;所述纳米金的粒径为25±5 nm;所述复合型硅壳结构的荧光纳米粒子 的粒径为60±10nm。
6、 根据权利要求1所述的复合型硅壳结构的荧光纳米探针的制备方法，其特征在于所 述步骤(2)中，所述氨基丙基三甲氧基硅烷的乙醇溶液的摩尔浓度为1.0xl(T3-5.0xl(r3 mol/L， 所述生物耦连剂是乙基3-(3-二甲氨基)碳二亚胺盐酸盐，其摩尔浓度范围是0.1-1.0 mol/L。
7、 权利要求1所述复合型硅壳结构的荧光纳米探针在生物标记和生物检测领域的应用。
全文摘要
本发明公开了一种复合型硅壳结构的荧光纳米探针及其制备方法和应用，其特点是先制得复合型硅壳结构的荧光纳米粒子，再通过生物耦连剂使表面氨基化的荧光纳米粒子连接上生物分子，得到既有优异荧光特性又有生物活性，且分散性好、特异性强的生物功能化的荧光纳米探针，其能广泛地应用于生物标记和生物检测等领域。
文档编号G01N33/52GK101441211SQ20081022008
公开日2009年5月27日 申请日期2008年12月17日 优先权日2008年12月17日
发明者萌 徐, 朱新海, 杨培慧, 蔡怀鸿, 蔡继业 申请人:暨南大学