一种比率荧光纳米探针及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物医学检测和生化分析领域，具体公开了一种表面功能化的二氧化硅荧光纳米粒子用于细胞内外锌离子检测的新荧光探针；所述探针是将接枝氨基喹啉的树枝状聚乙烯亚胺衍生物共价连接在包埋联吡啶钌的二氧化硅荧光纳米粒子表面，利用比率荧光方法进行细胞内外锌离子的检测。该发明属于对锌离子荧光检测方法的改进，能最大限度地提高检测灵敏度。
【专利说明】一种比率荧光纳米探针及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学检测和生化分析领域，更具体地，涉及一种比率荧光纳米探针及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]锌离子是仅次于铁离子之后人体内第二多的过渡金属离子。其在生物过程中主要以二价阳离子的形式存在并且在整个生物体系中发挥着十分重要的作用。研究表明锌离子能够与一些特定的蛋白质结合，作为其结构的辅助因子和催化中心，发挥酶的作用，另外脑功能、基因转移、免疫功能、神经信号传导等生物过程都和锌离子相关。所以锌离子的检测已经成为生物分析的一个重要研究方向，快速灵敏的进行锌离子检测在临床上具有重要意义。
[0003]锌离子稳定的cT电子结构使得许多光谱分析和电化学方法均不适于锌离子的检测，于是荧光分析方法就成为了锌离子检测的最好选择。荧光检测方法具有操作便捷、灵敏度高等优点，已经成为生物体内外各种金属离子检测的一种有力手段。基于光诱导电子转移的喹啉衍生物，由于其PH不敏感，能够与金属配位，光稳定性好等优点被广泛的用于生物体内锌离子检测。然而，大多数喹啉类的荧光探针在锌离子检测过程中往往存在复杂的合成过程，水溶性差，细胞通透性差，检测灵敏度低等缺点，限制了其在生物分析中的应用。另外，传统单发射荧光检测 探针，往往易受检测环境、样品处理、仪器设备等因素的影响，其分析的精确性不易控制。
[0004]比率荧光测定方法是荧光分析中一个重要的方法，它利用荧光探针的物质响应荧光信号与自身内标荧光的比值来进行待测物的定量分析。这种检测策略以相同背景下测定的荧光强度的比值作为信号参数，能够极大的消除背景荧光对检测信号的干扰，从而提高检测的灵敏度。这种双发射的比率荧光探针对于细胞内物质的传感检测具有十分明显的优势，如能够校正细胞中细胞液粘度、离子效应、pH、光散射等因素对荧光信号的干扰，有效的提高检测的准确性。因此设计合成比率型荧光探针具有很好的应用前景。纳米技术的兴起也极大的推动了新型荧光探针的制备和发展，构建新型纳米荧光探针对Zn2+进行检测已经引起广泛关注。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是为了克服现有锌离子荧光检测方法中喹啉衍生物水溶性差，细胞通透性差，单发射检测方法易受到复杂基质背景干扰，灵敏度不高的缺陷，提供一种基于双发射的比率荧光检测方法。所述方法将接枝氨基喹啉的树枝状聚乙烯亚胺衍生物共价连接在包埋联吡啶钌的二氧化硅荧光纳米粒子表面，利用氨基喹啉与锌离子特异性识别反应产生的在波长500 nm处的荧光与二氧化硅荧光纳米粒子在波长600 nm处固定不变的荧光的比值进行锌离子的灵敏检测，极大提高检测灵敏度，并可用于细胞中锌离子的实时成像。[0006]本发明首先提供一种比率荧光纳米探针，包括包埋有联吡啶钌的二氧化硅荧光纳米粒子，和通过共价键与二氧化硅荧光纳米粒子连接的水溶性锌离子识别探针。
[0007]所述的水溶性锌离子识别探针是由氨基喹啉类衍生物与树枝状聚乙烯亚胺接枝形成。
[0008]所述的氨基喹啉类衍生物为8-氯乙酰基氨基喹啉。
[0009]根据需求再提供一种上述的比率荧光纳米探针的制备方法，包括以下步骤:
51.水溶性锌离子识别探针的合成:将氨基喹啉类衍生物、树枝状聚乙烯亚胺与无水碳酸钾混合，搅拌，进行接枝反应，加热在惰性气体保护下进行回流回收；
52.包埋联吡啶钌的二氧化硅荧光纳米粒子的制备；
53.比率荧光纳米探针的制备；将步骤SI所得的水溶性锌离子识别探针和步骤S2所得的二氧化硅荧光纳米粒子加入到磷酸缓冲液中，室温反应，即得。
[0010]S2中所述的包埋联吡啶钌的二氧化硅荧光纳米粒子的制备采用油包水的反相微乳法制备。
[0011]S3中所述的磷酸缓冲液含有N-羟基琥珀酰亚胺和(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙
基碳二亚胺盐酸盐。 [0012]根据以上材料，再提供一种锌离子荧光检测方法，使用上述的比率荧光纳米探针。
[0013]包括以下步骤:
S1.体液中锌离子的检测:将比率荧光纳米探针加入到离心管中，加入不同浓度的锌离子，再用磷酸缓冲液定容，孵育，在365 nm紫外灯下拍照，并用荧光分光光度计测定其在420-750 nm范围内的荧光光谱，激发波长为370 nm ；
SI1.细胞内的锌离子成像:分别用共聚焦显微镜观察不用外源锌粒子和用外源锌离子(50 μ M的ZnCl2)处理的细胞，记录绿色荧光通道和红色荧光通道荧光信号的改变和二者比值的变化考察荧光纳米探针对锌离子的响应。
[0014]本文所制备的比率荧光纳米探针具有一下特点和优势:
(I)氨基喹啉衍生物作为锌离子识别基团，被接枝在低分子量的树枝状的聚乙烯亚胺(PEI)上面，从而降低了其可能的细胞毒性，提高水分散性以及所制备探针的细胞渗透性。
[0015](2)将锌离子荧光探针接枝在二氧化硅荧光纳米粒子的表面，运用比率荧光的方法进行检测，这种检测方式能消除背景的干扰，提高检测的准确度，使荧光探针更加的稳定。
[0016](3)每个荧光纳米二氧化硅表面都有大量的锌离子识别单元，能够使信号放大，从而能够高效、灵敏地检测锌离子。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1.基于基于比率荧光纳米探针用于锌离子检测的原理图。
[0018]图2.比率荧光纳米探针对模拟体液中锌离子的响应荧光光谱及标准曲线。
[0019]图3.比率荧光纳米探针对人宫颈癌细胞内的锌离子成像图。
【具体实施方式】
[0020]下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、设备和方法为本【技术领域】常规市购的试剂、设备和常规使用的方法。
[0021]如图1所示，本发明首先通过化学方法合成了 8-氯乙酰基氨基喹啉，而后用树枝状聚乙烯亚胺的氨基取代8-氯乙酰基氨基喹啉的氯制备出水溶性锌离子识别探针(PE1-Q)，最后我们将这种水溶性的锌离子识别探针通过共价键连接在包埋联吡啶钌的二氧化硅荧光纳米粒子的表面，从而制得用于锌离子检测的新型比率荧光纳米探针。
[0022](1)8-氯乙酰基氨基喹啉的合成:首先准确称取288 mg 8_氨基喹啉于25 mL圆底烧瓶中，再向其中加入202 mg三乙胺以及10 mL 二氯甲烧，室温搅拌一段时间使体系混合均匀。然后在冰浴下将246 mg氯乙酰氯缓慢的滴加到反应体系中，40 min内滴完。最后将反应体系升至室温并使反应24 h。用薄层色谱检测反应完全后，用真空旋转蒸发除去溶剂得到粗产物。再将得到的粗产物用色谱柱(硅胶，PE/EA=3:1 )提纯，得到为浅白色固体，真空干燥箱40 °C干燥后备用。
[0023](2)聚乙烯亚胺-氨基喹啉衍生物(PEIQ)的合成:取50 mL的圆底烧瓶，向其中加入44 mg的8-氯乙酰基氨基喹啉及20 mL乙腈,待反应物溶解后，再加入500 mg的聚乙烯亚胺和38.4 mg的无水碳酸钾，搅拌一段时间后，加热使体系在氮气保护下回流8 h。薄层色谱用来检测体系反应程度，待原料反应完全，用旋转蒸发除去乙腈得到粗产物。再将得到的粗产物通过共沉淀除去未反应的杂质，纯化后得到黄色油状物，真空干燥后备用。
[0024](3)包埋联 吡啶钌的二氧化硅荧光纳米粒子的制备:向50 mL圆底烧瓶中加入7.5mL环己烷，1.77 mL TX-100,1.8 mL正己醇和340 μ L重蒸水。均匀搅拌20 min后，反应体系形成了油包水的微乳体系，然后再向混合物中缓慢滴加80 μ L 0.1 mo I/L联吡啶钌水合物以及100 μ L四甲氧基硅氧烷,反应30 min后,加入60μ L 28%氨水使硅氧烷水解。室温下反应24h以后，再加入50 UL四甲氧基硅氧烷和50 UL CTES，随后再在室温下反应24 h。待反应完成，向反应体系中加入20 mL丙酮破乳，接着超声，涡旋，8000 rmp离心。按照以上方法再用乙醇洗两次，水洗一次后，将得到的二氧化硅荧光纳米粒子分散于重蒸水中待用。
[0025](4)比率荧光纳米探针的制备:将0.1 g羧基化的二氧化硅荧光纳米粒子和0.05 gPEIQ加入到20 mL含5 mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和2 mM (1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的浓度为0.01 M的磷酸缓冲液中(pH = 7.4)。随后将反应体系置于室温下反应15 h。反应完成以后，用离心机除去未修饰的PEI衍生物及无机盐，将最终制备的比率荧光纳米探针分离出来，并依次用超纯水洗涤后，分散于PBS中，放置于4 V备用。
[0026]本发明利用在单一波长激发下，二氧化硅荧光纳米粒子(内标)在发射波长600 nm处的荧光强度和聚乙烯亚胺-喹啉衍生物与锌离子络合物发射的波长500 nm处荧光强度的比值作为检测信号来检测锌离子浓度，这种双发射的比率荧光探针能够消除背景信号的干扰，大大提高锌离子检测的灵敏度。本发明将其用于体外模拟体液中锌离子的检测，并用于细胞内锌离子的实时荧光成像。
[0027](I)模拟体液中锌离子的检测:比率荧光纳米探针用于在PBS中进行锌离子检测的过程:首先，取1.5 mL的离心管，向其中加入2.4 μ g的比率荧光纳米探针，然后再向反应体系中加入不同浓度的锌离子，最后用磷酸盐缓冲溶液定容到1.2 mL (使得锌离子的最终浓度为:0，1，2，4，6，10，15，20，30，50，100 μΜ)。然后混合体系在37 °C下孵育5 min后，在365 nm紫外灯下拍照，并用荧光分光光度计测定其在420-750 nm范围内的荧光光谱，激发波长为370 nm。[0028](2)细胞内的锌离子成像。
[0029]本发明以人宫颈癌细胞(HeLa细胞)作为细胞模型。用含有10%胎牛血清(FBS，Gibco)、100 U mL—1青霉素及100 μ g mL—1链霉素的H-DMEM培养基培养HeLa细胞，培养条件:37 °C，5% CO2，两天换液一次。细胞成像:将处在对数期的HeLa细胞接种于6孔的细胞培养皿中(每孔15个细胞)，当细胞覆盖率到达60-70%左右时，将比率荧光纳米探针悬浮液(10 yg mL—1)加入到6孔板中，37 °C下孵育3 h后，再向其中加入50 μ M氯化锌溶液，继续孵育半个小时，之后，弃去培养基，用PBS洗板两次后，将HeLa细胞放在激光共聚焦下观察成像效果。
[0030]如图2所示，当没有锌离子存在的情况下，只在波长600 nm附近看到了一个明显的荧光发射光谱。随着锌离子浓度的不断增大，在波长600 nm处的荧光强度基本保持不变，而在波长500 nm处的荧光强度持续增加，该比率荧光纳米探针的荧光比值(F5TO/F_)不断升高，而且在一定范围内荧光比值还与锌离子的浓度之间线性相关，这种比率荧光纳米探针检测到锌离子的浓度低至0.5 μ M，线性范围为1.0-20 μ M (R2=0.98)。与其他的喹啉基的分子探针或纳米传感器相比，这种比率荧光纳米探针具有更好的水溶性和更低的灵敏度。
[0031]利用荧光显微镜对细胞内锌离子荧光成像进行了研究，如图3所示，当该比率荧光纳米探针与HeLa细胞共同孵育3 h以后，从明场图像中我们看到细胞伸展良好，具有完整的细胞核和细胞膜结构，而在绿色荧光通道中我们几乎没有观察到荧光信号，这主要是由于HeLa细胞内的锌离子浓度过低，相反通过红色荧光通道我们观察到了很强的荧光信号，这是二氧化硅荧光纳米粒子本身的荧光信号。通过荧光通道和明场通道的叠加图片，我们观察到荧光信号定位于细胞核周围的细胞质中的，显示出纳米探针具有优异的膜渗透性和小的细胞毒性。当细胞用外源性锌粒子处理(50 μ M的ZnCl2)之后，相比于不经处理的细胞图片，绿色荧光通道显示出非常强的荧光发射，而红色通道荧光基本没有变化，从明场和荧光通道的叠加图像可以看出荧光纳米探针的的荧光发射颜色从红色变成绿色，在HeLa细胞中呈现出黄绿色，这是由于红光与绿光叠加为黄光的缘故，这与在水溶液中观察到的荧光光谱非常一致，这种变化通过观察分离的检测通道更加明显。实验结果表明这种新颖的比率荧光纳米探针显示出细胞内锌离子检测的能力，能够进行双发射的细胞成像检测。
【权利要求】
1.一种比率荧光纳米探针，其特征在于，包括包埋有联吡啶钌的二氧化硅荧光纳米粒子，和通过共价键与二氧化硅荧光纳米粒子连接的水溶性锌离子识别探针。
2.根据权利要求1所述的比率荧光纳米探针，其特征在于，所述的水溶性锌离子识别探针是由氨基喹啉类衍生物与树枝状聚乙烯亚胺接枝形成。
3.根据权利要求2所述的比率荧光纳米探针，其特征在于，氨基喹啉类衍生物为8-氯乙酰基氨基喹啉。
4.一种根据权利要求1所述的比率荧光纳米探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 51.水溶性锌离子识别探针的合成:将氨基喹啉类衍生物、树枝状聚乙烯亚胺与无水碳酸钾混合，搅拌，进行接枝反应，加热在惰性气体保护下进行回流回收； 52.包埋联吡啶钌的二氧化硅荧光纳米粒子的制备； 53.比率荧光纳米探针的制备；将步骤SI所得的水溶性锌离子识别探针和步骤S2所得的二氧化硅荧光纳米粒子加入到磷酸缓冲液中，室温反应，即得。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，S2中所述的包埋联吡啶钌的二氧化硅荧光纳米粒子的制备采用油包水的反相微乳法制备。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，S3中所述的磷酸缓冲液含有N-羟基琥珀酰亚胺和(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。
7.一种锌离子荧光检测方法，其特征在于，使用如权利要求1所述的比率荧光纳米探针。
8.根据权利要求7所述的锌离子荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤: S1.体液中锌离子的检测:将比率荧光纳米探针加入到离心管中，加入不同浓度的锌离子，再用磷酸缓冲液定容，孵育，在365nm紫外灯下拍照，并用荧光分光光度计测定其在420-750 nm范围内的荧光光谱，激发波长为370 nm ； SI1.细胞内的锌离子成像:分别用共聚焦显微镜观察不用外源锌离子和用外源锌离子处理的细胞，记录绿色荧光通道和红色荧光通道荧光信号的改变和二者比值的变化考察突光纳米探针对锌离子的响应。
【文档编号】C09K11/06GK104031634SQ201410217964
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年5月22日 优先权日:2014年5月22日
【发明者】易长青, 时宇鹏, 陈志华, 程鑫, 潘益, 张恒, 张肇敏 申请人:中山大学