全血检测的制作方法

专利名称：：全血检测的制作方法
技术领域：
：本发明涉M全血样品中的物质进行检测的方法。
背景技术：
：英国专利申请0606450.5描述了通过荧光猝，糖化蛋白进行检测，在荧光检测中m区分归因于内在过滤作用糊印寸间依赖性改变和由分析化学物质弓胞的时间性改变，使用一种方法和设备测定非萤光物质(例如，血红蛋白)的浓度(测定血红蛋白-Alc)。这种方法避免了进行分另啲光度观i淀和其它测定的要求，从而简化了检湖仿法和相关仪器。本发明是这种方法用于领懂其它物质的一种改进，不需要使用荧光计，通过持续地监测和JOT逐渐形成的信号(例如，透射率)，不仅测量正在进行反应的物质，而且测量和补偿加入样品的初始量。现有技术包括对一系列物质进行检测，通过特定的反应化学试齐鹏时间的光度变化，例如，通过应用一种对被分析物有特异性的涂覆在微细的乳，粒上的抗体，测量增强的浊度，该增强的浊度是随着被分析物/抗原和抗体之间的反程被测量的被分析物{，乳胶微粒的聚集时产生的。可以使用常规的光度计和使用与光度测量相关的科学原理实现这种对增强的浊度的测量。然后将这种浓度依赖性浊度与现有技术已确定的标准产生的浊度相比较。其它适宜的方纟跑括在溶液中进行一系列的酶联反应，其中，全血样品中的血浆成分中的被分析物通过酶促反应而改变，最终由无色的反应物生成有颜色的染料。该颜色是以时间依赖性的方式产生的，并由光度计进行监测。这种对颜色变化的测量也可以通过使用常规的光度计和使用与光度测量相关的科学原理实现。然后将这种浓度依赖性透射率变化与由标准产生的邀寸率相比较，标准的测定方法也已在现有技术中确定。在分析血浆成分中存在的物质时，必须考虑全血样品中的可变量。这就是血细胞比容(haematocrit)或血红细胞在全血样品中的体积百分比，这个值可以广泛地随年龄、气候、营养和疾病状况以及其它因素而改变。例如，40%的血细胞比容是指在一定体积的全血中，40%的体积由血红细胞占据，60%是血桨。当患者血液的血细胞比容的上升时，方i(A检观蝶置中的固定体积的样品中的血浆的体积M^,反之亦然。由于正浆成分唯一地含有待观糧的被分析物，因而加入至仮应混合物中的血浆成分的体积越少，反应混合物中得到的被测量的物质的浓度越低，测得的〈繊小，反之亦然。弓胞全血中的血浆物质浓縮的任何分析方法都必须进行血细胞比容变化的校正，以得到正确的血浆浓度。正是由于这个原因，这种检测通常是使用预先M:过滤或者离心与血红细胞分离的血清或血^3S行的。就护理、医务室或诊所而言，可以通皿滤或其它机作将小体积的全血样品中的血浆成分分离，这会增加系统设计的复杂性，从而增加成本。在这种情况下，测量两种物质可能是最有用的，一种是待研究的被分析物，另一种是被当作标记的物质，通过该物质对样品的血细胞比容进行测定或标准化。已知的是，在血红细胞溶解后，全血的血红蛋白浓度与该全血样品中的血红细胞的体积直接成比例。如上BM，可以通过已知的方法用光度计在各种波长或通过各种反应化学试剂(即，浊度或酶催化生色)评估血红蛋白的浓度。在最初进行了必需的空白测量后，在分析化学试剂(生色或产生浊度)和血红细胞中均可以通过使用英国专利申请0606450.5描述的运算法则测量的可见光谱的一个点，评估初始的透射率，从而i啊古被分析物反应化学过程之前的血红细胞浓度(因为这个结果是瞬时的，而且不依赖于樹可化学反应)。也使用同样的运算法则对最终的透射率进行测量，该最终的邀t率通过微分分析表示时间依赖性经受在研究中被分析物的化学反应。计算这两种评估值之间的关系的运算法则可以用于获得不受血细胞比容的变化影响的血浆值。
发明内容本发明的第一个方面提供了一种对全血样品中的物质进行检测的方法，该方法包括(a)在溶液中使全血样品中的被分析物与特定的试剂发生反应，所述样品与所述试剂混合的时间为V,(b)在反应进行时，以适当的波长连续地监所述溶液的透射率；(C)由检观啲邀寸率的值记^gl寸率，T,鹏为加入样品前反应溶液的謝率；计算To和L，To为加入样品后在时间to时的邀才率，L为在时间tj寸的邈寸率，此时全部的所述被分析物均已与所述试剂反应，或者己经达到平衡；(d)由T,^口To的值计算加入血液后的样品的光密度，并由此定量加入到所述样品中的血红蛋白；(e)由To和T①的值计算由步骤(a)中的反应弓胞的透射率的变化；以及(f)由这些测量值之间的关系得至,品中被分析物的浓度，该浓度是经过了血细胞比容变化校正的。本发明的一个目前主要用途是检测全血中的血浆被分析物。下面描述了两个实施例以说明以下观糧方法中所应用的原理通过免疫比浊的方法测量被分析物，例如，C-反应蛋白(CRP)，或者通过由一系列酶促连锁反应以生成有色终点测量不同的被分析物，例如，胆固醇。在免疫比浊法的实施例中，地，使抗CRP的抗体与在抗体和被分析物之间发生反应时能够聚集的颗粒结合，例如，乳胶珠。在酶促系列连锁反应中，，地，关键的酶为对待测量的物质具有特异性(例如，胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶)。由步骤(f)中To和T①的测量值得到的关系im地使用如下形式的运算法则获得y=ax2+bx+c其中，a、b和c为校准常数，y为被分析物化学物的测量值，例如，由log[(To-丁00)/丁0]计算得出，x为血红蛋白的测量值，例如，由log[(T鹏—To)/T鹏]计算得出。在全自动化的设备系统中，将血液加入到试剂中，并通过该设备进行混合，在化学反行中可以测得的最初的透射率可以在加入血液并混合后约5秒内测定。但是，在非自动化的系统中，由于需要操作员手动向含有试齐啲反应比色皿中加入血液样品，然后混合并将该反应比色皿转移到光度计中，从而更加延迟了初始的结合反应的监测。因此，无论是在手动系统还是自动系统中，都不能直接测得加入血液样品后即刻的to点的实际透射率值。为了克服这点，在时间to点的邀寸率T()(g卩，加入样品后的即刻，而在反应发生之前)iM地基于化学结合反应的速率平衡，通过将时间过程中的SJ"率数据的拟合曲线反向外推得到。地，这包括将测得的31M率数据对时间作图，对作图点做出最佳的拟合曲线。作图可以是物理的，或者甚至是手动的，但是一般通过拟合与数据最佳匹配的数学函数并将该函数外推至时间为化和U，而自动地数学地实现，而不生戯p样的曲线图。可以通过任何适当的数学方法实m0f述曲线拟合，在本说明书的后面部分将描述实施例方法。使用这样的方式，用记录的数据将变化最小化，然后将曲线外推以得出To的值。此外，通过将该拟合曲线正向外推到数据采集区域以外，也可以确定反应终点too点的iSM率水平TTO。已经发现用这种方法确定化和"点的透射率水平能得到可靠而准确的结果。测量反应混合物的激t率的时间区间可以为适于进行检观啲任意区间。时间长则精确度高，但检测过程慢；而时间短则方便，但是由于用于外推的数据的量变得稀疏会导致结果的精确衝氐。测量时间的适宜长度取决于被分析的物质及其与抗体反应的时间特性。关于使用易得的试剂的CRP免疫比浊测试和,旦固醇测试，测量时间一般以约3併中为宜。也可以通过由少量数据的结果外推，并在反应过程中不断校验该夕滩的准确度来縮短时间长度。如果由初期外推(即，短时间，例如，20-30秒)得到的数据被持续的记录观测证实，贝何以由少量数据在短时间内使用最初的外推可靠地预知终点和起点结果。,地，在步骤(a)中，在将样品与抗体试剂混合前，通过照射适当波长、(即，邀寸测量可以检测到血红蛋白以及由抗^4皮分析物反应而产生的浊度和,连锁反应产生的颜色)的入射电磁辐射将该溶液對虫地激发，在选定的波长频率下检测得到的初始透射率(T)。将该值与TQ的值结合可以用于计算零光学密度(ZOD)，使用如下公式zoD=:Log[T/r0]已知ZOD直接与总的血红蛋白浓度成比例。因此，测定初始3fl寸率可以用于确定总的血红蛋白浓度，总的血红蛋白浓度则可以用于确定血红细胞的体积。可能在每次检测前不是必需确定T術因为该值可以是标准值或常数，这取决于反应比色皿的再现性和所使用的试剂。本领技术人员可以对本文中所述的本发明的方法和仪器进行许多更改，而这些都属于本发明的范围。然而本发明的基本原理是一方面由一种物质的特异性反应使得测得的物理参数(可以是它的荧光值、透射率或其它物理性质，例如，浊度)以时间依赖性的方式变化，而另一方面由另一种物质使得观幌的物理参数瞬时地为非时间性的方式变化；一种物质为待测量的目标被分析物，另一种物质为标记物，通过该标记物，样品的加入量或特性的变化得到补偿。但是，为了更好地理解本发明的原理，，参照检测全血中的胆固醇的实施例以及合适的附图对本发明进行详细的描述，但这仅仅通过实施例说明。图1为在测定初始空白后由于样品自身的存在而弓l起的光学密度(OD)初始增大(或邀寸率下降)之后，随着反应时间的推移，由于特异性化学反应导致的OD增大的反应的整特性图2为表示由透射率的初始下降(即在时间零)而得到的510nm点的零光学密度(ZOD)和加入的血红蛋白(通过改变血细胞比容7K平而固定样品的体积)的量的关系的曲线图3为在含有样品胆固醇的溶液中以及将无色的前体变为有色染料的一系列酶联反应中色度响应的产生过程中透射信号随时间变化的图4表示在血液存在下，溶液中不同浓度的胆固醇与一系列胆固醇特异性酶联反应物之间的反应过程中透射率随时间过程降低的复合图5表示低标准血液样品(2.2醒ol/L)和高标准血液样品(8.1腿ol/L)的5光学密度(DOD)和零光学密度(ZOD)之间的关系，S光学密度(DOD)为化学反应的ODo和OOo之间的差值，零光学密度(ZOD)为血红蛋白的测量值(从而得到血细胞比容)；以及图6表示由运算法贝诉口化学反应方法得至啲胆固醇值随着样品血细胞比容而变化，适用于涵盖检测工作范围的三种标准。具体实施例方式本发明可以用于检测全血中的胆固醇。在这种方法中，将溶解在适当的缓冲液中的进行一系列酶联反应的成分加入到比色皿中。在加入血液试样之前，在光度计中用适当波长(510nm)的电磁辐射将该试剂混合物激发，并测量,率空白(T初始)。将该比色皿从光度计中取出或留在那里，立即加AlfiL液样品并混合，检测并记录一段时间过程的透射率。将这些数据作图，对该数据集拟合曲线。图3表示了这样的反应时间特性，其中，在加入样品前零秒时记录初始翻率T嫩，标记为A。从手动系统中再次加入比色皿开始或者在自动系统中混合之后直到经过适当长的时间，记录反应的实际实自寸率数据随时间(通常以小于1秒的间隔)的变化。通过反向外推，确定to点的3tlt率水平Te，to点即样品加入但是还未与目标被分析物发生反应的时刻(B)。通过正向外推(由于测量数据的终点位于图3的曲线之外，所以正向夕卜推未在图中表示)，同样地确定反应终点too的M寸率水平Too,在反应终点，与目标被分析物的反应已经完成。在被证明在To和TJ勺外推判断中有效的许多潜在的曲线拟合禾骄中，雜的曲线拟合禾，是基于如下的普适速率方程H+(L-To)x(l画e,其中，H秒时的透射率Tf零时刻的透射率T^^时间无穷大时的邀t率(即，在反应终点)e=2.7813(自然对数底)e,率常数通过反复地将每个数据点的拟合值与测量值之间的差异的平方和(sumofHiesquaredvatiances)最小化确定To、T^和0。艮P，通过拟合禾聘使Z(TV顿-Tt—)2最小化。可以通过其它的曲线拟合方法得到该数据的数学模型，这些方法在实际过程中同样可以使用。实施例将已知体积(例如，2.0ml)的含有缓冲齐诉口酶与用于酶联反应(如下所示)的反应物的混合物的试剂加入到反应比色皿中。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>将该混合物加入到光度计中，并在510nm下激发。以<1秒的时间间隔读取空白率，约读取5秒。然后，在to时间点，将已知其血浆胆固醇水平的固定体积(5|iL)的血液加入到该比色皿中并混合。当混合结束时在510nm测量邀寸率，测量3射中反应时间。产生混合并使液体中的旋涡停ih^用的时间意指从加入血液样品起的第10秒后开始才记录的邀f率。下面的表1列出了空白和血液的透射率信号和参照的读数的实例。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>这样，则可以由实验得到的dod未^nzod細的值计算未知样品的血浆中胆固醇的浓度；1、由样品的ZOD计算高标准(H)的DODDOD高=a.ZOD2+b.ZOD+c2、由样品的ZOD计算低标准(L)的DODDOD低=a，.ZOD2+b，.ZOD+c，3、通过如下表达式计算未知样品的血浆胆固醇{[DOD糊-DOD低]/[DOD高-DOD低]x[H-L]}+L这种以补偿在血红细胞存在下胆固醇值的方法的效用得到了反算用于高和低标准胆固醇值的证实，也得到了高和低标准之间的约中间范围的例子的证实。(表2;5、6和7栏，以及图6)这表明得至啲值基本上不受样品血细胞比容的影响。权利要求1、一种对全血样品中的物质进行检测的方法，该方法包括(a)在溶液中使全血样品中的被分析物与特定的试剂发生反应，所述样品与所述试剂混合的时间为t0；(b)在反应进行时，以适当的波长连续地监测所述溶液的透射率；(c)通过检测的透射率的值记录透射率，T初始为加入样品前反应溶液的透射率；计算T0和T∞，T0为加入样品后在时间t0时的透射率，T∞为在时间t∞时的透射率，此时全部的所述被分析物均已与所述试剂反应，或者已经达到平衡；(d)由T初始和T0的值计算加入血液后的样品的光密度，并由此定量加入到所述样品中的血红蛋白；(e)由T0和T∞的值计算由步骤(a)中的反应引起的透射率的变化；以及(f)由这些测量值之间的关系得到所述样品中被分析物的浓度，该浓度是通过血细胞比容变化校正的。2、根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(a)中的反应为免疫比浊性的。3、根据权利要求2所述的方法，其中，所述试齐抱括对与微粒结合的被分析物有特异性的抗体。4、根据权利要求3所述的方法，其中，所述微粒为乳胶珠。5、根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中，所述被分析物为C-反应蛋白。6、根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(a)中的反应为比色性的。7、根据权利要求6所述的方法，其中，所述试剂包括酶，该酶能够生成驱动一系列连锁反应以生成有色的终点的酶。8、根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述被分析物为胆固醇。9、根据权利要求6-8中任意一项所述的方法，其中，所述试剂包括胆固醇氧化,口胆固醇酯酶中的一种或两种。10、根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中，所述步骤(f)中的运算法则的形式为y=ax2+bx+c，其中，a、b和c为校准常数，y为由log[(To-Too)/To]计算出的被分析物化学物质的测量值，x为由log[(T搬-To)/T舰]计算出的血红蛋白的测量值。11、根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中，根据该反应的速率平衡，通过将时间对透射率数据的曲线拟合反向外推确定T。。12、根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中，通过将该曲线拟合正向外推超出数据采集期间确定Too。13、根据权利要求11或12所述的方法，其中，所述外推包括将测得的邀寸率籠相对于时间作图，然后对所做的点做出最佳拟合曲线。14、根据权利要求13所述的方法，其中，通过拟合与数据最佳匹配的曲线的数学函数，并将该函数外推到时间为to和U而得到所述图。15、根据前述任意一项权利要求戶腐的方法，其中，记录透射率数据的期间长达3她16、根据前述任意一项权利要求所述的方法，其中，步骤(a)中在将戶;M样品与所述试剂混合前，用波长为、的入射电磁辐射单独激发样品，其中，波长、可以检测血红蛋白和所述反应，并且在选定的波长频率下检测产生的初始透射率T娜。17、根据权利要求16所述的方法，其中，使用方程式ZOD-Log[T^/To]，可以将T鹏与To的值结合计算零光学密度(ZOD)。全文摘要一种评估全血样品的血浆成分中的目标物质(例如，胆固醇或CRP)的浓度的方法和设备，该方法不需要在检测前将血红细胞与血浆分离，从而简化了检测仪器的设计和构造。本发明通过测量在时间依赖性(生物-/免疫-)化学反应中的待研究的被分析物，并分别测量用于评估血红细胞体积的标记物质(例如，血红蛋白)和使用对样品的加入具有固有过滤效应的反应混合物的物理性质的非时间依赖性改变(此时，为透射率)，而实现本发明。这种非时间依赖性改变不是化学反应的一部分，而是通过连续测量和数学建模由检测化学试剂引起的时间依赖性物理性质变化所得到的。使用将这两个参数结合起来的运算法则计算目标物质，并且补偿样品的百分比血细胞比容的变化。本方法补偿了患者样品中的细微变化(例如，血细胞比容)的检测响应。文档编号G01N33/49GK101680876SQ200880015805公开日2010年3月24日申请日期2008年3月20日优先权日2007年3月22日发明者大卫·皮尔斯沃,安德利安·理查德·格雷,约翰·菲利普·瓦塞申请人:商诊疗有限公司