血样本的化验方法
【专利摘要】本发明提供一种测量含有血细胞样品的血浆部分中一种或多种被分析物质的酶方法，包括第一组分和第二组分，如果第二组分存在并且未被封闭，第二组分则会干扰第一组分的测量。所述的方法包括如下步骤：i)让试剂混合物稀释样品；ii)实质去除血细胞；iii)让样品与至少一种试剂接触，该试剂暂时阻止第二组分的反应，从而产生被封闭的第二组分；iv)对所述的或每个被分析物质的成分进行选择性地反应而直接或间接产生可检测的反应产物，其中所述的该或者一个被分析物质为所述的第一种组分；v)监测所述可检测的反应产物或多个产物；vi)把所述的可检测的产物或多个产物的量和/或形成所述的可检测的产物或多个产物的速率与所述的或每一个血液样品中的至少一个被分析物的浓度进行关联；其中，通过估计的不可测量(虚构的)的终点把至少一种所述的第一组分的浓度与相应的可被检测的产物进行关联；其中，步骤iii)可以再任何阶段并且包括步骤iv)中进行，但是在步骤v)或vi)前进行，和，其中，步骤iii)中的试剂可以单独施加在样品中或被包含在步骤i)或iv)中的至少一种试剂的混合物中。相应的试剂盒也被提供。
【专利说明】血样本的化验方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及含有细胞的血样本，例如全血样本中，多种成分的测量，例如脂类成分的测量。特别的，本发明涉及血浆中脂类成分的测量，例如与特异的脂蛋白种类相关的胆固醇和甘油三酯的测量，特别是通过酶化验的方式进行测量。最特别的，本发明发涉及在“床边”设备中进行的自动化方法在诸如诊断、预后和风险分析化验中的用途。
【背景技术】
[0002]体液样本中多种成分的测量是临床评估的普通特点。从体液样本中特异被分析物质的浓度，或从几种组分浓度分布，可以做出很多诊断或确诊，说明疾病的状态或进度，或者很多状况风险都可以被评估。疾病状态和一种或多种被分析物浓度之间已知相关性的增加，使得这种对样品中一种和多种被分析物的分析变成一种越发有价值的工具。因此为了越来越快的分析越来越多样品，这相应的对临床实验室增加了压力。为了满足这个(需求)，这就需要更快、更高的生产量，更简单和/或更全自动的化验。
[0003]在“床边”中开展化验的需求一直在增长。不间断转移慢性疾病到初级保健的需求正在增加。这对患者是有益的，患者可以获得即时的建议并且留下更少的不确定性。这也显示了“病人旁边”的检测提高了患者的依从性，坚持治疗和治疗控制(Price.(2001)BMJ332:1285-8)。这也对医疗实践者有益，他们能潜在的避免为了多种预约的需要并能更加确定她的判断。
[0004]依照操作简单和结果快速的要求，床边化验有特殊的需求。如果化验需要花费不只是那么几分钟，那床边操作的优势就不复存在。而且，虽然操作这些化验的全体员工可能是医疗保健专家，但是他们并不是分析专家，而且并不能使用多种仪器。因此有必要设计这样的依靠最小量样品处理的化验。出于这个原因，出于时间，人力资源和成本的原因，通常在单个检测设备，单台分析仪器，用单个样品的单次操作确定多种不同被分析物的水平是非常有优势。这避免了对样品的扩展操作，多种检测设备或多种分析仪器的昂贵的耗时的需求。
[0005]因此有必要设计这样的依靠最小量样品处理的化验。出于这个原因，出于时间，人力资源和成本的原因，通常在单个检测设备，单台分析仪器，用单个样品的单次操作确定多种不同被分析物的水平是非常有优势。这避免了用于延伸的样品操作，多种检测设备或多种分析仪器的昂贵的耗时的需求。
[0006]床边方法的一个特别的问题是它们很少能容纳校准。这与以酶为基础的化验方法的特殊性有关，因为在存贮过程中酶本身的敏感性可能会失活。
[0007]避免未知酶活性的常用方法是确定酶反应的终点。形成终产物的数量将仅依赖于开始反应时存在的被分析物数量，提供了足够的试剂来转化所有被分析物为产物，并提供了全部转化所需的充足的时间。只要有足够活力的酶来催化反应，酶的活力将仅决定反应速率而不是终点。然而，这个方法需要不仅大量的酶，这增加成本和/或需要充分长的化验时间，这增加了总的化验时间。特别涉及到床边化验，通常应在5-10分钟完成。[0008]需要特别关心的是不产生可测定终点的酶反应。这样的情况包括连锁反应即之前的反应达到终点前下一次反应开始了或发生平行反应。类似的，一个组分在存在第二被封闭组分的情况下起反应，该第二组分在不存在“封闭”时也将反应，因此终点仅在封闭是“永久”的时候达到，例如通过共价反应。然而很多封闭试剂只有暂时的效果，如果在需要达到终点的时候第二组分变为任何程度的“不可封闭”，那么不能达到第一组分的反应终点。
[0009]典型样品用来测定特殊脂蛋白的脂质组分，如，高密度脂蛋白结合的胆固醇。脂蛋白组分的封闭通常是暂时的，可变类型的封闭。这很难或不可能进行传统的终点化验，并且一定会用到其他方法例如基于定点测定的化验。这些情况是率相关性的因此需要或者充分稳定的试剂(通常为干试剂)，或者包含校准剂，允许对长期试剂衰退的补偿。干试剂的缺点是它们在重建时容易出错，常常需要延长重建试剂，在干燥过程中容易损失活性，特别是在用装置干燥试剂的情况下，增加产品的成本。校准剂经常不能与床边化验兼容。
[0010]脂蛋白的结构一般由脂质组分和蛋白组分被紧密束缚成一个不可接近的团块。因此酶反应一般不影响那些与脂蛋白紧紧结合的脂质组分，或会影响但影响的速率很慢。用于脂蛋白中的脂质的酶反应试剂混合物一般也包含一些试剂，如表面活性剂，其有助于脂蛋白“解锁”并暴露出脂质组分给反应的酶(多个酶)。脂蛋白组分的“封闭”通常是让靠近表面活性剂的组分更稳定，因此“封闭”的组分对酶反应不起作用。然而，随着时间的过去，在反应混合物中的酶和/或表面活性剂普遍将开始导致一些封闭的脂蛋白组分的降解。
[0011]因此，在试剂的作用下开始打开脂蛋白的结构时，这引起了灾难性的影响，然后变得更有反应活性，然后脂蛋白更加开放，等等。相应的，在快速地和越来越快的失去它的“封闭”而引起重大干扰前，“封闭”的脂质组分可以被用来在反应中担当不可测量的部分从而耗费一些时间(例如几百秒)。这样短暂的封闭不能用于终点反应，因为封闭将会在终点达到前损坏，因此结果将不能代表期望的组分的结果。
[0012]已知值得注意的是，想要测定的组分包括特定类型脂质总量的较小的部分(如在典型的健康患者中小于总数的30% )，因此当剩余的(脂质)被“封闭”，这就特别重要，在封闭执行化验，这个化验就变为非常的不可行。这是因为大量组分中的较小部分未封闭，在分析更小的组分时，将会对结果产生重大的影响。
[0013]由上面可知，当前床边诊断设备不能利用多种流体试剂，因为它们不能包括校准齐U，这些设备也不能使用终点分析，这是因为终点是不能达到或不可测量。因此，对这些仪器厂家可用的仅有途径就是使用稳定的试剂，特别是干的形式的试剂。然而这也有它自身的劣势。不仅干试剂更加昂贵而且它们的复原(在变成流体溶液)即费时间也可能不可靠。用这种干试剂的机器倾向于产生比预期更高比例的异常结果，大概由于酶试剂完全复原的偶然失败而造成的。让具有不可测量的终点的反应在不存在校准剂的情况下与试剂溶液一起变为确实可用的方法，那么这样的方法有非常大的价值。
[0014]用于化验的最常用的临床样品为流体，特别是血液和尿液，因为这些相对容易采集和操作。在血液中，一般分析流体血浆中的成分。对源自血液的样品做的某些最常见和临床重要测量与血浆中的脂质成分有关。存在血液血浆中的主要脂质是磷脂质(PL)，甘油三脂(TG)，和胆固醇(CH)。这些TG和CH是特别的诊断兴趣点，因为它们与心血管疾病有关，反过来心血管疾病是发达世界最重要的流行疾病之一。
[0015]脂质依据它们的本质是水不溶性的，在血液中，与载脂蛋白(apolipoprotein)形成可溶的复合物被转运。这些复合物，基于它们的大小和脂质-蛋白之间的比例，脂蛋白被分成5个群组:乳糜微粒，极(非常)低密度脂蛋白(VLDL)，中等密度脂蛋白(IDL)，低密度脂蛋白(LDL)，和高密度脂蛋白(HDL)。乳糜微粒基本上是脂肪粒，约90%的由TG组成。乳糜微粒的功能如同车辆用来从回肠运输饮食的脂质到脂肪组织和肝脏，并在饭后的普通的循环中仅存在较短的时间。
[0016]这些剩下的4类脂蛋白在肝脏中产生。而VLDL，IDL和LDL负责从肝脏到组织的脂质运输；为了促进肝胆的分泌物，第五类HDL从事从外围组织的多余脂质反向运输到肝脏。VLDL和IDL具有短的半衰期(half-lives)并递送主要的TG到组织。LDL和HDL具有更长的半衰期(half-lives)，主要参与血液中的胆固醇平衡。LDL和HDL组合可以平均携带血液中约95%的胆固醇，LDL携带约70%，HDL约25%。
[0017]在脂蛋白中有5种不同类型的蛋白:载脂蛋白(Apo)A, B, C，D和E，每一种类型都可以进一步细分。载脂蛋白对于脂蛋白的形成、分泌、运输，以及在外围组织中作用在脂蛋白上的酶活性，都是很重要的。载脂蛋白B(ApoB)是在VLDL，IDL和LDL中的主要蛋白；在0^中，是仅有的唯一蛋白。当HDL缺乏载脂蛋白B(apoB)，其主要蛋白就是载脂蛋白 _A1(apo-Al)。
[0018]高浓度的TG与不同的病理生理学失调有关，例如糖尿病，心血管疾病，高血脂症，高甘油三脂血症类型I和IV，和肾炎综合症。在肝脏感染和营养失调症中发现低浓度TG。
[0019]从许多流行病的研究中可以充分确定与乳糜微粒，VLDL，IDL结合的CH心血管疾病(CVD)的主要风险因子，CH浓度的增加与CVD风险的增加相关。与LDL颗粒结合的CH被认为是主要风险因子，目前为止是这些组分中最大的。另一方面与HDL结合的CH反过来与心血管疾病的风险有关。HDL浓度越低，疾病风险越高。因此通常惯例是确定与LDL和/或HDL结合的CH，一般连同总的CH来诊断和预测心血管疾病，以及制定CVD风险的方案，这也可能与其他因子结合。
[0020]当前常规使用两种方法定量检测CH。两种方法都是酶方法。第一种方法利用以胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶起始的酶链反应，通过产生过氧化氢来产生颜色或荧光信号。另一个方法用胆固醇脱氢酶替换胆固醇氧化酶的位置，根据产生NADH或NADPH的数量确定样品中CH的数量。这些方法依赖至少部分在反应能有效的进行前，胆固醇从脂蛋白携带者上至少部分被释放。本领域公知的，表面活性剂具有这个功能。 [0021]与CH结合的HDL可以从非HLD的脂蛋白上分离这类脂蛋白来确定，分离的方法要么用物理的方法要么通过封闭。使得非HDL不可用时，与CH结合的HDL用总的CH酶促方法来测定。然而这个反应不能运行到终点，因为已知的封闭方法是暂时的，并且在终点达到前会变得分开。例外的情况就是是非HDL能被物理的分离，但这需要床边设备无法获得的离心技术。
[0022]起初使用的，现在仍有很多使用，通过以下列出的一种方法来沉淀非HDL。
[0023](i)肝憐脂或肝素 /Mg2+(Hainline A et al (1982) Manual of laboratoryoperations, lipid andlipoprotein analysis, 2nd ed.Bethesdaj MD:US department ofHealth and Human Services,1982:151pp),
[0024](ii)憐鹤酸盐-Mg2+(Lopes_Virella MF et (Lopes-Virella MF et al (1977) ClinChem23:882-4)，al (1977)Cl in Chem23:882-4)，[0025](iii)聚乙二醇(PEG) (Viikari J, (1976) Scan J Clin Lab Invest35:265-8)和
[0026](iv 葡聚糖硫酸酯)_Mg2+(Finley et al (1978) Clin Chem24:931-3).[0027]然后通过离心去除非HDL沉淀。后者的方法仍被胆固醇参考方法实验室网络(CholesterolReference Method Laboratory Network)作为测定与 CH 结合的 HDL 的推荐
参考方法。
[0028]其他用于分离的方法是通过电泳(Conlin D et al (1979) 25:1965-9)或色谱法(Usui et al(2000)Cl in Chem46:63-72)。
[0029]上述的方法是有效的，但需要冗长的分离步骤和很多实验仪器。为了剔除费力的样品预处理，2个不同的途径可以被采用。开发的床边设备已把HDL的分离和定量整合入检测装置中，该检测可以是盒式的或试剂浸溃试纸条，例如雀利技术(Cholestech)的HDL化验装置和方法(US5213965)。
[0030]为了自动化临床仪器，同类方法被开发，即不需要物理分离非HDL脂蛋白来测定与CH部分结合的HDL。非HDL颗粒通过不同方法被封闭，使得其不能接近CH产生代谢的酶。最近的新发现是高特异性的表面活性剂能选择性解HDL。在这种情况下，高效“封闭”非HDL的HDL反应混合物仅包括表面活性剂，该表面活性剂使非HDL脂质处于脂蛋白形式中，然后大部分是酶反应不能接近的。
[0031]与胆固醇结合的LDL通常用弗里德瓦尔德(Friedewald)方程式计算来确定(Friedewald WTet al(19 72)Clin Cheml8:499-501):LDL=总的 CH- (HDL+TG/2)
[0032]虽然这个方法实用并在大多数情况下十分精确，但其有众所周知的局限性，特别需要患者在抽血前禁食(禁食来耗尽血液中的乳糜微粒(chylomicrons))并需要TG水平低于4克/升。因此国家卫生研究所(NIH)发起的美国国家胆固醇教育计划(NCEP)成人治疗小组III (ATPIII)指南已经建议直接测定与CH结合的LDL，而不是从与CH和TG结合的HDL中计算总的CH。然而最近的报道质疑直接测定的LDL水平比计算的LDL水平的所有临床优势(Mora et al (2009) Clin Chem55:888-94)。
[0033]本来，与CH结合的LDL通过超速离心来测定(Havel RJ et al, J ClinInvestl955 ；34:1345-53)。这仍是最常使用的参考方法，但显然需要样品预处理。后来开发出了同类方法不需要非LDL脂蛋白的物理分离就可以测定CH部分的LDL(US5888827, US5925534)。
[0034]与CH结合的VLDL最初用超速离心测定。这仍旧是优选的参考方法，但在最近几年已经开发出了确定与CH结合的VLDL的同类方法。这些包括US6986998和US7208287的方法。
[0035]与IDL结合的CH(也被称为“VLDL残留物”或“类似残留物的颗粒”)通常用超速离心、高效液相或电泳来确定。最近开发出了两种同类方法(US7272047和US2007/0161068)即用特殊的表面活性剂来对与胆固醇结合的IDL进行选择性的酶解。
[0036]最近几年几个报道已经建议非HDL的测定比LDL的测定可以预防更多的心脏事件(vanDeventer et al Clin Chem(2011)57:490-501 ；Sniderman et al (2011)Circ Cardiovasc 0utcomes4:337-45)。特别是非HDL的测定比升高的TG水平更胜一筹(Sniderman et al (2010) J ClinLipidol4:152—5)。当前,非 HDL 不能直接通过任何先前已知的化验方法来测定，除了通过总CH和与HDL结合的胆固醇间的差异来计算(nonHDL =总的CH-HDL)。然而本发明允许直接或间接测定(计算)非HDL组分。在本发明的一个方面，至少被分析物中的一种与非HDL脂蛋白群组结合。特别的，非HDL胆固醇是非常优选的被分析物。非HDL胆固醇可以被测定，例如，连同总的TG和总的CH—起的脂质平板化验中。
[0037]为了筛选的目的，针对非HDL的直接化验更能减少化验时间和费用，相比运行两次化验，总CH和HDL，并计算差异的非HDL的测定(例10)。因此本发明的另一个部分，一个被分析物将被绑定到非HDL的脂蛋白(例如非HDL胆固醇)上，并被直接测定(即，不采取两个其他测定间的差异值)。这个被分析物可以用或不用其他任何被分析物来测定。此夕卜，非HDL(例如非-HDL的CH)直接测定的优势还延伸到化验终点的评估(即，这里所述的是虚构终点的计算)和常规技术的化验。因此本发明的另一方面，是提供了绑定到非HD脂蛋白的脂质组分的直接测定，例如非HD的胆固醇。对CVD的风险或倾向的相应方法通过这个值与相应阈值比较来提供，比如，来自健康个体总数的阈值和/或患有高风险或有CVD倾向的个体的阈值。
[0038]常规的用四步法酶反应来确定TG，四步法酶反应中，脂蛋白的脂肪酶分解TG为未酯化的甘油和游离的脂肪酸。甘油随后被磷酸化(甘油激酶)和氧化(甘油-3-磷酸氧化酶)为二羟基丙酮磷酸和过氧化氢，过氧化氢用来产生有色的，荧光或化学发光信号。
[0039]正如不同脂蛋白类型CH的测定一样，特殊脂蛋白种类TG的测定可以通过几种方法进行，这些方法利用不同脂蛋白种类的不同化学和物理特性。
[0040]如上所述的特殊脂蛋白类型中脂质组分的测定，如HDL中的胆固醇，对床边化验构成了特别的难题。当前的方法依赖暂时封闭脂蛋白，而不是特异的脂蛋白组中的特定脂质组分，然后测定与特殊脂蛋白种类结合的特定脂质组分。通过使用合成聚合物和聚合阴离子(US5773304, US6811994)或抗体(US4828986, US6162607)或与饰过的聚乙二醇酶修结合的环糊精(US5691159)，或用特异的表面活性剂(US7208287，US7272047)来封闭不想要的脂蛋白。
[0041]因为封闭是暂时的，这些反应的真实终点将不可能测量，唯一真实的终点是在所有4种脂蛋白组中特定脂质组分的终点。因此，特定脂蛋白的特定脂质组分被测定要么在一个固定时间点，这样的选择是因为在脂蛋白，而不是特定的脂蛋白，中的特定脂质组分不会实质干扰(通常5分钟)，或在反应的第一分钟期间的动力学干扰。在两种情况下都需要完全稳定的试剂，如干试剂，或含有校准剂，来补偿长期的试剂衰退。
[0042]一个不同的途径来选择性地消除与脂蛋白结合，而不是被分析的特异脂蛋白，结合的特定脂质组分，从而在酶反应中不产生可检测产物。然后特异蛋白组中的特定脂质组分被转变为可检测的产物。已描述的几种这样的方法利用与特异脂蛋白种类选择性反应的表面活性剂(EPl 164376，US5925534, US6194164, US6818414, US6893832)。
[0043]然而为了实现完全消除，反应必须使其达到终点，这就需要时间。这所需的时间对床边化验来说太长，尤其对测定很多被分析物的床边化验来讲，(被称为“仪表板”化验)。另外，这些途径具有不精准的问题，不精准是由于脂蛋白中不同于被分析的特殊脂蛋白的特定脂质组分的不完全消除引起的，或由于在特殊脂蛋白中特定脂质组分的非特异性的消除引起的。实际上，这些化验类型也需要定点测定和依赖完全稳定的试剂如干试剂，或包括校准剂，来补充长期试剂衰退。
[0044]鉴于上述观点，显然需要对测定一种或多种血浆组分(如脂质组分)的床边化验进行改进，尤其对那些包括特殊脂蛋白种类中的脂质组分的化验。如果允许使用流体试剂，不需要校准剂和/或总化验时间短，这样的化验将会有优势。
[0045]现在
【发明者】已经确定，建立这样的化验方法是可能的，该方法适合用包含细胞的血液样品(例如全血)的床边器械，可以利用流体试剂，具有简短的总化验时间，并且不需要校准剂。
[0046]
【发明者】惊奇地发现对于理论上终点不可达到和/或实际是不可检测的酶反应，确定终点是可能的。这允许终点分析的很多优点可以在以前一些没有考虑过终点的情况下实现。例如，在一个包括几个酶的顺次反应中，产物将被消耗完然后终点却不能达到。同样，在这些情况中终点不能直接测定，例如在连续酶反应中，在之前的反应达到终点前，下一个步骤开始了，或在平行酶反应中，在早期反应的进程中具有巨大的差异。
[0047]在不能有终点或终点不能被测定的状况下，也可以使用适当的算法计算，例如使用精确和与直接测定的类似CV来计算，而不是直接测量。所需要的是有足够长的时间以进行反应的监测，然后使用合适的算法来精确地预测终点。在本领域合适的算法和方程经常被用于曲线拟合(curve-fitting)的目的，而且他们也是是被众所周知的，但，先前没有用这种方式来预测不能测量的终点。一般，直到目的被分析物至少50 %已经转化，反应才被监测，尽管这可能仅构成进程中曲线的一小部分片段。监测反应，在各个实施例中被消耗的任意革G被分析物被消耗直到至少40%,优选至少50%,大约为至少60%。
[0048]在一个实施例中，选择测定间隔是更优选的，那样任何平行反应(例如任何非封闭的和任何封闭的组分的反应)都是不重要的。
[0049]在一个可选择的实施例中，平行反应，例如任何非封闭和任何封闭组分的反应，可以进行到一个可检测的程度，这种平行反应的影响可能在一定程度上对测定后分析进行校正，当样品中超过一个被分析物被测定时。例如当多个脂质被分析物测定时，例如在脂质仪表板化验，非HDL对HDL测定的干扰(例如通过部分非HDL和非HDL组分的反应)可以在重复过程中被部分校正，包括根据总胆固醇=HDL+非HDL，来获得HDL、总胆固醇的结果；并且用来评估非HDL对HDL分析的影响的一个预测的标准曲线也被使用(实施例子6)。
[0050]
【发明者】也发现对于可测定终点的反应使用本发明的估计的终点可以给予使用流体试剂的床边化验实质性的优势。终点测定必须考虑储藏试剂对试剂活性丢失造成化验时间的影响，用估计终点可以避免这个影响并且因而允许缩短所用的测定时间。
【发明内容】
[0051]因此在本发明的第一方面，提供了用于测定包含细胞的血液样品的血浆部分中的至少一种被分析物浓度的酶方法，其中，在样品中含有第一组分和第二组分，如果存在所述的第二组分并且未被封闭，所述的第二组分干扰所述第一组分的测定，所述方法包括如下步骤:
[0052]i)让所述包含血细胞的血液样品与稀释样品的试剂混合物接触；
[0053]ii)实质去除血细胞来提供基本无细胞的样品；
[0054]iii)所述样品与至少一种试剂接触，该试剂暂时和/或竞争性防止所述第二组分的反应，借此来产生被封闭的第二组分；
[0055]iv)让所述样品与至少一种试剂混合物接触，该试剂混合物包括至少一种转化酶来转化所述至少一种被分析物的每一种被分析物的至少一个组分，从而导致被分析物或每一种被分析物的选择性反应，来直接或间接产生可检测反应产物，其中所述的该被分析物或被分析物中的一种是所述的第一组分；
[0056]V)监测所述可检测的反应产物或多种产物；
[0057]vi)让所述可检测产物或多个产物的数量和/或所述可检测产物或多个产物的形成速率与所述血液样品中至少一个被分析物或每一个被分析物浓度进行关联，其中，使用不可测定(虚构的)终点的评估，让至少所述第一组分的浓度与相应的可检测反应产物关联；
[0058]其中，步骤iii)可以在一直到步骤iv)并且包括步骤iv)中的任何阶段被执行，但应在步骤V)到Vi)之前，其中，步骤iii)的试剂可以被单独用于样品或可以被包括在步骤i)或iv)的试剂混合物中。
[0059]在一个优选的实施例子中，本发明对很多被分析进行同时(如同时)测定，例如对所含细胞的样品中的2个，3个或更多被分析物。
[0060]本发明的所有部分中，表明了可检测“产物”的检测，这也清楚的允许可检测反应物或开始物质的检测，环境允许的话。在多数情况下只需要做改变是反应物或开始物质将会被消耗，因此浓度将会减少。因为产物和起始原料一般是已知的化学计量关系，因此反应物的减少是一个间接检测产物的方法。所有适宜产物的检测可以通过观察已知或多种反应物消耗的手段来执行。
[0061]在本发明的另一方面，额外提供了一个试剂盒用于确定含细胞血样的血浆中至少三种不同被分析物的浓度，其中，样品包含第一组分和第二组分，如果存在的所述第二组分并未被封闭，所述第二组分干扰所述第一组分的测定，所述试剂盒包括:
[0062]a)用来稀释所述样品的第一种试剂混合物；
[0063]b)分离细胞的单元；
[0064]c)用来暂时和/或竞争性的来防止述第二组分的反应(封闭)的第二种试剂，借此产生被封闭的第二组分；
[0065]d)至少3种另外的试剂混合物来造成所述的至少3种不同被分析物的选择性转化，借此产生对应于每一种被分析物的可检测的间接产物。
[0066]详细描述
[0067]本发明提供了一种化验方法，提供了对含细胞血样中的至少一种被分析物的浓度进行测定的方法。
[0068]这里所用的术语“被分析物”用来说明用于测定的一种组分或多种组分的组合。因此被分析物可以是单个组分，例如HDL胆固醇，或可以是一系列组分。一般这样的一系列组分将具有共同的特性，例如一系列胆固醇都包含脂蛋白。
[0069]在本发明中使用的最优选的被分析物是脂质组分，该组分是指在样品血浆中特定类型的脂质(如TG或CH)，或存在于特定脂蛋白中或者或存在一系列特定的脂蛋白(如non-HDL CH)的那部分特定类型的脂质(如HDL CH)的数量。
[0070]终点评估在单个组分化验中是有用的，而该组分(如，HDL脂质成分的转换)中特定成分的转换的终点可以通过这里描述的方法被评估。然而，该技术在多种被分析物的平行化验(常被称为“仪表板化验”)中也是有很高的价值。这尤其可以在床边应用。在这种情况下，2个，3个，4个，5个或更多的被分析物可以在化验中被测定。而且，仪器能够从测定数据来计算其他被分析物的水平，因此可比直接测定(见本文对实例的讨论)的被分析物质具有更多被分析物质的浓度做出报告。在本发明的仪表板化验的实例中，优选的是三个被分析物的测定。
[0071]至少两种被分析物(如至少三种)被测定，终点评估方法将被用于一种或多种这样的被分析物的分析。当至少一种被分析物是第一组分，在没有封闭另一种组分时，该第一组分不能轻易的/可靠的被测定，因此这个第一组分将通过不可测量(虚拟的)终点评估的方法来进行分析。为了减少总化验所需的时间，结合这个法，需要用终点方法测定的其他组分也可以通过终点评估被测定。因此在一个实施例中，所有被分析物通过终点评估方法测定，其中至少一种被分析物通过不可测量(虚拟)终点的评估被测定。
[0072]如上所述，优选的被分析物是血样中的脂质组分。因此典型的被分析物为全部和/或与特异脂蛋白结合的胆固醇，甘油三酯或磷脂，该这些特异脂蛋白来自由VLDL，IDL, LDL和HDL组成。与脂蛋白群组结合的胆固醇，甘油三酯和/或磷脂(例如非-HDL CH)也可以被测定并进一步形成优选的被分析物。
[0073]这里指的“第一组分”一般是与特定脂蛋白(或脂蛋白组)结合的特定脂质，例如HDL_CH或非-HDL-CH。因此一般所述的第一组分是具有脂质组分的一种被分析物，该脂质组分可以是与脂蛋白结合的胆固醇，甘油三酯或磷脂，这些脂质组分与至少一种脂蛋白组结合，这些脂蛋白可以是VLDL，IDL, LDL和HDL，例如与HDL结合的胆固醇。
[0074]本文提到的在“第二组分”和测量的“第一组分”之间干扰通常是由于需要从第二组分中的脂质成分的反应区分出第一组分中脂质成分的反应。因此，一般第一和第二组分将包括相同的脂质组分(多种脂质组分)。在典型事例中，在存在非HDL-CH(第二组分)时，想要测定HDL-CH(第一组分，被分析物)。但没有“封闭”第二组分时，这通常不容易做至IJ，因为两者的脂质组分都是CH，因此如果两种都被允许反应，那么这是不可能把它们进行区分。在这样的情况下第二组分只有被“封闭”，仅第一组分或第一组分首先用于反应。
[0075]通过有很多方法让这些组分(特别是这里所述的“第二组分”)被“封闭”。这里所讨论过的很多和其他方法是本领域技术人员熟知的。如果这样的封闭是或可以被制作成永久性的(如通过一些共价结合来封闭基团)，那么终点评估就不需要了(虽然这仍可以是一个优点来加速化验方法)。然而当前知道的技术和/或广泛使用的技术都是“暂时”封闭方法，就是说导致第二组分被完全或大部分失活但可以重新获得这种活性，无论是独立的还是存在酶转换试剂和/或这里所述过程的步骤iv)中采用的表面活性剂的情况下。这里所用的作为“暂时”地防止组分反应的试剂将在适当条件下防止组分在起有效反应至少60秒，优选的至少240秒，最优选的至少360秒。有效反应指反应超过10%，优选的超过5%，最优选的反应是超过该组分的任何成分(如脂质部分)的3%。
[0076]相应的，当“封闭”的组分被置于反应条件时，例如这里任何实施例中所述的条件(步骤iv)，脂质成分的反应将不会发生超过10 %，优选的是5 %，更优选的是3 %，这种不发生反应持续的时间为至少60秒，更优秀的是至少240秒，更有许多至少360秒。
[0077]在优选的实施例中，选择步骤i)，ii)和/或iii)的条件下，那样血样中的细胞保持完整，或在步骤过程中，基本完整的细胞遭(如少于10%的细胞，优选的少于5%，最优选的少于3% (如0.1?3% )受到溶解。在这方面离子强度和表面活性剂的类型/浓度是特别重要的因素。
[0078]如US6818414中所述的反应加速器可以任意包括在试剂溶液中，尤其是在步骤
iv)来增加反应速率并减少化验时间。
[0079]本发明和其他方面涉及至少一种被分析物的测定。这些被分析物一般是脂质被分析物，并且每种各自可以是某种脂质组分，例如甘油三酯，胆固醇等，或可以是与一种特殊脂蛋白或一组特殊脂蛋白结合的脂质组分的总数。这些非遗漏的样品包括与任何脂蛋白VLDL, IDL, LDL和HDL的所有组合的胆固醇，甘油三酯或磷脂，以及与这个脂蛋白不结合的每一个总脂质组分的相应部分。因此，例如，被分析物包括HDL胆固醇和非HDL胆固醇，后者是不受HDL脂蛋白束缚的部分总胆固醇。特别优选的被分析物包括总的TG，总的CH，非HDL, LDL,低密度LDL, HDL胆固醇。
[0080]为了测定与特殊脂蛋白结合的某种脂质组分的部分，有必要“封闭”或使那种组分或所有具有相同脂质组分的其他脂蛋白失活。这允许一种组分在存在另一种一般会干扰的组分的情况下测定。
[0081]虽然这个封闭本身是已知的，并且接下去会描述很多这样的例子，实现封闭的已知方法不能造成永久的封闭或不能永久的控制脂质组分。不如说，一段时间后和/或如果样品中其他地方的脂质组分的浓度下降太低，那么封闭将开始失效并且脂质组分将变的有活性。因此在这样的情况下，反应消耗相同的脂质组分，而封闭的组分由这种脂质组分组成，反应就不能运行到它的终点，因为在终点到达前封闭已经变的失效了。这样的终点事实上从来不能达到。
[0082]鉴于上面所述，在本领域中已经假定这类终点测定不能被用来封闭这种类型的脂质组分，因为终点是“不可测定的”。这导致在这样的化验中需要用校准剂或更多常用的干试剂，这便具有了这些校准剂和干试剂的所有缺点(本领域公知的，在本文已有描述)。
[0083]然而，本
【发明者】现在确认终点评估技术能有效的被运用于这些不可测定终点，那样，不能达到或不可测定(“虚构的”)终点仍能被计算，即使它实际上从来不会达到。
[0084]对于特殊脂质种类或脂蛋白的特殊种类的选择性反应，脂蛋白的脂质组分转化为可检测的二级被分析物，在本领域中有很多方法是公知的，并且这些方法中的任何一种都适用于本发明。上述的所有同类方法都是适宜的并被包括在本发明的范围内。下面提供进一步的细节并引用在参考文献中。
[0085]当前有2种方法常用于CH定量。这两种方法都是酶促反应并适用于本发明的方法。在第一种方法中，胆固醇酯酶转化胆固醇脂类为CH。然后胆固醇氧化酶转化CH为胆固醇-4-烯-3-酮和二氧化氢。最后过氧化物酶用形成的过氧化氢在存在苯酚的情况下，转化4-氨基安替比林产生有色的醌亚胺化合物。醌亚胺用光度测定法在500-600纳米波长下被测定。其他公知的产生颜色的底物(如TMB的产物是蓝色的，在650纳米被测定)或荧光或化学发光底物可以用4-氨基安替比林/苯酚替代。
[0086]其他方法用胆固醇氧化酶替代胆固醇脱氢酶，并且根据产生的NADH或NADPH的数量来确定样品中CH的数量。
[0087]至于TG的检测，常规用4步酶促反应确定，在酶促反应中脂蛋白脂肪酶水解TG为未酯化的甘油和游离脂肪酸。接着甘油被甘油激酶磷酸化，被甘油-3-磷酸盐氧化酶氧化为二羟基丙酮磷酸和过氧化氢。在最后的颜色形成步骤中，过氧化氢酶用形成的过氧化氢在苯酚的存在下转化4-氨基安替比林为有色的醌亚胺。醌亚胺在500纳米波长用分光光度计测定。通过选择适当的底物和苯酚，形成的有色产物可以在波长450-850纳米下被测定。同样的荧光或化学发光底物可以用4-氨基安替比林替代。显然，在两种基于过氧化氢的方法的最后的步骤是等同和可以互换的。
[0088].因此，优选用上述的酶系统来转化特殊血浆脂质组分为可检测化学产物的酶促反应。
[0089]CH:对于 CH:
[0090](i)胆固醇酯酶+胆固醇氧化酶+过氧化物酶，或
[0091](ii)胆固醇酯酶+胆固醇脱氢酶。
[0092]TG:对于 TG:
[0093]酯酶+甘油激酶+甘油-3-磷酸氧化酶+过氧化物酶。
[0094]对于酶，市售的酶来自可以利用的动物，微生物组织或植物。特定来源的酶可能对某种脂蛋白种类表现出选择性，例如优先与脂蛋白种类VLDL反应的来自色素杆菌属((Chromobacterium viscosum)或假单胞菌(Pseudomonas)的脂蛋白酯酶和胆固醇酯酶。这样的酶可以被用来化验特定组分，无论独立的(使用)还是与这里选定的其他方法结合(使用)。为了改变它们的特异性和稳定性，酶可以被化学修饰，如胆固醇氧化酶和胆固醇酯酶与PEG轭合，为了减少酶与CH有关LDL的反应活性(US5807696)。酶的使用浓度一般为100-100000个单位/毫升。
[0095]特定脂蛋白种类的脂质组分的测定可以通过几种方法进行，这些方法利用不同脂蛋白种类的不同化学和物理性状。总之，这些方法依赖酶的特异性，和/或在分离、转化或致使可能干扰的其他组分钝化后，允许想要的组分起反应。非离子，阴离子，阳离子和两性离子的表面活性剂可能被包括，为了增加酶促反应的选择性或增加反应速率。任何适合的表面活性剂可以被运用，这样表面活性剂可以在反应过程中保持细胞的完整状态。对细胞状态特别重要的非离子表面活性剂的一个属性，是亲水-亲酯平衡(HLB)。HLB值低于10高于13的表面活性剂特别适合在存在的完整细胞时使用。然而HLB值在10-13间的表面活性剂对完整细胞的亲和性要依赖使用的浓度，并依赖化验的构成和形式，例如反应时间和使用的温度，离子力，PH和化验混合物中盐的类型，稳定底物的存在例如血浆白蛋白。适宜表面活性剂的实例是聚氧乙烯烷基醚(Brij35和78)，聚氧乙烯烷基芳基醚(Triton X45和X305，Ig印al210和272)，聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸单月桂酸酯(吐温80)，聚氧乙烯-共氧化丙烯封闭共聚物(聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物(聚醚)(Pluronic) F68和L64)，具有聚乙二醇的端粒B单醚(ZonylFSNlOO)，乙二胺碱性草酸盐封闭共聚物(ethylenediamine alkoxalate block copolymer) (Tetronicl307),2，4，7，9-四甲基-5-癸炔-4，7- 二醇的乙氧基化物(SURF0NYL465和485)，聚二甲基硅氧烧(methylethoxylate) (Silwet L7600),聚乙氧基化油醇(RH0DASURF 0N-870),聚乙氧基化蓖麻油(Cremophor EL),对-异壬基苯-聚(缩水甘油)(表面活性剂10G)和聚醚砜(Triton X200)。这个用途的表面活性剂的浓度一般是0.001到10 %，优选的是0.01到1%。
[0096]接下去的方法为适合所述的特定脂质组分选择性反应的方法。在所有实例中，已公布的参考物质被完整引用在参考文献中。[0097]测定与CH部分结合的HDL的同类方法中，非HDL颗粒通过不同方法被封闭反应，致使其难以接近CH代谢酶。最新开发是选择性溶解HDL的特异表面活性剂，这些表面活性剂包括:
[0098](i)在PEG/环糊精方法(US5691159)中，硫酸化α -环糊精在存在Mg2+的情况下和非HDL形成可溶性混合物，该非HDL在PEG修饰酶(的作用下)从难溶变到分解。
[0099](ii)聚阴离子方法(US5773304)利用合成多聚物连同一个聚阴离子，或一个表面活性剂(US7851174)来封闭非HDL，并用特殊的去垢剂使他们从难溶变为溶解并进行酶测定。
[0100](iii)免疫方法(US6162607)利用载脂蛋白在所有非HDL中存在，在HDL中不存在。载脂蛋白BapoB的抗体封闭非HDL来与胆固醇酶反应。
[0101](iv)在清除方法(US6479249)中非HDL最先在反应中被消耗不产生颜色。接着加入特殊的去垢剂，使酶与反应中的HDL反应来产生颜色。
[0102](V)加速物/去垢剂方法(US6818414)利用加速物来加速反应来降解非HDL的未酯化胆固醇，并移除过程中形成的不产生颜色的H202。第二步在颜色形成过程中胆固醇被HDL特异去垢剂降解。
[0103]这些方法中的任意一种，无论单独的或是相互结合，都可以被用于在本发明的方法中与CH结合的HDL的测定。通过同类的方法，与CH结合的LDL已被测定，该方法不需要物理分离非LDL脂蛋白来测定LDL CH部分。这样的方法包括:
[0104](i)US5888827描述了一种方法，有Mg2+的存在下非LDL被表面活性剂和环糊精掩饰，通过PEG修饰的酶非LDL从难溶变为分解。
[0105](ii)US5925534描述的方法中用聚阴离子和表面活性剂来保护样品中的LDL，并允许非LDL被酶解去除，因此添加去保护剂使得酶促测定与CH结合的LDL。
[0106](^丨)”6057118和”6194164描述了两种不同的方法，在确定与01相关0^前的酶促反应中利用特殊的表面活性剂选择性去除与CH结合的非LDL。
[0107]最近些年确定与CH相关VLDL的同类方法已经被开发，这些方法包括:
[0108](i)US6986998描述了一种方法，用白蛋白和环芳烃分别封闭HDL和LDL，用来自色素杆菌属(Chromobacterium viscosum)的VLDL选择性酶,在一个酶促反应中使VLDL选择性分解。
[0109](ii)US7208287描述了一种方法，在酶促反应中利用特异的表面活性剂来选择性分解VLDL
[0110]与IDL结合的胆固醇(也被称为“VLDL残留物”或“类似残留物颗粒”)通常用超速离心，高效液相色谱或电泳确定。最近开发出两种同类方法(US7272047和US2007/0161068)，能用特异的表面活性剂来进一步选择性酶解与胆固醇结合的IDL。这些方法中的任意一种，无论单独的还是组合的都可以在本发明的方法中用于测定与CH结合的 LDL。
[0111]特定脂蛋白种类TG的测定可以通过利用这些不同脂蛋白种类的不同化学和物理性状来执行。因此这 些方法与那些上面描述的用于胆固醇的方法是类似的，但要利用TG的酶检测,例如通过上述的那些方法。这些方法包括:
[0112](i)US6811994描述了利用选择性表面活性剂和聚乙二醇修饰酶来封闭不同于特定脂蛋白的脂蛋白。
[0113](ii)W02004/087945和US2009/0226944描述了在不产生可检测产物的反应中，利用选择性表面活性剂从非LDL中移除TG，然后转化与LDL结合的TG为可检测产物。
[0114](iii)W02000/06112描述了在不产生可检测产物的反应中用选择性表面活性剂从不同于VLDL和/或IDL的脂蛋白中移除TG，然后转化与VLDL和/或IDL结合的TG为可检测产物。
[0115]在本发明的方法中这些方法中的任意一种,无论单独的还是组合的都可以用于与特定脂蛋白结合的TG的测定。
[0116]本发明的化验方法中使用的检测方法一般是光学测定，一般选择间接产物，那样就可以是光度学上可检测的(如，通过在一个或多个预识别的波长上它的吸收，荧光或化学发光值)。
[0117]产生信号的非常优秀的方法是通过过氧化氢，其作为产生有色底物的酶氧化反应的一种底物。产生颜色的氧化试剂或多种氧化试剂与形成的过氧化氢反应来产生可检测的化学产物，这些试剂可以是本领域已知的任何分子，这些氧化产物可以通过紫外光，可见光，或红外光分光光度计或通过荧光或冷光来测定。
[0118]适宜的显色试剂的实例是特林德(特林德(Trinder))试剂，其在H2O2存在情况下与耦合剂反应来形成有色产物。耦合剂的优选实例是4-氨基安替比林(4AA)，3-甲基-2-苯并噻唑腙(MBTH)，N-甲基-N-苯基-4-氨基苯胺(NCP-04)，N-甲基-N-(3-甲基苯基)-4-氨基苯胺(NCP-05)，N-甲基-N- (3-甲氧基苯基)-4-氨基苯胺(NCP-06)，N-甲基-N-(3-甲氧基苯基)-3-甲氧基-4-氨基苯胺(NCP-07)。特林德(Trinder)试剂的更优选的实例是那些试剂，其形成的产物能在600纳米或超过600纳米的波长下比色确定:N-乙基-N- (2-轻基-3-横丙基)-3, 5 -碳酸二甲酷聚苯胺(N-Ethyl-N- (2-hydroxy-3_sulfopropyl) -3, 5-dimethyloxyaniline) (DAOS)，N-乙基-N- (2-轻基-3-石黄丙基)-3, 5- 二甲氧基-4-氟苯胺(FDAOS)，N- (2-羟基-3-磺丙基)-3，5- 二甲氧基苯胺(HDAOS)，N，N-双(4-磺丁基)-3，5- 二甲基苯胺(MADB)，N-乙基-N- (2-羟基-3-磺丙基)-3，5- 二甲基苯胺(MAOS)。更优选的实例中不是特林德(Trinder)试剂，是3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺(TMB)，N-(3-磺丙基)-3,3’，5，5’-四甲基联苯胺(TMBZ-PS)，N，N-双(2-羟基3-磺丙基)联甲苯胺(SAT蓝)，N-(羧甲基氨基羰基)-4，4-双(二甲氨基)_联苯胺(DA64)，10-(羧甲基)-3，7-双(二甲氨基)_吩噻嗪(phenotiazine) (DA67)。发色体的浓度优选的是0.01-10克/升，受溶解度的限制。
[0119]适宜的荧光底物实例是二氢钙黄绿素(dihydro calceins), 二氢乙啡唳(dihydroethidium), 二氢突光素(dihydrofIuoresceins)，二氢吩卩惡嗪(dihydrophenoxazine) (Amplex红；10-乙酰基-3，7_ 二轻基吩噻嗪)，和二氢若丹明(dihydrorhodamines)。
[0120]适宜的化学发光底物的实例是发光氨(3-氨基苯并菲复合物)，陆明PS-2 (Lumigen PS-2)和陆明 PS-atto (Lumigen PS-atto)。
[0121]非离子，阴离子，阳离子和两性离子表面活性剂可以在测定有色的间接被分析物前被用于细胞溶解。任何适宜的表面活性剂可以被使用而不影响测定，一般浓度在
0.01-10%间，但优选的是在0.1-2%间。[0122] 适宜的表面活性剂的实例是阴离子表面活性剂是异丙胺烷基苯磺酸盐(Ninate411)，琥珀酸二辛酯钠(Aerosol 0T)，钠 N-油-N-甲基(GER0P0N T-77)，钠烯基磺酸盐(Bioterge AS-40),聚氧乙烯月桂基硫酸钠(Standapol ES_1)和非离子表面活性剂聚氧乙烯烷基芳基醚(TritonXlOO和Xl 14)和聚氧乙烯月桂醇(Chemal LA-9)。
[0123]当细胞溶解发生时，明显会有血色素和其他细胞产物释放到反应介质中。为了让裂解中获得最大的优势，并尽可能的减少背景信号，因此在这样的情况下优选的是选自一种产物(二级被分析物)，该产物的测定不会被这些释放的产物抑制。二级被分析物在超过450纳米波长是可检测的，优选的超过500纳米，细胞裂解被使用时，更优选的是600纳米或更高(如500至1400纳米或600至1200纳米)。
[0124]样品中血细胞的物理分离可以通过任何适宜方法来执行，包括所有细胞流经特殊的粘合剂，但最常用的是过滤。过滤去除细胞需要注意一下反应步骤(i)原始血样的过滤具有非常大的好处。尤其，指尖刺的小量采血就可以开展反应步骤。加入一种或多种试剂后，反应混合物的体积变的更大，在没有重要的死(细胞)体积时进行细胞分离。细胞被更多的稀释，由此过滤后的细胞将更均匀的分散在过滤器表面，过滤变的更有效。
[0125]因此这里所述的过滤是在本发明方法中步骤ii)中使用的优选技术，并且相应的过滤器等适用于本发明提供的试剂盒。这种过滤的优选实例提供如下，任意一种可以单独应用或与本发明的方法和试剂盒组合使用。
[0126]过滤中，样品穿过一个有小孔的多孔界面(过滤器，膜或筛子)，其中细胞被捕获。有孔界面可以是固体(如烧结的玻璃(sintered glass)或纤维(如由纤维素或玻璃制成)，可以是横向或侧向通过。样品可以通过重力、离心机，毛细管力，压力或抽吸透过过滤器。过滤材料可以额外包含能捕获血细胞的试剂(如凝集素，抗体)。其他方法用静电引力。适用于横向过滤的材料如表2所述。适合侧向流过滤的材料是哈马斯?L (Hemasep?L)(Pall Corp)和 LFl 和 MFl 华斯曼(Whatman).[0127]表2.脂质和有色产物的过滤回收
【权利要求】
1.测量含有血细胞样品的部分血浆中至少一个被分析物的酶方法，其中，该样品包括第一组分和第二组分，如果第二组分存在并且未被封闭，第二组分则会干扰第一组分的测量，所述的方法包括如下步骤: i)让含有血细胞的样品与稀释样品的试剂混合物接触； ii)实质去除血细胞从而提供实质不含血细胞的样品； iii)让样品与至少一种试剂接触，该试剂暂时阻止第二组分的反应，从而产生被封闭的第二组分； iv)让样品与至少一种试剂混合物接触,该混合物包括对于所述至少一种被分析物的每个被分析物的至少一个成分的至少一种转换酶，从而对所述的或每个被分析物的成分进行选择性地反应来直接或间接产生可检测的反应产物，其中所述的该或者一个被分析物为所述的第一种组分； V)监测所述可检测的反应产物或多个产物； vi)把所述的可检测的产物或多个产物的量和/或形成所述的可检测的产物或多个产物的速率与所述的或每一个血液样品中的至少一个被分析物的浓度进行关联；其中，通过估计的不可测量(虚构的)的终点把至少一种所述的第一组分的浓度与相应的可被检测的广物进行关联； 其中，步骤iii)可以在包括步骤iv)的任何阶段中进行，但是在步骤V)或Vi)前进行， 和， 其中，步骤iii)中的试剂可以单独施加在样品中或被包含在步骤i)或iv)中的至少一种试剂混合物中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的第一组分和第二组分是具有共同脂质组分但具有不同蛋白组分的脂蛋白组分。
3.根据前述任何权利要求的方法，其中，所述的至少一种成分的转换酶为至少一种被分析物的脂质成分的转换酶，例如作为胆固醇、甘油三酯或磷脂的转换酶。
4.根据前述任何权利要求的方法，其中，所述的至少一种被分析物来自总的和/或与VLDL, IDL, LDL, HDL和非-HDL脂蛋白结合的胆固醇、甘油三酯或磷脂。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述第一种组分为具有脂质成分的一个被分析物，该脂质成分来自于与VLDL，IDL, LDL, HDL和非-HDL结合的至少一个脂蛋白成分的胆固醇、甘油三酯或磷脂，例如与HDL结合的胆固醇。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述的第一组分为非-HDL的胆固醇。
7.根据前述任意权利要求所述的方法，其中，包含血细胞的样品为全血样品。
8.根据前述任意权利要求所述的方法，其中，步骤i)和iii)在步骤ii)之前进行。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，步骤i)和iii)同时进行。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述的步骤i)中的稀释样品的试剂混合物包括能够暂时阻止步骤iii)中的第二组分反应的所述的至少一种试剂。
11.根据前述任意权利要求所述的方法，包括测量含有血细胞样品的部分血浆中至少三个被分析物的酶方法，其中，该样品包括第一组分和第二组分，如果第二组分存在并且未被封闭，第二组分则会干扰第一组分的测量，所述的方法包括如下步骤: i)让含有血细胞的样品与稀释样品的试剂混合物接触；ii)实质去除血细胞从而提供实质不含血细胞的样品； iii)让样品与至少一种试剂接触，该试剂暂时阻止第二组分的反应，从而产生被封闭的第二组分； iv)把无细胞的样品分成至少三个部分，并且让每一个部分与至少三种试剂混合物中的一种接触，所述的试剂混合物包括脂质转移酶，从而导致所述的至少三个不同被分析物的每一个的可选择性的反应(直接或间接的)来产生各自的可被检测的产物，其中，其中一个被分析物为所述的第一组分； V)监测所述的可被检测的多个反应产物； vi)把所述的可检测的多个产物的量和/或形成(或消耗)所述的可检测的多个产物的速率与所述的血液样品中的至少三个被分析物的浓度进行关联；其中，通过估计的不可测量(虚构的)的终点把至少一种所述的第一组分的浓度与相应的可被检测的产物进行关联； 其中，步骤iii)可以在直到步骤iv)和包括步骤iv)中的任何阶段进行，但是在步骤V)或Vi)前进行，和其中，步骤iii)中的试剂可以单独地施加在样品中或被包含在步骤i)或iv)中的至少一种试剂的混合物中。
12.根据前述任意权利要 求所述的方法，其中，该方法包括测量脂质成分，该脂质组分包括在含有血细胞样品的血浆部分中与至少一种特异的脂蛋白结合的胆固醇作为第一种组分和第一种被分析物的浓度，作为第二种被分析的总胆固醇的浓度，和作为第三中被分析物的总的甘油三酯的浓度。
13.根据权利要求12所述的方法，其中步骤iv)包括:让所述的无血细胞的样品或部分样品与包括脂质转换酶的至少一种试剂的混合物接触，其中，所述的至少一种试剂混合物在被封闭的第二组分存在下与一种特异的脂蛋白或特异的脂蛋白组，例如HDL或非-HDL，结合的胆固醇的至少部分进行选择性的反应。
14.根据权利要求12或13所述的方法，其中步骤iv)包括: 让所述的第一部分的无血细胞的样品与包括脂质转换酶的至少一种试剂的混合物接触，其中，所述的至少一种试剂混合物在被封闭的第二组分存在下与一种特异的脂蛋白或特异的脂蛋白组，例如HDL或非-HDL，结合的胆固醇的至少部分进行选择性的反应； 让所述的第二部分的无血细胞的样品与包括脂质转换酶的至少一种试剂的混合物接触，其中，所述的至少一种试剂的混合物与第二部分的总胆固醇反应；和 让所述的第三部分的无血细胞的样品与包括脂质转换酶的至少一种试剂的混合物接触，其中，所述的至少一种试剂的混合物与第二部分的甘油三酯反应； 和同时产生每个第一组分相应的被分析物(例如HDL胆固醇)，总胆固醇和总甘油三酯的可检测的反应产物。
15.根据前述任意权利要求所述的方法，其中，所述的第一组分为具有脂质成分(例如胆固醇)和蛋白成分的脂蛋白；和，所述的第二组分包括与除第一组分中的蛋白成分之外的另外的蛋白结合的相同的脂质成分。
16.根据前述任意权利要求所述的方法，其中，在步骤iii)中存在或产生封闭的第二组分不会干扰步骤iv)中的任何被分析物或被分析物成分的反应。
17.根据前述任意权利要求所述的方法，其中，所述的可被检测的产物为可被检测的光学物质。
18.根据前述任意权利要求所述的方法，其中，所述的稀释血液样本的稀释缓冲液至少为10倍的稀释缓冲液。
19.根据前述任意权利要求所述的方法，其中，所述的实质不含细胞的样品包括少于5%的血细胞。
20.根据前述任意权利要求所述的方法，其中，步骤ii)执行过滤步骤。
21.根据前述任意权利要求所述的方法，其中，步骤ii)在没有实质导致细胞溶解的情况下执行，例如导致细胞的溶解不会多于5%的血细胞。
22.根据前述任意权利要求所述的方法，其中，步骤ii)在没有实质影响血浆中脂质成分下执行，例如不超过5%的降低任何所述的成分。
23.根据前述任意权利要求所述的方法，其中，所述的用于暂时阻止所述第二成分反应的至少一种试剂包括特异结合位于第一组分上的第二组分的抗体。
24.根据前述任意权利要求所述的方法，其中，所述的用于暂时阻止所述第二成分反应的至少一种试剂包括至少一种特异结合物质，例如至少一种抗体，该特异结合物质特异结合第二组分的脂蛋白成分。
25.根据前述任意权利要求所述的方法，其中，需要的血液不超过20μL。
26.根据前述任 意权利要求所述的方法，其中，一个合适的算法被用来确定所述至少第一种组分的不可测量的终点。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述的算法为第一顺序的速率方程或逻辑函数。
28.根据前述任意权利要求所述的方法，其中，因为所述被封闭的第二物质实际上或潜在的没有被封闭，所述的不可测量的终点不能被测量。
29.根据前述任意权利要求所述的多种被分析物的测量方法。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，通过估计的终点，每个被分析物的浓度与相对应的可被检测的产物的形成或消耗相关联，并且，其中至少一种终点是为不可测量(虚拟)的终点。
31.测量含有血细胞样品的血浆部分中至少三种被分析物的酶试剂盒,其中，该样品包括第一组分和第二组分，如果第二组分存在并且未被封闭，第二组分则会干扰第一组分的测量，所述的试剂盒包括: a)稀释所述样品的第一试剂 b)细胞分离单元 c)用于暂时和或竞争地阻止(封闭)第二组分的反应，从而产生被封闭的第二组分的第二试剂； d)至少三个另外的试剂混合物，该混合物选择性的转化所述的至少三种不同的被分析物，从而产生与每个被分析物对应的可被检测的间接产物。
32.根据权利要求31所述的试剂盒，其中，试剂c)被包括在试剂混合物a)中。
33.根据权利要求31或32所述的试剂盒，其中，所述的至少三种被分析物包括总的胆固醇，总的甘油三酯和与胆固醇结合的HDL。
【文档编号】C12Q1/60GK103946711SQ201280056696
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2012年11月9日 优先权日:2011年11月11日
【发明者】A·L·凡仁, F·泛泰森, A·K·诺德黑, E·孙德仁吉仁, L·奥林 申请人:安讯希特技术有限公司